Biz iletişim kuralları izolasyon-in vivo dokusundan bağırsak 3D yapılar için mevcut ve organoids ve detay farklı fiksasyon ve protokolleri IMMUNO-etiketleme için Mikrotubul, en iyi duruma getirilmiş boyama vitro Bodrum matris gömülü, centrosomal ve bileske proteinler de gibi hücre kök hücre proteini Lgr5 de dahil olmak üzere işaretler.
Vivo doku mimarisi ve morfogenetik taklit 3D vitro organoids gelişiyle hücre ve gelişim biyolojisi anahtar biyolojik sorular çalışma yeteneği büyük ölçüde ilerlemiştir. Buna ek olarak, organoids ile birlikte son teknik gelişmeler gen düzenleme ve viral gen teslim tıbbi araştırma ve geliştirme hastalıklarının tedavisi için yeni ilaçların ilerlemek vaat ediyor. Vitro Bodrum matris yetiştirilen Organoids çeşitli proteinlerin işlevini ve davranış eğitimi için güçlü model sistemleri sağlar ve canlı görüntüleme için floresan öğesini proteinlerin uygundur. Ancak, ifade ve yerelleştirme endojen proteinlerin kurulması ex vivo doku ve vitro organoids tagged proteinlerin davranışını doğrulamanız önemlidir. Bu amaçla biz geliştirdik ve doku yalıtım, fiksasyon ve immün etiketleme iletişim kurallarını mikrotübüller, centrosomal ve ilişkili proteinler ex vivo bağırsak dokusu ve vitro bağırsak organoids lokalizasyonu için değiştirildi. Ayrıca antikor antigenicity koruyarak ve iyi penetrasyon ve izni sabitleştirici ve antikorlar etkinleştirme sırasında organoids/doku 3D mimari korumak sabitleştirici amaç içindi. Tüm istikrarlı mikrotübüller soğuk maruz depolymerizes ve bu çeşitli protokoller değiştirirken önemli bir faktör oldu. Biz 3 mM EDTA kolon kriptalarının için yeterli iken ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) konsantrasyonu 3 mm 30 mM için artan villus ve ince bağırsak kriptalarının verimli dekolmanı verdi bulundu. Gelişmiş formaldehit/metanol fiksasyon protokolü de antigenicity etkili etiketleme mikrotübüller, aktin ve bitiş (EB) proteinler için koruma sırasında çok iyi Yapısal koruma verdi. Metanol Protokolü daha tutarlı bir şekilde çalıştı, ancak aynı zamanda centrosomal protein ninein için çalıştı. Daha fazla gelen izole veya Bodrum matris içinde kalan organoids ile fiksasyon ve IMMUNO-etiketleme mikrotübüller ve ilişkili proteinler elde edilebilir kurduk.
Epiteli ile apico Bazal polarite oluşumu geliştirmede temel bir süreçtir ve mikrotübüller ve centrosomal proteinlerinin dramatik bir yeniden yapılanma içerir. Merkezi bir konumda bulunan bir centrosomal Mikrotubul Merkezi düzenleme yayılan (MTOC) birçok hayvan hücrelerinde belirgin ve bu nispeten düz hücreler için de uygun bir Radyal Mikrotubul dizi. Buna ek olarak, bu bağırsak gibi yassı epitel hücreleri daha iyi şekil ve bu hücrelerin özel işlevlerini destek olmayan Radyal transcellular Mikrotubul diziler topla. Bu dramatik yeniden düzenleme-in mikrotübüller transcellular mikrotübüller1,2 anchorage için sorumlu olur centrosome tepe ve şekillendirme, apikal centrosomal MTOCs (n-MTOCs) hareket elde edilir , 3 , 4 , 5.
Epitel farklılaşma ve ilişkili Mikrotubul yeniden yapılanma ile ilgili bilgilerimizi çoğunu yapmak değil göstermek içinde vivo doku mimari 2D vitro hücre katmanları araştırmalar geldi. Taklit ediyorlar vivo içinde mimari ve geliştirme gibi geliştirme Clevers ve iş arkadaşları6tarafından öncülük 3D vitro organoid kültürlerin büyük bir teknolojik ilerleme temsil eder. Epitel farklılaşma hiyerarşisini bağırsaklarda belirgindir; kök hücre alt kriptalarının olgunlaşmamış transit çoğalırlar ve nereye onlar tamamen önce ayrıştırılan haline crypt küçük bağırsak villus veya kolon yüzey üzerine kadar göç gibi yavaş yavaş ayırt hücreleri yükseltecek ortaya çıkmasına Lümen7dökmek. Önemlisi, bu bağırsak organoids nerede kök hücre niş hücrelerden daha sonra alt ve kist bölge doğru yavaş yavaş ilerliyor farklılaşma kök hücreleriyle crypt benzeri tomurcukları oluşturmak şekillendirme kistler prolifere olarak çoğaltılır, hangi villus benzeri8olur. Bağırsak organoid, bu nedenle sadece Mikrotubul ve epitel farklılaşma ama çok sayıda diğer proteinler yanı sıra ilaç ve gıda ile taranması için ideal bir platform sağlayan sırasında centrosomal yeniden yapılanma çalışması için güçlü bir modelini temsil bileşikler potansiyel terapötik yararları9,10.
Organoids canlı görüntüleme için floresan öğesini proteinlerin uygundur ve her ikisi de Tak- ve knock-out organoids CRISPR/Cas9 gen11,12düzenleme kullanarak oluşturulabilir. Ancak, ifade ve yerelleştirme belirlenmesi için endojen proteinlerin kurulması özellikle tagged proteinler davranışını doğrulamak önemlidir. 3D organoids IMMUNO-etiketleme Bodrum matris veya izole ex vivo yetiştirilen kültür yemekleri 2D yetiştirilen hücrelerin daha karmaşık dokudur. Fiksasyon iletişim kuralı hala antikor antigenicity (Yani, antikorlar bağlama epitopları) koruyarak organoids hassas 3D mimari korumak gerekiyor. Örneğin, % 4 paraformaldehyde (PFA) genellikle bir sabitleştirici kullanılır ama nispeten hızlı oyunculuk sabitleştirici ve iyi morfolojik koruma verir iken, bizim deneyim sık antigenicity kaybolmasına ve çoğu için uygun değildir centrosomal antikor. 3D yapılar ve doku nüfuz yeteneği sabitleştirici ve antikorlar da düşünülmelidir. Bu amaçla, biz değiştirdiniz ve doku yalıtım ve dolaylı IMMUNO-3D vitro organoids ve ex vivo etiketleme için gelişmiş protokoller bağırsak dokusu izole. Biz küçük bağırsak kriptalarının ve villus ve kolon doku izole etmek ve 3D organoids yalıtım sabitleme ve IMMUNO-etiketleme Bodrum matris içinde alternatif olarak için bir iletişim kuralı eklemek nasıl açıklar. Biz üç alternatif fiksasyon Protokolü IMMUNO mikrotübüller ve centrosomal proteinler, ninein gibi ve Mikrotubul artı uç izleme proteinler (+ ipuçları), (Ayrıca başvurular8, bkz: EB proteinler ve CLIP-170 gibi etiketleme için mevcut 13). Biz de artılarını ve eksilerini her iletişim kuralıyla ilişkili tartışıyorlar.
Yalıtım bağırsak dokusu
Yalıtım küçük bağırsak kriptalarının ve villus ve kolon kriptalarının Mukozal yüzeyin hücre kişiler, (sallama) ayırma ve Santrifüjü gevşetmek için EDTA çözüm ile tedavi maruz içerir. Sunulan bağırsak villus/crypt yalıtım Protokolü Belshaw vd ve Whitehead ve ark. değiştirildi. 17 , 18
Mukozal yüzey açığa
Bu yordamı gelişiminde bağırsak mukozal yüzeyinde ortaya çıkarmak için yaklaşımlar bir dizi ile tecrübe var. (Ters dönüş) çıkar için klasik bir yaklaşımdır tüpte kesimleri 100 mm uzunluğunda, genelde doku katlayin bir ucunu ve sonra kalan tüp yakalanmış bir metal çubuk kullanarak üzerinde tüp19kaydırdı. Yuvarlatılmış uçları ile metal bir çubuk (2.4 mm çap) fare doku için idealdir. Bu yaklaşım PBS ve EDTA daha iyi erişim sağlayan Mukozal yüzeyin genişleyen yararı vardır. Başlangıçta bu yaklaşım kullanılan ama tüp kesme kısa uzunlukta parçalara (yaklaşık 5 cm) ve bu daha kolay ispat olarak makas diseksiyon ile her bölümünde açmak için taşındı. Eğer sadece birkaç bağırsak gereklidir bu uygun bir yaklaşımdır; Ama eğer daha fazla hayvan were to be bir denemede sonra amaca uygun yapılmış bir aygıt kesme için tüp boyuna, Yoneda ve ark. tarafından açıklandığı gibi kullanılan aç 14 daha verimli olacaktır.
Dekolmanı villus ve kas katmanından kriptalarının
Başlangıçta 3 mM EDTA PBS ve nispeten uzun bir kuluçka zamanlarında 60 dakikaya kadar temel doku17,18Mukozal yüzeyden gevşetmek için kullanılır. Bu konsantrasyon EDTA bir kuluçka süresi 30 dk kriptalarının fare iki nokta üstüste gelen gevşetmek yeterli buldum. Ancak, ince bağırsak crypt/villus yalıtım için verimli bir yaklaşım olduğunu kanıtladı daha kısa bir süre daha yoğun EDTA kullanarak çalıştı. Tüm sonraki çalışma ile ilgili bölümler için villus veya kriptalarının üreten 30 mM EDTA tekniği kullanarak çıkarılan doku yapılmıştır. Kriptalarının, biz normalde havuza alınmış kesirler 3-5 düzeltmeden önce ama zamanlamaları bağlı olacaktır gibi bir dizi faktöre bağırsak boyunca konum gibi fare, iltihap, önceki diyet yaş üzerinde bu uygun kesirler vardır olup olmadığını kontrol etmek önemlidir , vb benzer şekilde, farklı koşullar altında doku etkili olabilmesi için EDTA tedavi sarsılmış gereken süreyi değişebilir. İzole doku kesirler villus kriptalarının veya özellikle de villus veya kriptalarının (Şekil 2) bir karışımı içeren sonucudur. 30 için tüp doku sallayarak, üst üste hiçbir villus olarak crypt ayıklama tek adımda ulaşılabilir olabilir s. Bu kesirler sabit ve immün etiketleme için işlenir.
Bağırsak organoids Bodrum matris işlemleri olan
Organoids Bodrum matris kubbeler üzerinden işlemleri olan hücre kurtarma çözümü kullanarak elde edilebilir. Genellikle bodrum matris ama sıcaklık 2-8 ° c olması gereken depolymerizing tarafından çözüm çalışır Dikkatli bir not dinamik mikrotübüller korunmuş olduğunu. Böylece, dinamik mikrotübüller, immün etiketleme için ve + EBs hücre gibi ipuçları, Bodrum matris fiksasyon önce kurtarma önerilmez. Ancak, mikrotübüller ayırt organoid hücrelerdeki çoğu nispeten istikrarlı ve bunlar (şekil 6) korunduğu görülmüştür. Aynı zamanda iyi IMMUNO-etiketleme için centrosomal ve bileske proteinler hem de hücre işaretleri çalıştı.
Fiksasyon protokolleri
Formaldehit (PFA taze yapılmış) tersinir oluşturur bir nispeten hızlı etkili sabitleştirici çapraz bağlantılar ve % 4 İngiltere’de yılın örnekte mikrotübüller IMMUNO-etiketleme ve gama-tübülin ve Phalloidin ile boyama aktin filamentleri için iyi çalışıyor. Daha İngiltere’de yılın çözümleri gibi İngiltere’de yılın daha yüksek konsantrasyonlarda işe yaramadı iken IMMUNO-Örneğin, etiketleme için iyi ile crypt kök hücre niş içinde kök hücre işaretçileri Lgr5 ve Paneth hücre işaretleyici CD24 çalıştı % 1 oranında seyreltin.
Oxazolidin ilavesi mikrotübüller ve %3.7 PFA, %0.05 oxazolidin ve % 0,5 deterjan PHEMO arabellek (68 mM borular, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA ve 3 mM MgCl2)2 karışımından oluşan sözde PHEMO fiksasyon daha iyi korunması verir mükemmel mikrotübüller korunması antigenicity ödün verir. Bu da IMMUNO-etiketleme gama-tübülin, β-catenin ve E-cadherin ve phalloidin ile boyama aktin filamentleri için iyi çalışıyor. Ancak, 3D doku ve organoid kültürleri, PHEMO fiksasyon tutarsız sonuçlar üretti ve bu nedenle kullanılmamıştır.
Metanol nispeten iyi penetrasyon verir ve antigenicity korumak eğilimi bir koagulant sabitleştirici var. Fiksasyon % 100 metanol (-20 ° C) ile bazı büzülme tanıtır, ılımlı Morfoloji koruma sağlayan ve mikrotübüller, + ipuçları ve ninein 2D hücre kültürlerinde dahil olmak üzere birçok centrosomal antikorlar için çalışır. Ancak, bazı organoids bu fiksasyon yöntemi kullanarak zaman çöktü. Buna ek olarak, tüm kriptalarının, villus veya organoids antikorların penetrasyon başlangıçta bir sorun olduğunu biliyorum ama % 0,1 deterjan yıkama çözüm ve uzun süreli çamaşır ilavesi daha iyi sonuçlar elde.
Formaldehit ve metanol bir kombinasyonu daha önce Rogers ve ark. tarafından kullanılmaya başlanmış 20 IMMUNO-etiket EB1 için Drosophila. Formaldehit bir karışımı bir fiksasyon protokolüne dayalı ve metanol bu nedenle bağırsak dokusu-20 ° C soğuk ama 5 mM Sodyum karbonat Rogers tarafından kullanılan karışım üzerinden atlama % 3 formaldehit ve % 97’si metanol dayalı organoids için geliştirilmiş ve ark. 20 -20 ° C’de dondurucuda Ayrıca, örnekleri düzeltildi Bu amele özellikle immün etiketleme için iyi + ipuçları, küçük-170 ve EBs gibi ama aynı zamanda sabitleme ve immün etiketleme mikrotübüller ve aktin içinde doku ve 3D organoids için mükemmel oldu. Çok iyi Yapısal koruma belirgin ve ninein için etiketleme daha tutarlı bir şekilde metanol ile çalışabiliyordu antigenicity gama-tübülin ve ninein, gibi centrosomal proteinler yanı sıra birkaç hücre iskeleti ve ilişkili proteinler için korundu fiksasyon.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Paul Thomas mikroskop tavsiye ve yardım için teşekkür ederiz. Bu eser burada yer BBSRC tarafından desteklenmiştir (Hayır verin. M.M.M. ve tw bb/J009040/1).
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | washing and PFA |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | isolate organoids |
lobind microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30108116 | prevent cells sticking |
0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | Sigma | 03690-100ML | Crypt isolation |
70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 11517532 | Isolate crypts from villi |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | detergent |
goat serum | Sigma | G6767 | blocking agent |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | used as non-stick agent | |
Paraformaldehyde, 4% in PBS | Alfa Aesar | J61899 | fixative |
Formaldehyde solution (36.5–38% in H2O) | Sigma | F8775 | used as fixative |
Methanol 99.9% Analytical grade | Fisher | M/4000/17 | used as fixative |
MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit | Maxvision Biosciences |
MF01-S | commercial immunofluorescence kit; to reduce non-specific labelling |
Rotator SB2 or SB3 | Stuart | microcentrifuge tube rotator | |
Sodium citrate | antigen retrieval | ||
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | mountant |
DABCO – 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802 | anti-fade agent |
Permanent Positive Charged, Pre-Washed, 90 Degree Ground Edges | Clarity | N/C366 | slides |
Glass coverslip – thickness no. 1, 22 x 50 mm | Clarity | NQS13/2250 | coverslips |
Matrigel | Corning | 356231 | Basement matrix for 3D organoid culture |
50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | for processing tissue/organoids |
15 mL conical tubes | Sarstedt | 62.554.502 | for processing tissue/organoids |
1.5 mL LoBind tubes | Eppendorf | 30108051 | for isolated organoids |
Mouse monoclonal anti-E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610181 | primary antibody 1:500 |
Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 antibody | Abcam | ab6160 | primary antibody 1:100 |
Rabbit alpha-tubulin antibody | Abcam | ab15246 | primary antibody 1:100 |
Rabbit anti-beta-actin antibody | Abcam | ab8227 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal anti-p150Glued antibody | BD Bioscience | 610473/4 | primary antibody 1:100 |
Rat monoclonal EB3KT36 antibody | Abcam | ab53360 | primary antibody 1:200 |
Mouse monoclonal EB1 antibody | BD Bioscience | 610535 | primary antibody 1:200 |
Rabbit anti-Lgr5 antibody | Abgent | AP2745d | primary antibody 1:100 |
Dylight anti-rat 488 | Jackson | 112545167 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-mouse 488 | Jackson | ST115545166 | seconday antibody 1:400 |
Dylight anti-rabbit 647 | Jackson | 111605144 | seconday antibody 1:400 |