Summary
Instilação transuretral é um procedimento desafiador e não tem sido bem descrita na literatura. O objetivo deste manuscrito é descrever uma técnica transuretral inserção de um cateter para entrega intravesical de líquidos com substâncias activas para a bexiga urinária e/ou próstata em ratos machos adultos.
Abstract
Transuretral instilação pode ser usada para entregar soluções diferentes com ingredientes ativos (por exemplo, drogas, produtos químicos, bactérias e vírus) localmente em bexiga urinária para induzir a modelos animais de patologias de bexiga ou avaliar o eficácia dos tratamentos intravesicais. Mais roedores modelos de patologias inferiores do trato urinário (LUT) são induzidos em ratos fêmeas devido à facilidade de instilação intravesical das substâncias através da uretra feminina. No entanto, devido a diferenças anatômicas entre o feminino e masculino LUT, transuretral instilação em um rato masculino foi considerada um procedimento muito desafiador, e não foi previamente descrito. Neste manuscrito, nós fornecemos uma descrição detalhada de como preparar tubos de polietileno (PE) para posterior inserção na uretra de um rato masculino. Além disso, discutimos os tipos ideais de tubos de PE para ser usada dependendo do local desejado da inoculação. Além disso, descrevemos como preparar um animal para uma bem sucedida instilação transuretral evitar danos à uretra e assegurar a entrega da solução para o local desejado para o ponto por ponto. O procedimento é iniciado por retrair o prepúcio e glande para expor a abertura do meato uretral. Em seguida, a glande são agarrados pela contundente fórceps não-esmagamento para estabilizar o pênis e os tubos de PE. A tubagem de PE primeiro é inserida no meato uretral paralelo ao organismo animal e, em seguida, seu ângulo é ajustado pela inclinação do cateter para manobrá-lo para acompanhar a curvatura natural da uretra. Esta técnica pode ser usada para modelos murino induzidos de patologias de bexiga e/ou avaliar a eficácia dos tratamentos intravesical em ratos masculinos.
Introduction
A abordagem de instilação transuretral tem sido usada em estudos anteriores como um dos métodos para criar modelos de roedores de bexiga patologias1,2,3,4 e pode ser usada para avaliar a eficácia dos tratamentos entregues localmente em camundongos. Embora modelos animais totalmente não podem recapitular a patologias humanas, identificação dos mecanismos subjacentes em estudos com animais fornece um melhor entendimento dos transtornos LUT humanos tais como a síndrome de dor cistite intersticial/bexiga, neurogênica cistite, doença auto-imune e cistite inflamação prostática5.
O procedimento de instilação transuretral realizado em um rato macho adulto é tecnicamente mais difíceis de instilação intravesical em um rato adulto feminino6. Anatomia da uretra masculina junto com seu pequeno diâmetro naturalmente curvada dificultar tecnicamente realizar a inserção de um cateter transuretral. Portanto, instruções pormenorizadas para a indução transuretral de rato de infecção do trato urinário6 e LUT inflamação7,8,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 via cateter inserido na bexiga foram descritas anteriormente para ratos fêmeas somente. Este manuscrito visa fornecer uma descrição passo a passo da técnica para transuretral instilação de substâncias nos ratos masculinos, incluindo os clipes de vídeo, imagens e ilustrações. Instilação transuretral procedimentos em um rato adulto masculino podem ser realizados com variável inocula semelhante à anteriormente descrita no rato fêmea7 e fundiu-se com técnicas adicionais tais como gravações de Eletromiografia de respostas visceromotor (VMR)16.
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Protocol
todos os procedimentos com animais, incluindo o método e a duração da anestesia, bem como os cuidados pós-operatórios, foram discutidos com um veterinário e aprovados pelos cuidados institucionais do Animal e uso Comité (IACUC) na instituição afiliada. Neste manuscrito, todos os procedimentos foram realizados com 8 para camundongos machos de 15 semanas C57BL/6 e o protocolo segue as diretrizes de cuidado animal, aprovadas pelo IACUC da Universidade do Colorado.
1. preparação da tubulação
Nota: para incutir o inóculo, uma agulha anexado para o tubo de polietileno (PE) ( figura 1A) e um de pequeno calibre (< 24 G) angiocatheter pode ser usado ( a Figura 1). O uso de um angiocatheter não exige nenhuma preparação diferente de esterilização com 70% de etanol (EtOH). O inóculo é a substância que é instilado/injetado/depositado no tracto urinário. Isso pode ser uma solução que contém bactérias, vírus ou uma substância química. Isto é preparado antes do tempo e pelo protocolo de pesquisa. Por exemplo, se o estudo visa avaliar os efeitos da Escherichia coli infecção no trato urinário inferior, o pesquisador precisará preparar o inóculo contendo bactérias, que podem ser inoculadas/instilado no trato urinário inferior.
- Preparação da agulha anexada à tubagem de PE é simples e consiste no seguinte: escolha o tamanho da tubulação do PE baseada o órgão-alvo e a idade de um animal. Para um animal mais jovem do que 12 semanas, usar tubos de PE-10 (diâmetro externo é de 0,024 polegadas e diâmetro interior é 0,011 polegadas). Tubagem de PE-10 é sugerida para ser aplicáveis para (1) a semeadura primária de inóculo na próstata anterior (AP) e vesículas seminais (SV), ou (2) a semeadura primária de inóculo na bexiga de um animal mais jovem do que 12 semanas de idade. Tubos de PE com um diâmetro maior do tamanho 50 PE (diâmetro exterior até 0,038 polegadas e diâmetro até 0,023 polegadas interno) pode ser usado para a semeadura primária de inóculo na bexiga dos animais mais velhos até.
- Cortar aproximadamente 2,5 polegadas de tubo PE.
- Selecione uma agulha que vai caber o diâmetro PE selecionado para ser usado. Uma agulha 27G pode caber no lúmen do tubo de PE-10, e uma agulha 22g se encaixa o lúmen do tubo de PE-50.
- Prepare a agulha antes da inserção para o tubo de PE, esfregando a ponta afiada da agulha sobre uma pedra de óleo comercialmente disponíveis ( figura 1A -B) para torná-lo maçante ou use um blunt comercialmente disponível agulha.
- Introduzir a agulha ( Figura 1) o lúmen do tubo de PE. Evite danos para o lúmen ou a entrada em um falso lúmen, assegurando o agulha permanece no centro do lúmen. ( Figura 1 -E). Se os tubos de PE é danificado durante a inserção da agulha maçante, corte a extremidade danificada e reiniciar o processo.
- Coloque os tubos de PE conectados a agulha em 70% de EtOH para esterilização até seu uso para o procedimento. Resplendor a 70% EtOH através do tubo da agulha-PE para esterilizar o lúmen e assegurar lá não é nenhum escapamento da tubagem PE de danos durante o processo de inserção da agulha. Se houver vazamento, descartado o tubo de agulha-PE.
Nota: A ponta do tubo de PE precisa ser suave antes da cateterização. Para evitar problemas com a introdução do tubo de PE na uretra, recomenda-se cortar a ponta do tubo de PE imediatamente antes da cateterização ( Figura 1F). O comprimento mínimo sugerido da tubulação do PE é de 1,5 polegadas, que inclui a parte ao redor da agulha.
2. Procedimento de cateterização
- antes da indução da anestesia, esvaziar a bexiga de mouse.
- Aplique uma pressão suave e massagem no abdômen inferior do mouse. Estas manobras normalmente levam a micção espontânea. A bexiga cheia pode resultar na diluição ou vazamento imediato qualquer inóculo inculcado.
Nota: Uma opção adicional para garantir uma bexiga vazia em um rato é privar o animal de água pelo menos 1 hora antes do início do procedimento transuretral instilação. Privação de água deve ser aprovada pela instituição como parte do protocolo animal.
- Aplique uma pressão suave e massagem no abdômen inferior do mouse. Estas manobras normalmente levam a micção espontânea. A bexiga cheia pode resultar na diluição ou vazamento imediato qualquer inóculo inculcado.
- Usar uma máquina de anestesia com isoflurano fluxo (2%) para induzir anestesia.
- Uma vez que o animal é anestesiado, coloque-o sobre um cobertor quente e cubra-o com uma almofada azul com seu nariz dentro de um cone de nariz para a manutenção da anestesia contínua.
- Confirmar que o animal está sob anestesia, verificando o reflexo pedal (pitada de dedo do pé).
- Uma vez que o reflexo do pedal está ausente, proceder de retrair o prepúcio.
- Imprensa região pubiana com o polegar e o dedo indicador de uma mão ( figuras 2A e 2B) e puxe para fora o pénis de glândulas usando o dedo polegar e indicador do outro (de mão a Figura 2). Quando isso é feito corretamente, o prepúcio, glande e corpo do pênis permanecem expostas. ( Figura 2D e Figura 2F). Não use pinça para retirar o pênis de glândulas como isto irá resultar em danos ao tecido.
- Lubrifique a ponta do cateter e a glande com lubrificante cirúrgico estéril antes da inserção do cateter. Isto irá facilitar a inserção do tubo de PE.
Nota: Embaladas individualmente praças de lubrificante cirúrgico, em vez de um tubo grande, são recomendadas para cada uso manter condições estéreis. - Pressione cuidadosamente a ponta do pênis usando fórceps maçante e apertar suavemente a glande para causar o meato uretral abrir.
- Segurar a seringa com a agulha PE-tubulação ou com conexão PE tubulação própria e inserir os tubos de PE através do meato uretral.
Nota: Um aperto de tripé da seringa com agulha-anexado PE-tubulação ou o PE tubos si mesma usando o polegar, dedos indicador e médio é recomendado para estabilidade.
Nota: O caminho do cateterismo deve ser curvado devido a curvatura natural da uretra rodeada pela glande e corpo do pênis no rato adulto masculino, como mostrado na Figura 3A e Figura 3B. A tubagem de PE catheterized pode encontrar resistência durante o cateterismo, portanto, é recomendável ajustar o ângulo inclinando o tubo de cima ou para baixo para ajuda avanço da tubulação do PE na sequência o órgão-alvo. Se necessário, os tubos de PE podem ser girado ligeiramente para ajudar a manobrar através de várias curvas da uretra. Quando há muita resistência, o tubo deve ser puxado para trás e em seguida, avançar novamente com pressão mínima. Puxando o PE-tubo para fora completamente e usar mais lubrificação pode ser útil. - Executar a instilação do inóculo, uma vez que o PE-tubo alcançou o órgão desejado, empurrando o êmbolo de agulha para incutir o volume desejado do inóculo (volume de 5-200 µ l é sugerido).
- Para instilação do inóculo para a bexiga urinária, avançar o tubo de PE até aproximadamente 0,75 polegadas de tubo de PE está inserida ( Figura 3A).
Nota: para instilação do inóculo no AP e SV, geralmente, thtubulação e inserido encontra resistência quando atingir o ponto de abertura para a próstata anterior. Ajustando o ângulo inclinando o tubo de cima ou para baixo, os tubos de PE vão avançar ainda mais até que aproximadamente 1 polegada de tubo PE foi inserido ( Figura 3B).
- Para instilação do inóculo para a bexiga urinária, avançar o tubo de PE até aproximadamente 0,75 polegadas de tubo de PE está inserida ( Figura 3A).
3. Na Vivo Imagem do trato urinário inferior e rins
Nota: O propósito da imagem latente na vivo neste manuscrito é: (1) para confirmar a localização espacial do inóculo; e (2) avaliar a incidência de refluxo do inóculo para o rins. Para este efeito, pode ser usado qualquer um rato anestesiado ou sacrificado.
- Para visualizar o trato urinário inferior de um rato adulto masculino, realizar laparotomia de linha média abdominal inferior para expor a bexiga, próstata e vesículas seminais.
- Faça uma incisão na pele na linha média do osso púbico até um pouco abaixo do processo xifoide, usando tesouras.
- Elevar a pele de tecido celular subcutâneo.
- Identificar o avascular linea alba localizado na linha média e incise isto para entrar na cavidade peritoneal onde todos os órgãos estão localizados.
- Confirmar a localização espacial pela visualização de corante azul ou outro agente de rastreamento adequado.
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Representative Results
Instilação transuretral de corante azul através de tubos de PE 50 resultou em instilação do corante para a bexiga urinária (Figura 4A) e através de tubos de PE 10 na colorização da SV e AP (Figura 4B), respectivamente. Para avaliar se a instilação transuretral realizada provoca um refluxo instantâneo do inóculo para os rins ou não, o rim e ureter foram observadas seguido por instilação de 100 µ l do corante azul e tintura fluorescente (Figura 4A-B). Nenhum do procedimento instilação usando dois diferentes tamanhos de tubos de PE e dois corantes diferentes resultou em colorização dos ureteres ou rins.
Figura 1: Preparação para inserção em polietileno (PE) tubo 50 de agulha 22 G. A agulha afiada (A) é moída contra uma pedra de óleo (B) para aliviar as bordas afiadas (C). Uma vez que a agulha é maçante, a agulha é inserida no lúmen da tubulação do PE (D) e avançada sobre a agulha com a pinça fina (E). A tubulação é, em seguida, corte a cerca de 1,5 polegadas (F). 24G angiocath (G) também pode ser usado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O prepúcio masculino do mouse cobre a glande e meato uretral (A), com leve tração do prepúcio, a glande pode ser exposto (B), e com ligeira tração da glande (C), o prepúcio inteiro pode ser retraído (D), assim permitindo fácil acesso para o meato uretral e uretra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ilustrações de órgãos de trato urinário inferiores; bexiga urinária, próstata e vesícula seminal (SV), mostrando a instilação transuretral usando tubos PE 50 (A) e tubos de PE 10 (B) para semeadura primária da bexiga e próstata SV/anterior, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens dos órgãos do trato urinário superior e inferior; rins, bexiga, próstata e vesícula seminal (SV), após a instilação transuretral usando tubos PE 50 (A) e tubos de PE 10 (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este manuscrito descreve detalhadamente um método de instilação transuretral no rato adulto masculino. Diferencial área de semeadura primária pode ser alcançada por meio de tubos de PE de diâmetros diferentes. PE-50 é recomendado para alcançar com êxito o lúmen da bexiga urinária, enquanto um diâmetro superior que PE-10 é usado para alcançar o AP e SV (Figura 3A-B). A escolha do tamanho do órgão-alvo para inoculação e tubo de PE, além de outros fatores, tais como o volume de inóculo inculcado, também desempenham um papel na localização final e distribuição da solução. Nossos experimentos demonstram que instilação transuretral de 100 µ l de azul tingir usando qualquer PE-10 ou PE-50 não aciona o refluxo instantâneo da tintura para os rins. No entanto, o refluxo da urina para os rins pode acontecer durante o período pós instilação e pode resultar em infecção renal, como foi mostrado anteriormente em ratos fêmeas adultas8. Portanto, a avaliação histológica dos rins é altamente recomendada para confirmar a ausência de contaminação indirecta dos rins de instillations transuretral.
Existem várias etapas-chave importantes para realizar uma bem sucedida transuretral instilação do inóculo. Primeiro, a tubulação do PE deve ser de comprimento suficiente — pelo menos de 2,5 polegadas. Isto permitiria ajustes adicionais do comprimento do tubo, se necessário, durante o processo de preparação da tubulação, ou após o processo de instilação transuretral. Várias tentativas e falhas durante a etapa 9 do presente protocolo podem causar um bloqueio do fim do tubo de PE inserido por fluidos corporais. Nesta situação, a ponta do tubo de PE deve ser cortada para ter uma dica clara para as tentativas subsequentes. Uma vez cortada a ponta do tubo de PE, o lubrificante cirúrgico deve ser reaplicado. Em segundo lugar, uma aderência adequada da seringa ou PE tubulação própria aumenta a taxa de sucesso. Em terceiro lugar, deve ser inserido um comprimento suficiente da tubulação do PE e do prepúcio, glande e corpo do pênis devem ser rigidamente alinhados sem aperto de mão durante o processo de cateterismo. Caso contrário, o refluxo do inóculo pode acontecer quando o êmbolo da seringa é empurrado.
Melhores resultados para o procedimento transuretral instilação podem ser resultado de prática acompanhada, evitando danos ao órgão uretra e alvo durante o procedimento. Resultados de desempenho podem ser validados usando corantes coloridos ou corantes fluorescentes como o procedimento para confirmar a localização primária do inóculo e sinais de refluxo para os rins.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores não têm qualquer reconhecimentos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 10 | BD Medical | 63019-004 | |
| BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 50 | BD Medical | 63019-048 | |
| BD Insyte-N Autoguard/ Angiocath | BD Medical | 311411 | |
| Ethanol (EtOH) | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| BD Needle Only 22 Gauge (G) 1 inch | Becton Dickson | 205155 | |
| BD Needle Only 27 Gauge (G) 1/2 inch | Becton Dickson | 305129 | |
| Luer stub, 22 G X 0.5 in / Blunt Needle | Instech | LS22 | |
| Luer stub, 27 G X 0.5 in / Blunt Needle | Instech | LS27 | |
| 6" Long x 2" Wide x 1" Thick, Aluminum Oxide Sharpening Stone / Oil Stone | Norton | 40204034 | |
| Surgical Lubricant Sterile Bacteriostatic Folilpac | Surgilube | 281020543 | |
| Isoflurane | Fluriso | 13985-528-60 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Dissecting Forceps, Curved | vwr | 82027-392 | |
| BD 1 ml Syringe | BD Medical | 309626 | |
| India Ink Solution., 0.2% in PBS buffer | Alfa Aesar | J61007 | |
| 8~12 weeks old male C57B/6 Mice | Jackson Lab | #000664 |
References
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