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Neuroscience

Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador

doi: 10.3791/56647 Published: February 5, 2018

Summary

Este protocolo presenta un en vitro en vivo-proyección de imagen de fagocitosis ensayo para medir la capacidad fagocitaria de los astrocitos. Microglia y astrocitos de rata purificados se utilizan junto con sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Este método puede detectar cinética en tiempo real de la inmersión y la degradación y proporciona una plataforma de proyección adecuado para identificar factores de modulación de fagocitosis de los astrositos.

Abstract

Los astrocitos son las células principales en el cerebro y contacta directamente con las sinapsis y los vasos sanguíneos. Aunque las células microgliales se han considerado las principales células inmunes y solamente fagocitos en el cerebro, estudios recientes han demostrado que los astrocitos también participan en diversos procesos fagocíticos, tales como eliminación de sinapsis desarrollo y despacho de placas de beta amiloide en la enfermedad de Alzheimer (AD). A pesar de estos resultados, la eficiencia de la inmersión de astrositos y degradación de sus objetivos es confusos en comparación con la de microglia. Esta falta de información se debe principalmente a la falta de un sistema de ensayo en el que la cinética de fagocitosis mediada por astrositos y microglía son fácilmente comparables. Para lograr este objetivo, hemos desarrollado un a largo plazo vivir-proyección de imagen en vitro ensayo fagocitosis para evaluar la capacidad fagocitaria de purificada astrocitos y microglía. En este ensayo, detección en tiempo real de la inmersión y la degradación es posible usando sinaptosomas conjugado con indicador de pH, que emiten fluorescencia roja brillante en orgánulos ácidos, tales como lisosomas. Nuestro ensayo novela proporciona una detección simple y eficaz de la fagocitosis a través de imágenes en vivo. Además, este ensayo de fagocitosis en vitro puede utilizarse como una plataforma de proyección para identificar productos químicos y compuestos que pueden potenciar o inhibir la capacidad fagocitaria de los astrocitos. Como mal funcionamiento de la poda sináptica y acumulación de la proteína patógena han demostrado como causantes de trastornos mentales y enfermedades neurodegenerativas, productos químicos y compuestos que modulan la capacidad fagocitaria de las células gliales deberán ser útiles en el tratamiento de varios trastornos neurológicos.

Introduction

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Células gliales, que se refieren a las células no excitables en el cerebro, son el tipo de células principales en el sistema nervioso central (SNC). Anteriormente, las células glial fueron miradas como meras células de soporte que principalmente desempeñan un papel pasivo en el mantenimiento de propiedades sinápticas basals y la supervivencia neuronal. Sin embargo, nuevas pruebas ha revelado que las células gliales desempeñan un papel más activo en diversos aspectos de la neurobiología, como mantenimiento de la homeostasis cerebral, mediar la sinapsis formación1,2,3 y sinapsis eliminación4,5y modulando la plasticidad sináptica6,7. Las células gliales en el SNC son los astrocitos, microglia y oligodendrocitos. Entre estas células, los astrocitos y microglia han demostrado que desempeñan funciones fagocíticas por englobamiento sinapsis4,5, de células apoptotic8, desechos neuronales9y proteínas patógenas, tales como beta amiloide placas10,11. En el cerebro en desarrollo, los astrocitos eliminan sinapsis en el núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) a través de fagocitosis dependiente del MERTK y MEGF104. Del mismo modo, microglia también eliminan sinapsis C1q cubierto durante etapas de desarrollo a través de la cascada de complemento clásico5. Curiosamente, se ha sugerido que defectos en la poda de la sinapsis pueden ser uno de los iniciadores de varios desordenes neurológicos. Por ejemplo, se ha demostrado que las mutaciones en componente del complemento 4 (C4), que aumenta la poda de la sinapsis mediada por el complemento por microglía, son fuertemente asociadas con la prevalencia de la esquizofrenia en los seres humanos12. Un trabajo reciente también ha demostrado que la vía clásica del complemento es ligerament en las etapas de iniciación de AD e induce pérdida de sinapsis temprana de esta enfermedad13.

En comparación con la fagocitosis mediada por la microglía, si fagocitosis mediada por astrositos contribuye a la iniciación y progresión de varias enfermedades neurológicas es menos clara. Sin embargo, un artículo reciente sugiere que factores que alteran el ritmo de poda normal de la sinapsis por astrocitos pueden alterar la homeostasis cerebral y contribuyen a la patología y susceptibilidad de anuncio14. El tipo de poda de la sinapsis por astrocitos es poderosamente controlado por ApoE isómeros, con un alelo protector para AD (ApoE2) aumentar fuertemente la tasa y un alelo de riesgo para la EA (ApoE4) reducir significativamente la tasa de. Por otra parte, los ratones transgénicos que expresaban ApoE4 acumulan C1q sináptica mucho más que control o ApoE2 ratones14. Estos datos sugieren que deteriorada fagocitosis mediada por astrositos en principios cerebro AD puede inducir la acumulación de desechos senescentes revestido de C1q sinapsis/synaptic que activa fagocitosis complemento-mediada microglial, conducción sináptica degeneración . La capacidad fagocítica deteriorada de astrocitos en portadores ApoE4 puede también contribuir a la acumulación incontrolada de las placas de beta amiloide en los cerebros afectados por el anuncio.

Además, se ha demostrado que células gliales en el cerebro de Drosophila de perder su capacidad fagocítica por disminución traducción de Draper, un homólogo de Megf10 que los astrocitos phagocytosing la sinapsis. Restauración de niveles de Draper rescató la capacidad fagocitaria de las células gliales, que eficientemente dañado escombros axonal en el cerebro envejecido a un grado similar que en el cerebro joven, indicando que envejecimiento inducido por alteraciones en la capacidad fagocitaria de astrocytes pueden contribuir a la interrupción de la homeostasis cerebral15.

Partiendo de estos nuevos hallazgos, modulando la capacidad fagocitaria de astrocytes puede ser una estrategia terapéutica atractiva para prevenir y tratar diversos trastornos neurológicos. En este sentido, ha habido varios intentos para mejorar la capacidad fagocitaria de los astrocitos, por ejemplo, induciendo la acidificación de los lisosomas con nanopartículas ácidos16 y overexpressing el factor de transcripción EB (TFEB), que puede mejorar de la biogénesis del lisosoma17. A pesar de estos intentos, no está todavía claro cómo los astrocitos y las células microgliales se diferencian en su cinética fagocítico y si nosotros debemos aumentar o disminuir su capacidad fagocítica en diversas enfermedades.

En este trabajo presentamos un ensayo de novela en vitro para la detección de la capacidad fagocitaria de los astrocitos en tiempo real. Los datos muestran diferentes cinéticas de inmersión y degradación en astrocitos y microglía. Medio condicionado por astrositos (ACM), que contiene factores secretados de astrocitos, es esencial para la fagocitosis eficaz de astrocitos y microglia. Además, Megf10, un receptor fagocítico en astrocitos y un homólogo de Ced-1 y Draper, juega un papel crítico en la fagocitosis mediada por astrositos8,18.

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Protocol

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Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Korea Advanced Institute of Science y tecnología institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC), KA2016-08.

1. synaptosome purificación

Nota: Estos procedimientos son adaptados de un trabajo previamente publicado19 con varias modificaciones para mejorar el rendimiento de sinaptosomas purificadas (figura 1).

  1. Preparar medios de gradiente de densidad discontinuo.
    1. Introducir en el hielo: 3%, 10% y 23% densidad gradiente soluciones tampón de gradiente (llevar a 250 mL de agua con 109,54 g de sacarosa, 606 mg de Tris y 5 mL de EDTA de 0.2 M, pH 7.4); buffer de homogeneización (agregar 25 mL de 4 x amortiguador degradado y 500 μl de 50 mM DTT en 74,5 mL de agua); homogeneizador de mortero y una maja.
      Nota: Preparación y solución del gradiente de densidad se presentan en la tabla 1. Para preparar 3%, 10% y 23% densidad gradiente soluciones, uso solución gradiente de densidad de materia prima.
    2. Preparar seis tubos de centrífuga ultra claro por tres ratones adultos.
    3. Añadir 3 mL de solución gradiente de densidad de 23% en la parte inferior de cada tubo de centrífuga con una pipeta de 1 mL. Entonces, poco a poco hacer un capa con 3 mL de solución 10% de gradiente de densidad, en la parte superior la solución de gradiente de densidad de 23% con pasto pipeta y pipeta de 1 mL. Por último, añadir 3 mL de solución de gradiente de densidad 3% en la parte superior. En este paso, tenga cuidado para evitar la introducción de burbujas.
    4. Cubrir los tubos de centrífuga con envoltura de plástico y mantener los tubos en hielo.
  2. Preenfriar una centrifugadora de alta velocidad y una ultracentrífuga a 4 ° C.
  3. Esterilizar material quirúrgico (tijeras, Castroviejo primavera tijeras y pinzas curvas de funcionamiento) con etanol al 70%. Preparar un vaso pequeño de vidrio con 25 mL de buffer de homogeneización en el hielo y pesar el vaso de precipitados.
  4. Extraer los cerebros de ratones machos de tres adultos (aproximadamente 12 semanas de edad).
    1. Dislocar la vértebra cervical y cortar el cuello con tijeras del funcionamiento. Pele la piel de la cabeza y el cráneo a lo largo de la línea media con funcionamiento tijeras y pinzas curvas. Suprimir los bulbos olfativos y cerebelo con tijeras de Castroviejo primavera.
  5. Ponga los cerebros restantes en el vaso con el fórceps curvado y pesar los cerebros. Enjuague el cerebro varias veces con buffer de homogeneización helada para quitar la sangre en la superficie del cerebro.
    Nota: Previamente, 9 mL de buffer de homogeneización a 1 g de tejido cerebral se recomienda.
  6. Añadir 4 mL de tampón y 1 g de tejidos cerebrales para el mortero de homogeneizador de homogeneización. Mientras los cerebros de homogeneización, agregue homogeneización tampón hasta 8 mL.
  7. El homogeneizado se dividen en dos tubos de centrífuga de alta velocidad de 50 mL. Lavar el mortero con 1 mL de buffer de homogeneización fresca y añadir a los tubos.
    PRECAUCIÓN: Proceder por pasos 1.3-1.7 tan rápidamente como sea posible. Menos de 20 minutos se recomienda.
  8. Centrifugue los homogenados en tubos de centrífuga de alta velocidad a 1.000 x g durante 10 min a 4 ° C con frenos más lento.
    Nota: Ajustar la velocidad de deceleración (freno) en dos o tres cuando la tasa máxima de desaceleración es nueve.
  9. Cuidadosamente añadir el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mL y añadir hasta 12 mL de buffer de homogeneización.
  10. Cuidadosamente y lentamente pipeta 2 mL de sobrenadante diluido en la solución del gradiente de densidad de 3% con una pipeta de 1 mL y coloque los tubos en hielo.
  11. Centrifugue a 31.000 x g durante 5 min a 4 ° C sin frenos.
    Nota: Establezca la velocidad de desaceleración en uno (cero) o la costa.
  12. Coloque los tubos en hielo y recoger la fracción de synaptosome entre la solución gradiente de densidad de 23% y 10% solución gradiente de densidad con una pipeta de 2 mL en un tubo de 50 mL. Agregar sacarosa helada/EDTA buffer hasta 80 mL y dividirla en cuatro tubos de centrífuga de alta velocidad de 50 mL.
    Nota: Consulte la figura 3 de sinaptosomas fraccionadas con marcadas pendientes.
  13. Centrifugue a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° c con menos descansos.
    Nota: Ajustar el ritmo de desaceleración en dos o tres cuando la tasa máxima de desaceleración es nueve.
  14. Con cuidado quite el sobrenadante con una pipeta de 1 mL, Resuspender el precipitado de synaptosome con 1 mL de tampón fisiológico isotónico (140 mM NaCl, KCl de 3 mM, 1,2 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES y glucosa 10 mM, pH 7.4)20. Añadir 1 mL de DMSO de 10% en tampón fisiológica isotónica (concentración final de DMSO: 5%) y los sinaptosomas de recoger en un tubo de centrífuga de alta velocidad de 50 mL.
  15. Alícuota 1 mL en tubos de 1,5 mL. Medir la concentración de proteína de los sinaptosomas utilizando el ensayo de Bradford.
  16. Rápidamente congelar los tubos y almacenar los tubos en un congelador de-80 ° C hasta verbal indicador de pH.

2. pH indicador verbal

  1. Centrifugar tubos de 1,5 mL con sinaptosomas 21.092 x g durante 3-4 min a 4 ° C.
  2. Eliminar el sobrenadante, agregar 200 μL de 0,1 M de Na2CO3 y mezclar por pipeteo.
    Nota: Na2CO3 fue agregado elevar el pH como éster de succinimidyl más eficientemente reacciona con aminas primarias en un pH ligeramente alcalino.
  3. Añadir 2 μl de indicador de pH y el tubo suavemente vortex.
    PRECAUCIÓN: Use 1 μl de indicador de pH por 0,3 mg de solución de synaptosome.
  4. Minimizar la exposición a la luz cubriendo los tubos con papel de aluminio e incúbelos durante 1-2 h a temperatura ambiente (RT) en una coctelera de giro con suave agitación en 30-40 rpm.
  5. Detener la agitación y agregar 1 mL de DPBS.
  6. Centrifugar los tubos a 21.092 x g durante 1-2 minutos.
  7. Quite el sobrenadante y agregar 1 mL de DPBS para Resuspender el precipitado mediante pipeteo suave.
  8. Repita los pasos 2.6-2.7 por lo menos siete veces para quitar el indicador de pH independiente.
  9. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado con 200 μL de DPBS con 5% de DMSO.
    Nota: en este punto, los sinaptosomas son no funcionales. Hemos confirmado que fosfatidilserina (PS) ha sido expuesto a la membrana externa de sinaptosomas, que funciona como un "comer-me" señal (figura 4).

3. astrocitos y microglía purificación

Nota: Este protocolo para la purificación de astrositos es adaptado de un artículo previamente publicado21. En este protocolo, se describe la purificación de rata astrocitos y microglía. También se describen los procedimientos específicos para purificar el ratón astrocitos y microglia en las notas.

  1. Día antes de la purificación
    1. Preparar platos de cultivo celular prelacado y soluciones.
    2. Preparar cinco de 145 x 20 mm placas de Petri con 25 mL de 50 mM Tris-HCl (pH 9.5). Colocar tratamiento de anticuerpo primario o secundario en las cajas Petri por separado como se describe a continuación. Incubar durante una noche los platos en el congelador.
      BSL-1 plato: 20 μl de 5 mg/mL BSL-1 (Griffonia simplicifolia lectina)
      Plato solo de secundaria: 60 μL de 2.4 mg/mL cabra anti-ratón IgG + IgM (H + L)
      Plato de CD45: 60 μL de 2.4 mg/mL cabra anti-ratón IgG + IgM (H + L)
      Plato de O4: 60 μL de 2.4 mg/mL cabra anti-ratón IgM (específica de cadena μ)
      Itgb5 (integrina β5) plato de astrocitos de rata: 60 μL de 2.4 mg/mL cabra anti-ratón IgG + IgM (H + L)
      Nota: Para unir el anticuerpo secundario a la superficie de la placa de Petri, se recomienda fijación lenta a bajas temperaturas. Sin embargo, es posible recubrir la placa de Petri con anticuerpo secundario por 2 h a 37 ° C. Anticuerpos de astrositos panorámica se utilizan diferentemente dependiendo de la especie animal; por ejemplo, HepaCAM plato de los astrocytes del ratón: 60 μL de 2.4 mg/mL cabra anti-ratón IgG + IgM (H + L)
  2. Día de la purificación
    1. Preparar para immunopanning.
    2. Preparar tubos de 50 mL y añadir acciones a los tubos. La preparación de toda solución se presenta en la tabla 1.
      1. Preparar el tubo 1 (enzima): 22 mL de stock de enzima (acción de la enzima: 1 x solución salina balanceada de Earle (EBSS)+0.46% D (+)-glucosa + 26 mM NaHCO3 y0,5 mM EDTA).
      2. Preparar el tubo 2 (baja Ovo): 42 mL de stock de inhibidor (acción de inhibidor: 1 x EBSS+0.46% D (+)-glucosa + 26 Mm NaHCO3).
      3. Preparar el tubo 3 (Ovo alta): 10 mL de stock de inhibidor.
    3. Instale filtros de la jeringuilla de 0.22 μm en las puntas de pipetas de 2 mL conectadas a un tanque de CO2 (95% O2 y 5% CO2). Burbujas de CO2 en los tubos 1-3. Deje de burbujear cuando las soluciones de naranja.
    4. Las soluciones completas.
      Atención: Completar e incubar la solución en el tubo 1 a 34 ° C durante 15 min antes de usar para la activación de la enzima.
      1. Preparar el tubo 1 (enzima): 22 mL de enzima stock + 180 U de papaína + 0,004 g L-cisteína.
      2. Preparar el tubo 2 (baja Ovo): 42 mL de acción inhibidor + 3 mL de baja Ovo + 200 μL de DNasa.
      3. Preparar el tubo 3 (Ovo alta): 10 mL de acción inhibidor + 2 mL de Ovo alta + 20 μl de DNasa.
      4. Preparar el tubo 4 (0,2% BSA): 19 mL de 1 X DPBS + 1 mL de BSA 4% + 8 μl de DNasa.
      5. Preparar el tubo 5 (0.02% BSA): 45 mL de 1 X DPBS + 5 mL de tubo 4 + 50 μl de DNasa.
    5. Precaliente un bloque de calor y baño de agua a 34 ° C.
  3. Extracto de la corteza de la rata.
    1. Esterilizar material quirúrgico con etanol al 70% y preparar platos de Petri de 100 mm con DPBS.
    2. Preparar una caja de acrílico. Poner dos o tres capas de tejidos en la parte inferior de la caja y agregar 1 mL de isoflurano en el cuadro.
    3. Anestesiar cachorros para 20-40 s en el cuadro y confirmar anestesia pizca de pie con el fórceps. Exponer el corazón22 y perfusión cachorros con una jeringa de 10 mL DPBS.
      Nota: La perfusión se utiliza para evitar la contaminación de células de la sangre durante la etapa de barrido de microglia.
    4. Corte cervical con la línea superior de cachorro del cuello con unas tijeras funcionamiento y haga una incisión en la piel de la cabeza a lo largo de la línea media. Hacer una incisión en el cráneo a lo largo de la línea media y abra el cráneo con fórceps curvado.
    5. Suprimir el cerebelo con unas tijeras de muelle de Castroviejo. Sacar el cerebro restante y colocar en un plato de Petri de 100 mm con DPBS.
    6. Retire otras áreas como el mesencéfalo e hipocampo de la corteza con Castroviejo tijeras de primavera bajo el microscopio. Retire las meninges con pinzas finas.
    7. Transferencia de la corteza en una nueva placa de 60 mm y quite la DPBS restantes en el plato. Cortar el tejido con una cuchilla Nº 10.
  4. Disociar la corteza en una suspensión unicelular
    1. Llenar el tubo 1 filtrado en una placa de 60 mm y añadir 50 μl de DNase1. Agitar la solución en el plato.
      Nota: DNasa se utiliza para inhibir la agregación de la DNA de las células rotas.
    2. Coloque el plato en un bloque de 34 ° C de calor y cubrir con una tapa que tiene un agujero en el centro. Utilice un soldador para hacer el orificio en la tapa de la caja Petri 60 mm.
    3. Conecte filtros de la jeringuilla de 22 μm a un tubo de tanque de CO2 y coloque la punta del filtro en el orificio.
    4. Incubar la placa a 34 ° C durante 45 minutos remolino la solución en el recipiente cada 10 a 15 minutos.
  5. Terminar la preparación de los platos de barrido.
    1. Retire los platos panorámica que han sido recubiertos con anticuerpos secundarios del congelador un día antes de tiempo. Dejo el plato de BSL-1 y el plato sólo anticuerpo secundario a TA.
    2. Lave los platos tres veces con 20 mL de DPBS.
    3. Vierta una cantidad adecuada de 0.02% de BSA en los platos. Lugar de anticuerpos primarios en los platos correspondientes:
      Plato de CD45: 12 mL de BSA 0,02% + 20 μl de 0,5 mg/mL del anti-ratón rata CD45
      Itgb5 plato: 12 mL de BSA 0,02% + 20 μl de 0,5 mg/mL Itgb5
      Plato de O4: 8 mL de 0.02% de BSA y 4 mL de anticuerpo O4
      Nota: Para immunopanning de ratón, utilice anti-rata de ratón CD45 (0.5 mg/mL) de microglia y HepaCAM (0,5 mg/mL) de los astrocitos.
    4. Preparar 30 mL de 30% FBS con neurobasal medios y 10 mL de 1 X EBSS. Ambas soluciones en un baño de agua de 34 ° C de calentamiento.
  6. Inhibir la reacción de la papaína.
    1. Los tejidos tratados con papaína la transferencia a un nuevo tubo de 50 mL. Espere a que los tejidos resolver. Aspirar cuidadosamente el líquido por la succión.
    2. Añadir 4 mL de solución de Ovo baja al tubo y agitar la solución para lavar las células.
    3. Repita los pasos 3.6.1-3.6.2 tres veces para detener la reacción enzimática.
  7. Triturate los tejidos de la corteza.
    1. Añadir 6 mL de baja Ovo a la tina. Aspire y liberar los tejidos rápidamente con una pipeta de 5 mL.
      Atención: No introducir burbujas.
    2. Prepare un nuevo tubo de 50 mL y añadir 5 mL de Ovo de baja. Recoger las células en un tubo nuevo.
    3. Repita los pasos 3.6.1-3.6.2 dos veces y cambiar la pipeta de 5 mL a una pipeta de 1 mL.
    4. Repita la trituración hasta que más del 95% de los tejidos no son visible.
    5. Hacer que una capa de solución de Ovo alta de las células de tubo de 3 con una pipeta de 10 mL abajo baja que contiene Ovo disociado.
    6. Centrifugue a 190 x g durante 6 minutos con pocos frenos.
      Nota: Ajustar el ritmo de desaceleración en uno o dos cuando la tasa máxima de desaceleración es nueve.
  8. Las células del líquido filtrado.
    1. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante por succión y resuspender el precipitado con 3 mL de solución de BSA de 0.02% con una pipeta de 1 mL.
    2. Añadir solución de BSA de 0,02% a 9 mL.
    3. Preparar un tubo de 50 mL nuevo y filtro de celular de 20 μm en la parte superior del tubo. Moje el filtro celular con 1 mL de solución de BSA de 0.02%.
    4. Transferir la suspensión de células individuales en el colador de la célula. Filtro de 1 mL a la vez.
    5. Lave el filtro de la celda con 3 mL de solución de BSA de 0.02%. No hacen más de 15 mL de la suspensión filtrada unicelular.
    6. Incubar el tubo en un baño de agua de 34 ° C durante 45-60 minutos para la recuperación de la célula. Relocalización de proteínas de la superficie de la célula a la membrana permite el paso de recuperación celular.
  9. Realizar lavado de las células.
    1. Lave el CD45 plato barrido tres veces con 20 mL de DPBS. Lavar todos los platos tres veces con 20 mL de DPBS inmediatamente antes del uso.
    2. Verter la suspensión de células individuales en el CD45 batea plato. Deja el plato de 28 min y agite el plato durante 14 minutos. Para eliminar las células no consolidadas de la parte inferior, agite cuidadosamente el plato.
    3. Transferir la suspensión de células en el plato sólo secundaria. Espere 20 minutos y agite con cuidado el plato durante 10 minutos. Para obtener la microglia del plato CD45, vaya al paso 3.9.2.
    4. Transferir la suspensión de células en la placa de BSL-1. Deje el plato durante 10 a 12 minutos.
    5. Transferencia en el plato de O4. Espere 20 minutos y agitar durante 10 minutos.
    6. Transferencia al plato Itgb5. Deja el plato para 40 min y agítelo suavemente cada 10 minutos.
      Nota: Para ratón desplazamiento, transferencia de la suspensión de células en el plato de HepaCAM.
  10. Separar las células del plato.
    1. Mezclar 400 μL de la tripsina (30.000 U/mL en EBSS) con incuba 8 mL de EBSS X 1.
    2. Verter la suspensión de células separadas en el plato en un cubo de basura.
    3. Lavar el plato ocho veces con DPBS.
    4. Vierta 8 mL de EBSS con tripsina en el plato.
    5. Incubar el plato durante 5 a 10 minutos en la incubadora de 37 ° C. Incubar por 10 min para el plato de CD45 y 5 minutos para los platos Itgb5 y HepaCAM.
    6. Toque en el plato y observe el plato bajo el microscopio.
      Nota: Si no se extrae la mayor parte de los astrocitos, coloque el plato en la incubadora durante otros 5 minutos.
    7. Vierta 10 mL de 30% FBS en el plato para neutralizar la tripsina.
    8. Pipetee hacia arriba y hacia abajo en el plato entero para separar los astrocitos o microglia.
    9. Transfiera la solución en un tubo de 50 mL.
    10. Añadir 10 mL de 30% FBS y 200 μL de DNasa en el plato. Separar las células otra vez. DNasa se utiliza para inhibir la agregación de la DNA de las células rotas.
    11. Transferir la solución al tubo. Si las células quedan en el plato, añadir otros 10 mL de 30% FBS y separar las células otra vez.
  11. Las células de la placa.
    1. Centrifugar el tubo a 213 x g por 10 min.
    2. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con medios de comunicación.
      Nota: Utilice immunopanned medios básicos de astrositos (IP-ABM) astrocitos y microglía retiniana medios básicos (MBM) con immunopanned acondicionado astrositos los medios de comunicación (IP-ACM) de microglia. La IP-ABM y las composiciones de MBM se presentan en la Tabla de materiales.
    3. Contar las células con un hemocitómetro.
    4. Placa de los astrocitos y la microglia por separado en las placas revestidas de PDL.
      Nota: Preparar la placa revestida de PDL antes de su uso. Para preparar las placas revestidas de PDL, añadir 50 μl de 1 mg/mL poly-D-lisina en 5 mL de agua destilada y verter una cantidad adecuada de solución en el plato/plato bien y espere 30 minutos lavar el plato/plato tres veces con agua destilada.
    5. Incubar la placa. Cambiar la mitad de los medios de comunicación cada 7 días por astrocitos y 3 días para la microglia.

4. recoger IP ACM

  1. Preparar un plato de 100 mm cuando los astrocitos son demasiado confluentes.
  2. Desechar los medios de comunicación y lave el plato tres veces con 10 mL de DPBS.
  3. Verter 15 mL de medio de proteína baja en el plato.
    Nota: La composición de los medios de comunicación de baja proteína se presenta en la Tabla de materiales.
  4. Incubar el plato durante 7 a 10 días en la incubadora de 37 ° C.
  5. Recoger y concentrar los medios de comunicación con 10k (o 30k) tubos filtro centrífugo.
  6. Centrifugar los tubos a 851 x g a 4 ° C.
    Nota: Los tubos de la centrífuga hasta que los restantes medios de comunicación son de menos de 1 mL.
  7. Recoger concentrado los medios de comunicación (IP-ACM) en un nuevo tubo de 1,5 mL.
  8. Medir la concentración de la propiedad intelectual-ACM mediante análisis cuantitativo

5. fagocitosis en vivo-proyección de imagen de análisis (figura 2)

  1. Preparar una placa de 24 pozos (o cualquier plato/plato que está preparado para vivir-la proyección de imagen) en la que los astrocitos son confluentes (generalmente, de 7 a 10 días de incubación después de la purificación es ideal para estabilizar las células).
  2. Retire los medios de comunicación en cada pozo y lavar los pocillos con 1 mL de DPBS, tres veces. Para minimizar la exposición al aire, lavar rápidamente los pozos.
  3. Añadir 300 μL de IP-ABM con 5 μl de sinaptosomas de conjugado con indicador de pH y otros factores como IP-ACM que pueden modular la fagocitosis de células gliales.
  4. Incube la placa en un incubador de CO2 durante 40 minutos. Este paso permite el pH indicador conjugado sinaptosomas a instalarse en la parte inferior de las placas.
  5. Retire los medios con sinaptosomas conjugado con indicador pH independiente y lavar cada pocillo con 1 mL de DPBS, tres veces.
    PRECAUCIÓN: No lave duramente. Para minimizar la exposición al aire, lavar rápidamente los pozos.
  6. Añadir 500 μl de IP-ABM con factores adicionales para probar en los pozos.
  7. Tomar la placa a un instrumento de proyección de imagen en vivo y seleccionar la posición. Ajustar el enfoque, tiempo de exposición, brillo y energía del LED.
    Nota: La configuración de tiempo de exposición, brillo y energía del LED es variable dependiendo de la intensidad de la fluorescencia y el propósito del experimento. En el análisis de imágenes en vivo con sinaptosomas conjugado con indicador de pH, generalmente ponemos esos valores como sigue: exposición: ~ 150-200 ms, brillo: 15 y LED potencia: 4-6.
  8. Establecer el formato de imagen, intervalo de tiempo y el número total de ciclos de proyección de imagen en vivo. Establecer el intervalo de tiempo 1 o 2 horas dependiendo de cuantas posiciones se seleccionan. 2 horas intervalos se recomiendan más de 150 posiciones se seleccionan para las imágenes en vivo.
  9. Iniciar los experimentos de proyección de imagen en vivo.
  10. Analizar los datos.
    1. Abrir el programa de Fiji.
    2. Importación de una secuencia de imágenes. Convertir imágenes a escala de grises de 8 bits.
    3. Realizar la sustracción de fondo con un rolling bar radio de 50 píxeles.
    4. Empezar a tiempo serie analizador V3 plugins.
      Nota: La dirección para el analizador de la serie de tiempo V3 plugins se presenta en la Tabla de materiales.
    5. Arrastrar la región de interés (ROI) en la imagen y haga clic en agregar en el administrador de ROI.
    6. Haga clic en "Obtener la intensidad total" en la serie de tiempo V3_0.
    7. Guardar los resultados e integrar los datos.

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Representative Results

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En este en vitro fagocitosis análisis con imágenes en vivo a largo plazo, utilizamos sinaptosomas de homogenados de cerebro de ratón adulto, que se separaron de la solución gradiente entre solución gradiente 23% y 10% degradado por ultracentrifugación ( Figura 3). Después de la preparación, sinaptosomas expusieron PS en su membrana externa (figura 4), sugiriendo que perdieron su función y pueden ser reconocidos por receptores de PS en astrocitos y microglía. Como se muestra en la figura 5, sinaptosomas conjugado con indicador pH emiten fluorescencia roja brillante cuando fueron engullidas por los astrocitos. Comparación en tiempo real de las capacidades de inmersión y la degradación de las células gliales es posible tomar imágenes múltiples de un ROI cada 1 o 2 h (complementario 1 película, adicional 2 de la película). Con este método, hemos demostrado la diferente cinética de fagocitosis mediada por astrositos y microglia (figura 6). Para cuantificar la fagocitosis de las células gliales, se midió el área (μm2) de la señal de fluorescencia roja, que se refiere al índice fagocítico en la Figura 6B y figura 7. Aunque los astrocitos parecen ser eficientes en phagocytosing grandes cantidades de sinaptosomas de conjugado con indicador de pH, microglia eran más rápidos que azota y degradantes sinaptosomas (Figura 6B). Microglia demostró intensidad del indicador de pH máximo en 26 h después del tratamiento de synaptosome conjugado con indicador de pH, mientras que los astrocitos demostraron su máximo en 45 h (p-valor < 0.05, ANOVA de dos vías entre astrositos con 1 X ACM y microglia con ACM de X 1). Además, las células microgliales demostraron una reducción del 20,7% en intensidad de indicador de pH total 40 h después del punto de pico, mientras que astrocitos demostraron una reducción del 17% en intensidad de indicador pH total durante el mismo período de tiempo. Curiosamente, nuestros datos demostraron que factores secretados de astrositos, que figuraban en el ACM, son esenciales para incrementar ambos fagocitosis mediada por astrositos y microglia (Figura 6B). Astrocitos han demostrado al liberar moléculas de puente, como MFGE8, GAS6 y proteínas, que pueden salvar e inducir interacciones entre receptores fagocíticos y "comer-me" señales como PS23. Como se mencionó anteriormente, astrocitos eliminan sinapsis del MERTK y MEGF10 vías4. MEGF10 sólo se expresa por los astrocitos en el cerebro y participa en la inmersión de la sinapsis a través del reconocimiento de "comer-me" señales con identidades desconocidas. De acuerdo con los resultados anteriores, el ensayo demostró que en comparación con el tipo salvaje (WT) ratón los astrocytes, Megf10 knock-out (KO) ratón astrocitos poseen significativamente deteriorada capacidad fagocítica (figura 7). En comparación con los astrocitos de la WT, Megf10 KO astrocitos demostraron un aproximadamente 40% de reducción en intensidad de indicador de pH total en el punto máximo (31 h) (figura 7).

Figure 1
Figura 1. Esquema de purificación astrositos utilizando métodos de immunopanning. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Esquema de análisis de imágenes en vivo de fagocitosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Fraccionamiento de homogeneizado de cerebro representante en el gradiente soluciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Imágenes representativas de sinaptosomas expuestos a PS. (A) A imagen de campo claro de astrocitos con sinaptosomas. Sinaptosomas se unen a los astrocitos. (B) una imagen fluorescente de sinaptosomas tdTomato-positivas, que son purificados de ratón tdTomato-expresando los cerebros. (C) pSIVA se une a PS, que se expone a la membrana externa de synaptosome y emite fluorescencia verde. PS (D) detectada por pSIVA (verde) es co localizada con sinaptosomas de tdTomato positivo (rojo). Barra de escala: 20 μm haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Representante de campo brillante e imágenes fluorescentes de astrocitos con sinaptosomas conjugado con indicador de pH en dos puntos del tiempo. A las 11 h después del tratamiento (panel inferior), sinaptosomas conjugado con indicador de pH son engullidas por los astrocitos y emiten fluorescencia roja mientras que hacen no a 1 h después del tratamiento (panel superior). Barra de escala: 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. Cinética fagocítico de rata astrocitos y microglía a través de imágenes en vivo a largo plazo. (A) A esquema de un ensayo de fagocitosis en vitro usando purificados astrocitos y microglia junto con sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Tenga en cuenta que antes de tomaron imágenes en vivo, independientes sinaptosomas son arrastrados después de 40 min de incubación. (B) los gráficos representativos mostrando la inmersión y la degradación cinética de astrocitos y microglia. ACM, que contiene factores secretados de astrositos, mejora significativamente ambos absorción de synaptosome mediada por astrositos y microglia. Astrositos: Control vs astrositos con ACM 1 X, ***, Tukey del test de comparaciones múltiples. Microglia: Control vs Microglia con ACM 1 X, ***, Tukey de prueba de comparación múltiple. Barras de error indican SEM *p ≤ 0.05, *** p ≤ 0.0001, ANOVA de dos vías. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7. Disminución capacidad fagocítica de los astrocytes del ratón de Megf10 KO con 1 X ACM comparado con el de astrocitos de ratón WT con ACM de X 1. PESO vs Megf10 KO astrocitos con ACM de X 1, ***, ANOVA de dos vías. Barras de error indican SEM * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001 ANOVA de dos vías. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: recetas de solución. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Película suplementario 1. Un representante en vivo-proyección de imagen de video la fagocitosis del pH sinaptosomas conjugado con indicador por astrocitos. Por favor haga clic aquí para descargar este archivo.

Película adicional 2. Un video de imágenes en vivo representante mostrando fagocitosis del pH sinaptosomas conjugado con indicador por las células microgliales. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

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En este artículo se presentan métodos para un largo plazo imágenes viven en vitro fagocitosis ensayo usando células gliales purificadas y sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Se muestra que en comparación con la microglia, astrocitos poseen diferente capacidad de inmersión y degradación durante la fagocitosis de sinaptosomas. Además, nuestros datos sugieren que factores secretados de astrositos, que contienen moléculas puente como GAS6, proteínas y MEGE8, son esenciales para la fagocitosis depende PS eficiente de células gliales en el cerebro. Por otra parte, Megf10 KO astrocitos muestran fagocitosis defectuosa de sinaptosomas.

Para realizar con éxito este experimento, los medios y la DPBS deba intercambiarse cuidadosamente durante las etapas de lavado (sección 5). Primaria cultivadas astrocitos y microglía, especialmente microglía, son vulnerable a la exposición al aire. Por lo tanto, reduciendo los intervalos de tiempo entre pasos de lavado es fundamental para el mantenimiento de células vivas. Para configurar imágenes de vivir a largo plazo con instrumentos en vivo-la proyección de imagen, enfoque manual se recomienda auto enfoque puede aumentar el tiempo de exposición láser/LED, que puede dañar las células.

En este método, la purificación de synaptosome protocolo19 se modifica ligeramente. El documento original separa soluciones de gradiente en 3%, 10%, 15% y 23%. Sin embargo, hemos creado soluciones gradiente de 3%, 10% y 23% para aumentar el rendimiento de sinaptosomas purificadas. Las instrucciones para immunopanning de astrocitos y células de la microglía se modifican también en este método. El objetivo de la original panorámica protocolo21 es purificar solamente astrocitos y utilizar BSL-1, sólo secundario, CD45, O4 y Itgb5 (HepaCAM para ratón) como la orden de immunopanning. Puesto que las placas BSL-1 y secundaria sólo elimina las células endoteliales, así como microglia, cambiamos el orden para CD45, sólo secundario, BSL-1, O4 y Itgb5 (HepaCAM de ratón) para aumentar el rendimiento de la microglía de la CD45 batea plato. En este protocolo, inundada también crías de rata SD (~ P7-P10) con DPBS a través del sistema circulatorio para extraer varias células de la sangre para minimizar la contaminación de las poblaciones no microglial CD45 positivo.

Hay varias ventajas de la prueba de fagocitosis en vitro . El indicador de pH utilizado en la conjugación de synaptosome sólo emite fluorescencia roja en condiciones de pH bajo. Por lo tanto, al procesar los datos, nosotros podemos directamente cuantificar la fluorescencia roja como señal de eventos fagocíticas sin un procedimiento de enfriamiento para eliminar señales de fondo o complicados análisis de imágenes para obtener señales Co localizadas de material engullido dentro de fagocitos. Además, este método permite un seguimiento en tiempo real de la fagocitosis glial por tomar imágenes de la intensidad del indicador de pH dentro de un determinado retorno de la inversión en varios puntos del tiempo. Generando un gráfico con la intensidad del indicador de pH hasta 100 h, la inmersión como degradación capacidades pueden controlarse fácilmente entre diferentes células y condiciones. Otra ventaja es el uso de sinaptosomas. Ya que los astrocitos ensheathe sinapsis procesos todo el tiempo con sus bellas y han demostrado que engullen las sinapsis en vivo4, usando sinaptosomas es muy conveniente para la medición de la capacidad fagocitaria en vitro de astrocitos. Por último, este ensayo de fagocitosis en vitro tiene el potencial para ser desarrollado para estudiar la fagocitosis glial de beta escombros o amiloide mielina, que se relaciona con diversos trastornos neurológicos.

Con mayor esperanza de vida, es inevitable un aumento dramático en el número de pacientes con enfermedades neurodegenerativas. Pérdida de sinapsis a través de las células gliales es uno de los factores principales en varias enfermedades de neurodegenerative13,14. Además, poda de sinapsis anormales y un desequilibrio de la homeostasis cerebral pueden asociarse con defectos de fagocitosis glial. Por lo tanto, identificar factores y compuestos que pueden controlar la capacidad de inmersión y la degradación de astrocitos podría resultar fundamental para encontrar tratamientos eficaces para los varios desordenes neurológicos. Puesto que este ensayo de fagocitosis en vitro puede ampliarse fácilmente con placas de pocillos, este método puede utilizarse como una plataforma conveniente para varios exámenes para identificar dichos factores.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Jung Yeon-Joo por su apoyo experimental durante la purificación de synaptosome y Jungjoo Corea Parque imágenes de sinaptosomas con exposición de PS. Además, agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Chung de discusión útil. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de investigación de concesión de Corea (NRF) financiado por el gobierno coreano (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 y NRF-2016R1C1B3006969) (W. S. C).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synaptosome purification
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 BIO-RAD 5000202
pH indicator conjugation
Dimethyl sulfoxide(DMSO) LPS solution DMSO100
pHrodo red, succinimidyl ester Molecula probes P36600
Immunopanning
10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) Sigma E7510
Bovine serum albumin Bovogen BSA025
Deoxyrebonuclease 1 (DNase) Worthington Is002007
(DMEM) Gibco 11960-044
(dPBS) Welgene LB001-02
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) Vector Labs L-1100
Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) Jackson ImmunoResearch 115-005-044
Goat anti-mouse IgM (μ-chain) Jackson ImmunoResearch 115-005-020
Heparin-binding epidermal growth factor Sigma E4643
Human HepaCAM antibody R&D systems MAB4108
Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) eBioscience 14-0497-82
L-cysteine Sigma C7880
L-glutamate Gibco 25030-081
N-acetly-L-cyteine (NAC) Sigma A8199
Neurobasal media Gibco 21103-049
O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) Bansal et al.23
Papain Worthington Is003126
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Pluristrainer 20 μm PluriSelect 43-50020-03
Poly-D-lysine Sigma P6407
Progesterone Sigma P8783
Putrescine dihydrochloride Sigma P5780
Purified rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen 550539
Purified mouse anti-rat CD45 BD Pharmingen 554875
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Sodium selenite Sigma S5261
Transferrin Sigma T1147
Trypsin Sigma T9935
Trypsin inhibitor Worthington LS003086
Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) Beckman Coulter 344059
Collect IP-ACM
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) PALL MAP010C37
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) PALL MAP030C37
Phagocytosis live imaging assay
Juli stage NanoEntek
Time Series Analyzer V3 plugins https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html

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References

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Un pH de novela <em>In Vitro</em> Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador
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Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).More

Byun, Y. G., Chung, W. S. A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes. J. Vis. Exp. (132), e56647, doi:10.3791/56647 (2018).

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