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Immunology and Infection

유방암에서 HER2 유전자 증폭의이 질을 평가 하기 위해 높은 처리량 검열 플랫폼을 구축

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

HER2 양성 세포의 다른 유형의 배포 유방암의 하위 집합에서 관찰 될 수 있다 고 임상 딜레마를 생성 합니다. 여기, 정의 계량, HER2 내부 종양 유전자이 heterogeneously 처리 유방암의 큰 시리즈에 비교 하는 안정적이 고 비용 효율적인 프로토콜을 소개 합니다.

Abstract

인간 표 피 성장 인자 수용 체 2 (HER2)에 대 한 표적으로 한 치료 HER2-양성 유방암 환자의 결과 근본적으로 변경. 그러나,의 경우 소수 주요 임상 과제 생성 HER2 양성 세포의 유형이 다른 분포를 표시 합니다. 날짜 하려면, 특성화 및 큰 동료에서 HER2 이기종 유전자 증폭의 정량화에 더 안정적이 고 표준화 된 프로토콜 제안 되었습니다. 여기, 우리는 동시에 여러 개의 유방암의 다른 지형 지역에 걸쳐 HER2 상태를 평가 하는 높은 처리량 방법 제시. 특히, 우리는 향상 된 조직 microarrays (TMAs) 종양의 대상된 매핑 통합을 구성 하는 실험실 절차를 설명 합니다. 모든 TMA 매개 변수는은 제자리에서 교 잡 (SISH)의 포 르 말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 유 방 조직에 대 한 특별히 최적화 되었습니다 했습니다. (, ER, PR, Ki67, 그리고 HER2) 전조 및 예측 생체의 Immunohistochemical 분석 자동화 된 절차를 사용 하 여 수행 되어야 한다. 사용자 지정된 SISH 프로토콜은 다른 고정, 처리 및 저장 프로시저를 받았다 여러 조직에 걸쳐 높은-품질 분자 분석을 수 있도록 구현 되었습니다. 이 연구에서 우리는 증거--방침의 특정 DNA 시퀀스 heterogeneously 처리 되 고 여러 가지 지형 영역에 동시에 지역화 된 유방암 효율적이 고 비용 효율적인 방법을 사용 하 여 수를 제공 합니다.

Introduction

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HER2 proto-oncogene overexpressed 이며 모든 침략 적인 유 방 암1,2의 15-30%에서 증폭 이다. HER2 overexpression의 존재에 의해 유추 됩니다 > 얼룩 (3 +), 유전자 증폭 HER2/centromere 비율은 ≥2 또는 유전자 복사 번호는 ≥6 때 평가 될 수 있다 동안에 계산에 강한 막 immunohistochemical (IHC)와 10%의 셀 제자리 교 잡 (ISH)3에 의해 최소 20 셀.

내부 종양 유전자이 바이오 마커의 평가 및 치료 응답4잠재적으로 불리 한 기여자 되 고 유방암에서 널리 설명 되었습니다. 에 따르면 대학의 미국 병리학 자 (모자), HER2 이종 존재 HER2 에 증폭 하는 경우 > 5%와 < 종양 침투의 50% 세포5. 유감 스럽게도, 유방암에서 HER2 공간이 성분의 실제 발생률 남아 병리학 사이 논쟁의 주제, 몇몇 저자는 유지 그것은 대단히 드문 이벤트와 최대를 제안 하는 다른 경우의 40%는 HER2 이기종1,5,6,7,8,,910. 이 상태를 지탱 하는 생물 학적 메커니즘에도 불구 하 고는 하지 아직 완전히 명백 하 게, 내부 종양 HER2 이종의 전조 및 임상에 미치는 영향은 유 방 암 환자11에 대 한 중요 한.

최근, 밝은 분야 분자 기술이, 발 틱 (CISH) 실버 틱 (SISH), 형광 분 (물고기)12에 비해 몇 가지 장점을 함께 FFPE 직물에서 HER2이 감지 하는 신뢰할 수 있는 방법으로 등장 했습니다. 유감 스럽게도, 단일 경우의 대량 분석 대형 코 호트 연구에서 허무 남아 있습니다. 여러 그룹 histochemistry, IHC와 ISH TMA 기술과 조합 수 암 생물학13,14,,1516의 연구에 귀중 한 전략을 나타내는 제안 했다. 이 널리 채택 된 방법으로 다른 환자에서 조직 샘플 분석할 수 있습니다 동시에, 조직 및 고용 하 고 그로 인하여 경우14의 큰 시리즈의 유니폼 분석을 육성 시 약을 최소화. 그러나, 아무 프로토콜 다른 처리 시 약, 고정 배, 및 고용, 같은 보존 방법으로 보관을 받았다 여러 조직 샘플 동시 처리량이 높은 분자 특성에 대 한 사용할 수 있습니다. 블록입니다.

유방암에서 HER2 공간이 성분의 전조와 임상 의미를 감안할 때, 우리 heterogeneously 처리 경우의 큰 시리즈에 그것을 평가 하는 통합된 분자 플랫폼을 개발 했다. 여기, 우리는 생성 하 고 SISH 통해 유방암의 높은 수율 TMAs에 HER2 증폭의 내 종양이 분석 실험실 전략 묘사. 다음 프로토콜은 측정 하는 종양에 대 한 개발 되었습니다 > 5 m m (> TNM 2017에 따르면 pT1b)17. 작은 병 변, 탈모 직렬 섹션에 분석을 수행 하는 것이 좋습니다. 우리의 절차 각각의 경우에 대 한 6 가지 영역 (범위 4-8)의 의미를 포괄 최대 30 유방암의 동시 IHC 및 SISH 분석 할 수 있습니다. 모두 180 조직 코어 직경, 코어, 그리고 그리드 가장자리 사이 2 밀리미터 사이 500 µ m에서에서 1 m m의 각 TMA 블록에 대해 생성 됩니다.

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Protocol

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이 연구는 IRCCS Ca에서 제도적 검토 보드에 의해 승인 되었다 ' Granda 재단, 폴 병원, 밀라노, 이탈리아.

1입니다. 다양 한 환자와 조직 표본

  1. 모든 제공 되며 고 오신 (H & E) 및 원래 진단에서 IHC 슬라이드 포함 하 여 분석, 모든 경우의 보관 슬라이드를 검색 하 고, 있으면, 하나의 H & E의 일치 비 종양 약 유 방 조직 (예를 들어, 수술 여백) .
  2. 케이스 검토를 수행 합니다.
    참고:이 작업에 대 한 유 방 병 리에 경험을 가진 적어도 2 명의 병리학 진단 슬라이드 토론 고 해야 collegially 불일치를 해결 합니다. 사용 하 여 기존의 현미경 또는 telepathology 도구 (선호 multicentric 연구에서 후자). 경우, 모든 귀에 거슬리는 경우를 제외 합니다.
    1. 18유 방 종양의 세계 보건 기구 (WHO) 분류의 최신 버전에 따라 모든 경우의 조직학 재분류를 수행 합니다.
    2. 그 각각의 경우에 정상적인 조직을 보관 임상 샘플에 존재 하는 경우 구성 하나 이상의 종양 약 비 터미널 ductal lobular 단위를 확인 하십시오.
    3. 표시 유형이 다른 모든 종양 약 영역 식별 cytological, 건축, 또는 IHC 기능 (공동으로 수행 하는 병리학 자 고 누구는 TMAs를 건설할 것 이다 technician(s)) 밝은 분야 현미경을 사용 하 여.
  3. 유리 슬라이드에 표시와 함께 또는 디지털 슬라이드 소프트웨어 (그림 1A)에 적절 한 도구와 개별 지형 영역을 강조 표시 합니다.
  4. 선택한 슬라이드에 따라 달라 집니다, 보관 함에서 해당 FFPE 블록을 검색 합니다.
    참고: TMA를 최적화 하기 위해 건설, 조직 소모를 방지 하 고 보존 TMA 펀치 구조적 무결성, 경우 < 1 mm 두께 잔여 조직을 제외 해야 합니다.

2. 설계 및 TMAs Kononen 기술에 기반을 구축합니다

  1. 만들기 각 케이스의 고유 영역의 레코드를 통합 새 스프레드시트 파일을 엽니다. 표 1에 exemplified 별도 열에 다음 데이터를 포함: 사례 ID, 블록 ID, 지역 ID, 조직 유형 (, 정상 조직, 침략 적 구성 요소 histotype, 제자리에서 구성 요소 histotype), 지형 (예를 들면, 종양 코어, 침략 앞), 형태 (예를 들면, 핵 학년, 건축, mitoses, cytological 기능), 생체 상태 (, 에스트로겐 수용 체 (ER), 황 체 호르몬 수용 체 (홍보), Ki67, 그리고 HER2), 그리고 사용할 수 있는 모든 다른 IHC 기능.
    1. 문서를 저장 합니다.
  2. TMA 프로젝트를 만듭니다.
    1. 설치 하 고 TMA 디자이너 소프트웨어를 엽니다.
    2. TMA 받는 블럭과 정의: 파일 메뉴를 통해 액세스 > 새로 만들기 > 블록 또는 CTRL + B를 사용 하 여
    3. 첫 번째 필드 채우기 또는 Tab 키를 누르고 파라핀 블록의 치수 입력를 클릭: 폭 35 (mm), 높이 20 (mm). "여백" 값 (, 파라핀 지 m m에서에서 거리)으로 "2" 형 (그림 1B). 적절 한 버튼을 클릭 하 여 데이터를 저장 합니다. 받는 사람 블록의 새 서식 파일 지금 저장 고 새로운 조직 배열 서식 파일에서 사용할 준비가.
    4. 조직 배열 프로젝트 만들기: 파일 메뉴에 액세스 > 새로운 > 조직 배열 또는 CTRL + t.를 사용 하 여
    5. 조직 배열, 의견, 및 저자, 이름 입력 후 다음 클릭 합니다 "." "가져오기" 아이콘을 클릭 합니다 받는 사람 블록 이전에 만든 서식 파일을 선택 하 고 클릭 합니다 "."
    6. 라운드 단추를 클릭 하 여 자리 크기 1 mm를 선택 합니다. 인근 관광 명소의 2 개의 센터 사이 공간이 자리 간격으로 500 µ m를 선택 합니다. 231 되어야 계산기 아이콘 생성, 관광 명소의 총 수를 계산을 클릭 합니다. 클릭 "다음."
    7. 그것을 한 번 클릭 하 여 자리 번호 모드를 정의 합니다. 버튼을 클릭 "정의" 격자 및 하위 표를 만들려고 합니다. 중앙 선 (6 선) 삭제와 8과 15 열. 방향에 대 한 1 번 줄의 3 명소를 유지 합니다. 그림 2에 표시 최종 지도 183 명소의 총 수를 포괄 한다.
    8. 조직 유형 목록 정의: 파일 메뉴를 통해 액세스 > 새로운 > 조직 유형 또는 CTRL + l.를 사용 하 여 목록
    9. 이전에 정의 된 조직 설명을 삽입 합니다. 아래쪽 화살표를 누르거나 클릭 합니다 + 선 추가 버튼을.
    10. 프로젝트 정의: 파일 메뉴를 통해 액세스 > 새로 만들기 > 부스터 프로젝트 또는 CTRL + p.를 사용 하 여
    11. 조직 배열, 의견, 및 저자, 이름 입력 후 다음 클릭 합니다 "." 스프레드시트 파일, 조직 형식의 목록 및 이전에 적절 한 아이콘을 클릭 하 여 만든 조직 배열 모델을 가져옵니다.
    12. "모두 선택"을 클릭 하 고 각 조직 유형;에 대 한 관광 명소의 수 정의 설정을 적용 하려면 "검색" 버튼 클릭 합니다. 샘플링 되 고이 프로젝트에 있는 받는 사람 블록 전송 되는 코어의 총 수를 나열 하는 테이블에 표시 됩니다. 프로젝트를 저장 하 고 프로그램을 닫습니다.
  3. 수락자 블럭과 (그림 1B)를 준비 합니다.
    1. 65 ° c.에 elasticized 파라핀 정화 금속 금형 채우기
    2. 금속 금형 내부 하룻밤 실 온에서 냉각 파라핀 블록을 둡니다.
    3. 금속 금형에서 파라핀 블록을 추출 합니다. 균열 발생, 블록을 취소 하 고 단계 2.3.1-2.3.3를 반복 합니다.
  4. TMA는 자동 또는 반자동 arrayer19를 사용 하 여 구성 합니다.
    1. 선택한 모든 FFPE 블록과 주석으로 해당 H & E 섹션을 검색 합니다.
    2. 켜고는 arrayer arrayer 회전 목마에 수락자 블럭과 삽입.
    3. Arrayer 제어 역 소프트웨어를 열고, "새로운 조직 배열"에 클릭 하 고 이전에 만든 프로젝트 (그림 1C)를 로드.
    4. "계속"을 클릭 하 고 메뉴에서 기증자 블럭과의 위치를 선택 합니다.
    5. 각 받는 사람 블록에 시작 하는 위치 정의: 화살표 키를 사용 하 여 레이저 빛을 이동 하 고 받는 사람 블록의 파라핀에 왼쪽 가장자리 정렬.
    6. "다음"을 클릭 하 고 세로 맞춤에 대 한 반복 합니다.
    7. "다음" 자동으로 받는 (수락자) 블록의 이전에 정의 된 좌표에 구멍을 만들기를 클릭 합니다.
    8. 빈 펀치.
    9. 샘플링에 대 한 기증자 블록 놓고 관심의 이전 주석된 영역에서 조직 핵심을 제거 합니다.
    10. 받는 사람 (수락자) 블록에 구멍에 기증자 조직 코어를 삽입 합니다.
    11. arrayer에서 기증자 블록을 제거 합니다.
    12. TMA를 완료 될 때까지 2.4.5-2.4.11 단계를 반복 합니다.
  5. 살 균 빈 슬라이드에 새로 생성 된 TMA 블록의 조직 쪽을 넣고 5 분 동안 45 ° C에서 실험실 오븐에 넣어.
  6. 부드럽게 5 슬라이드에 블록을 누르십시오 s 조직 코어를 평평 하 게. 총 2 회) (한 번 반복 합니다.
  7. 오븐에서 슬라이드와 TMA 블록을 제거 하 고 뒤집고, 부드럽게 슬라이드에서 블록을 분리.
  8. 65 ° c.에 elasticized 파라핀의 얇은 층으로 TMA 조직 표면
  9. TMA 블록을 2 h에 대 한 실 온에 둡니다.
  10. 24 h 4 ° C에서 TMA 블록을 전송 합니다.
    참고: TMA 블록 저장할 수 있습니다 4 ° C에 피로까지.

3. 조직화 학적인 및 Immunohistochemical 분석

  1. TMA 섹션을 잘라.
    1. 파라핀 진정 10 분-10 ° C 표면에 파라핀 사이드와 TMA 수락자 블럭과 내려 놓습니다.
    2. 초순에 채워 부양 목욕 고 열 38 ° c.에 설정
    3. 새로운 블레이드를 회전 톰에 놓고 왁 스 블록 블레이드 얼굴과 수직 평면에 정렬 있도록 톰 척에 블록을 삽입 합니다.
    4. 블레이드와 블록을 신중 하 게 접근 하 고 되도록 위치 정확한; 몇 얇은 섹션을 잘라 필요한 경우 조정 합니다.
    5. 3 µ m 두께 섹션을 잘라.
    6. 핀셋을 사용 하 여 섹션을 선택 하 고 목욕 물 표면에 떠.
    7. 일반 및 IHC/분 유리 슬라이드에 물 탕 밖으로 섹션을 선택 하십시오.
    8. 슬라이드를 선반에 놓고 하룻밤 45 ° c 오븐에서 그들을 저장 합니다.
      참고: 일단 준비, TMA 섹션 24 시간 이내 스테인드 해야 합니다.
  2. 조직화 학적인 얼룩 (H & E) 수행 된 autostainer를 사용 하 여.
    1. Autostainer 선반에 슬라이드를 삽입 하 고 10 분 동안 60 ° C에 그들을 배치.
    2. Autostainer와 TMA와 선반 바깥쪽에 직면 하는 표준 H & E 클립으로 로드 스테이션 중 하나에 슬라이드 삽입의 부하 서랍을 엽니다.
    3. 일단 서랍, 시스템에서 자동으로 클립을 인식 닫히고 다음 프로토콜 시작 됩니다: 오븐 역에서 37 ° C (6 분), 크 실 렌 (2 분), 크 실 렌 (2 분), 에탄올 100% (2 분), 에탄올 100% (2 분), 에탄올 95% (2 분), 에탄올 95% (2 분) 증 류 물 (4 분), Carazzi의 되며 (9 분), 저압 흐르는 물 (2 분), 오신 1% (1 분), 저압 흐르는 물 (2 분), 에탄올 95% (20 s), 에탄올 95% (20 s), 에탄올 95% (20 s), 에탄올 95% (20 s), 에탄올 100% (15 s), 에탄올 100% (15 s) 크 실 렌 (30 s), 크 실 렌 (30 s).
    4. 서랍에서 선반을 언로 드 하 고 탑재와 커버 슬립 슬라이드.
      1. 마운트는 피 펫의 한 방울을 수집 하 고 커버 슬라이드의 외부 가장자리에 그것을 넣어.
      2. 슬라이드에 커버 슬립의 젖은 측면을 놓고 산 30 분 동안 건조 하자.
  3. IHC ER, PR, Ki67, HER2 얼룩 수행 자동화 된 immunostainer를 사용 하 여.
    참고: 얼룩 실행을 시작 하기 전에 시스템, 시작 및 확인 소모품 시 약 병 (자료 테이블) 하 고 컨테이너를 낭비.
    1. 10 분 동안 60 ° C에서 분석 TMA 슬라이드를 놓습니다.
    2. Immunostainer 계측기 및 소프트웨어를 시작 합니다.
    3. 홈 보기에서 프로토콜 클릭 한 다음 만들기/편집 프로토콜을 클릭 합니다.
    4. 표준 한 덩어리를 선택 (3, 3'-diaminobenzidine) 기본 서식 파일을 수정 하려면 IHC 절차.
    5. 상자 목록에서 "Deparaffinization" 플래그와 매체 온도 72 ° c.에 설정
    6. Cc1 unmasking 솔루션 플래그, 95 ° C, 및 36 분 보육 시간에 매체 온도 설정 합니다.
    7. 1 차적인 항 체 상자 플래그, 응급실 인라인 디스펜서 (악기 소프트웨어 시 약 회전 목마에 디스펜서를 인식할 것 이다)의 ID를 삽입 하 고 부 화 시간 16 분 설정.
    8. 플래그 Counterstaining 상자, 선택 되며, 그리고 설정 부 화 시간 12 분.
    9. "다른 이름으로 저장" 버튼을 클릭 하 고 프로토콜 이름을.
    10. 다음과 같은 1 차적인 항 체 외피 시간을 사용 하 여 나머지 항 체에 대 한 단계 3.3.3-3.3.9 반복: 홍보 16 분, Ki67 16 분, HER2 12 분 사용 중 희석된 준비--사용 (RTU) 항 체.
    11. 홈 보기에서 레이블 만들기 버튼을 클릭 합니다.
    12. 프로토콜 단추를 클릭 하 고 분석 하는 TMA의 각 ER, PR, Ki67, 그리고 HER2 프로토콜 추가.
    13. /Print 닫기 버튼을 클릭 합니다.
    14. 레이블 서식 파일 나타납니다 레이블에 대 한 TMA Id를 입력 합니다.
    15. 인쇄 버튼 레이블을 인쇄 하 고 다음 TMA 슬라이드에 적용을 클릭 합니다.
    16. 악기 아이콘을 클릭 하 고 "준비"로 악기 시작 모드를 설정 합니다.
    17. 시 약 회전 목마를 포함 하는 후드, 검출 시스템, 열고 1 차 항 체는 다음 후드를 닫습니다.
    18. 로드 하 여 열, TMA 슬라이드 서랍 같은 버튼을 클릭 하 여 닫고 슬라이드 서랍에 전면 버튼을 클릭 합니다.
    19. 악기 시작 모드를 "실행"으로 설정 하 고 지침을 따릅니다.
    20. TMA 악기 슬라이드 제어에 완료 슬라이드 단추와 린스 개방 모든 서랍을 누르면 슬라이드 실행된, 언로드의 끝에 그들에 따뜻한 비눗물 모든 나머지 시 약을 제거 하.
    21. 저압 차가운 실행 물 아래 슬라이드를 세척, TMA 슬라이드를 탈수 하 고 유리 coverslip 각 슬라이드에 적용.
  4. ER, PR, HER2 IHC 분석 수행는 미국 협회의 임상 종양학 (ASCO) 다음 지침, 모자 /와 Ki67 유방암 워킹 그룹 (표 2)에서 국제 Ki67의 권고에 따라.
    참고:이 분석 수행 되어야 합니다 별도로 개별 조직 관광 명소에서 유 방 병리학에서 경험 병리학 자에 의해.
    1. 종양 세포 핵의 ≥ 1% immunoreactive20,21,,2223있다면 긍정적으로 응급실 식을 평가 합니다.
    2. 종양 세포 핵의 ≥ 1% immunoreactive20,21,,2223있다면 긍정적으로 홍보 식을 평가 합니다.
    3. HER2 식을로 평가: a) 점수 3 + 원주 막 얼룩을 완전 하 고 강렬한, b) 점수 2 + 원주 막 얼룩은 불완전 한 약한/온건 하 고 침략 적인 종양 세포의 또는 완전 한 > 10% 이내 및 원주 막 얼룩은 강렬 하 고 침략 적인 종양 세포, c ≤ 10% 이내) 점수 1 + 불완전 막 얼룩이 희미 한/거의 지각할 수 있는 고 침략 적인 종양 세포, d의 > 10% 이내) 부정적인 얼룩이 지는 존재 하는 경우 또는 막 얼룩은 불완전 하 고 희미 한/거의 지각할 수 있는 그리고 ≤ 내 침략 적인 종양의 103,24세포.
    4. 임의로 적어도 1000 종양 약 세포에서 핵 얼룩과 셀의 비율 선택 10 고 전력 분야 (확대, 400 X) Ki67 인덱스 평가25.

4. SISH HER2 분석

  1. TMA 섹션 (반복 단계 3.1)을 잘라.
  2. HER2 위한 SISH는 자동된 immunostainer를 사용 하 여 수행 합니다.
    1. 10 분 동안 60 ° C에서 분석 TMA 슬라이드를 놓습니다.
    2. Immunostainer 계측기 및 소프트웨어를 시작 합니다.
    3. 홈 보기에서 프로토콜 클릭 한 다음 만들기/편집 프로토콜을 클릭 합니다.
    4. 기본 서식 파일을 수정 하려면 "U 듀얼 틱 CKT" 절차를 선택 합니다.
    5. "건조" 상자 목록에서 플래그 하 고 20 분 동안 63 ° C에 온도 설정 합니다.
    6. 플래그 상자 목록, 다음 "셀 컨디셔닝 CC2", "셀"을 조절 하 고 4 분에 86 ° C 및 부 화 시 온도 설정 합니다.
    7. 플래그 CC2 가벼운 (주기 1), 표준 (2 주기), 및 확장 (주기 3) 8 분, 12 분, 8 분, 각각.
    8. 상자 목록에서 "틱-효소 3" 플래그를 16 분 보육 시간을 설정.
    9. HER2DNP 및 CHR17DIG 프로브를 선택 하 고 6 h에 보육 시간을 설정.
    10. 8 분 동안 76 ° C에 세척을 설정 합니다.
    11. 32 분 SISH multimer (SIL 틱 DNP HRP) 부 화 시간을 설정 합니다.
    12. 4 분은 chromogen (SIL 틱 DNP CHRC) 부 화 시간을 설정 합니다.
    13. 24 분 빨간 multimer (빨간 분 발굴 AP) 부 화 시간을 설정 합니다.
    14. 8 분에 빨간 chromogen (빨간 분 발굴 FR) 부 화 시간을 설정 합니다.
    15. 상자 목록에서 플래그 "Counterstaining" "되며 II"를 선택 하 고 8 분 보육 시간을 설정.
    16. 상자 목록에 "-Counterstaining" 플래그 "청소법 시 약"을 선택 하 고 4 분에 보육 시간을 설정.
    17. 3.3.11-3.3.15에서 단계를 반복 (선택 수정 U 듀얼 틱 CKT 프로토콜).
    18. 오픈 후드 시 약 회전 목마를 포함 하는 세척 및 분 검출 시스템 다음 후드를 닫습니다.
    19. 3.3.18-3.3.21에서 단계를 반복 합니다.
  3. HER2SISH 분석 수행: HER2/CEP17이 경우 ≥2.0은 평균 HER2 복사 번호 ≥4.0 신호 셀 당 HER2 유전자 증폭으로 긍정적인 평가 및 부정적인 HER2/CEP17이 경우 < 2.0 HER2 평균 복사 번호 < 4.0 신호/셀3,24.
    참고: IHC와 마찬가지로,이 분석에서에서 수행 되어야 합니다 별도로 개별 조직 명소 경험 유 방 병리학에서과 병리학 자에 의해.

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Representative Results

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전반적으로, 444 침략 적인 유 방 암 15 TMAs 분 분석 최적화에 반영 되었습니다. 샘플링 2,664 명소 중 2,651 (99.5%) 이전에 선택한 분야의 대표 되었고 따라서 후속 분석에 대 한 순종으로 간주. 내 종양이 종양의 독특한 지형 지역에 HER2 양성 클론의 유형이 다른 배포판에 특정 초점 IHC 및 SIH, 결정 되었다. 표 3 은 다른 histotypes에서 ER, PR, Ki67, HER2 상태에 초점을 맞추고 분석, 경우의 생물 학적 특성 묘사 한다. 특히,의 경우 18%에서 HER2 양성 셀을 표시 하려면 발견 > 종양 세포의 10% 따라서 HER2 양성 평가 대 한 특성을 일치 하 고. 흥미롭게도,이 값은 보고 된 발병 률 범위의 HER2 양성 유방암의 더 낮은 끝에 더 가까이. 다른 한편으로, HER2 상태는 HER2-양성, HER2 음성 유방암 (그림 3, 표 4), 유 방 암은에서 매우 이질적인 질병 개념에 제공 더 신빙성의 개별 분야에서 변수 게놈 수준입니다. SISH 분석의 실패 비율 0.8%, dinitrophenol 태그 조사 대상 시퀀스에 바인딩된 2,629/2,651 명소의 총 수를 했다.

Figure 1
그림 1 : HER2 유방암의 큰 동료에서이 성분의 분석에 대 한 높은 처리 플랫폼의 실현에 초석이 표현의 단계. (A) 다양 한 영역을 식별 하 고 모든 분야의 하이라이트 포함 해야 cytological, 건축, 또는 IHC 이종. (B)이 가장 중요 한 단계 중 하나 절차는 미세한 균열도 후속 제자리에서 교 잡 분석의 일관성을 유추할 수는 높은-품질 수락자 블록의 창조 이다. (C) 그것은 Kononen 기법에 따라 높은 수율 TMA을 생성 하는 1 m m 직경 바늘 디지털 가이드 arrayer를 사용 해야 합니다. (D) TMA 프로젝트의 창조는 치수의 정 및 TMA의 테두리에서 시작 한다. (E) 모든 IHC와 ISH 분석 TMA를 통해 빠르게 탐색 디지털 병 리 도구를 사용 하 여 수행 되어야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 실현이 프로토콜에 대 한 TMA의 planimetric 표현. 500 µ m, 1 mm 직경의 180 명소의 총 수를 최적의 위치에 하이브리드에 대 한 수 있습니다. 밀도가 TMAs 모든 관광 명소, 단일-자리 기준 더 높은 실패 레이트에 걸쳐 전반적인 품질 및 균일 반응의 비생산적인 결과 제공합니다. "방향" 관광 명소에서 및 중간-왼쪽 위 모눈의 note 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 실버를 보여주는 대표적인 현미경 제자리에서 는 HER2 이기종 유방암의 교 잡 분석. 이 전형적인 예에서는 없는 특별 한 유형 (BR_121)의 고급 침략 적인 유방암의 두 가지 점이 보였다 HER2 유전자 (검정) 증폭 17 centromeric 열거형 프로브에 비해 측면에서 다른 결과 (빨간색). 특히, 한 지역 종양 코어에 속하는 보여주는 cytokeratin 7 불규칙 한 얼룩 패턴 HER2 증폭 (A), (, 종양 가장자리) 침략 앞에서 한 자리 하는 동안 야생-타입 HER2 표시 패턴 (B)입니다. 스케일 바 = 50 µ m (는 인세트 20 µ m). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

케이스 ID 블록 ID 영역 ID 조직 지형 형태학 ER 홍보 Ki67 HER2 다른 IHC 기능
BR_121 A5 정상 외과 여백
BR_121 A 1 뉴펀들랜드 표준시 종양 코어 G2 CK7 +
BR_121 A 1 b 뉴펀들랜드 표준시 종양 코어 G3 + CK7
BR_121 A3 뉴펀들랜드 표준시 종양 코어 담 기질 90 100 12 2 +
BR_121 A3 b 뉴펀들랜드 표준시 침략 앞 100 100 35 2 +
BR_121 A4 뉴펀들랜드 표준시 침략 앞 G3
BR_121 A3 c DCIS (EIC +) 침략 앞에 인접 한 고급 100 100 45 2 +

표 1: 연구에 포함 한 경우의 대표적인 기록. 이 경우 (BR_121)의 아무 특별 한 초점 myxoid 기질, CK7 immunoexpression의 초점 불규칙 손실과 병 변의 주변에는 작은 관 구성 요소를 보여주는 고급 침략 암 이었다. Immunohistochemical 기능을 보고, 바이오 마커를 포함 하 여 진단의 시간에 수행 하는 분석을 말합니다. 뉴펀들랜드 표준시, 침략 암 없는 특별 한 유형의; DCIS, ductal 암 제자리에; EIC +, 광범위 한 intraductal 구성 요소; CK7, cytokeratin 7

표식 클론 회사 희석 Dewaxing 항 원 복구 항 체 외피 채 점 시스템
ER S P 1 Ventana RTU 72 ° C에이 지 준비 36 분 동안 95 ° C에서 cc1 16 분 ASCO/CAP 지침23
홍보 1E2 Ventana RTU 72 ° C에이 지 준비 36 분 동안 95 ° C에서 cc1 17 분 ASCO/CAP 지침23
HER2 4B5 Ventana RTU 72 ° C에이 지 준비 36 분 동안 95 ° C에서 cc1 18 분 ASCO/CAP 지침3
Ki67 30-9 Ventana RTU 72 ° C에이 지 준비 36 분 동안 95 ° C에서 cc1 12 분 국제 Ki67 유방암 그룹 추천25 일에

표 2: 항 체, 클론, 희석, 항 원 검색 방법 및 점수 시스템 immunohistochemical 분석에 대 한 채택 목록. 응급실, 에스트로겐 수용 체; 홍보, 황 체 호르몬 수용 체; RTU, 준비-사용.

Histotype n (%) ER + (%) 홍보 + (%) Ki67 로우 (%) 기-67-높음 (%) HER2 + (%)
아니 특별 한 종류의 침 윤 성 암 344 (77.5) 301 (87.5) 257 (74.7) 85 (24.7) 259 (75.3) 71 (20.6)
Lobular 침 윤 성 암 53 (11.9) 53 (100.0) 44 (83.0) 36 (67.9) 17 (32.0) 4 (7.5)
침 윤 성 암 종, 혼합 유형 9 (2.0) 8 (88.9) 6 (66.7) 0 (0.0) 9 (100.0) 1 (11.1)
관 암 8 (1.8) 8 (100.0) 8 (100.0) 8 (100.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
담 암 11 (2.4) 11 (100.0) 9 (81.8) 7 (63.6) 4 (36.4) 0 (0.0)
Micropapullary 암 7 (1.6) 7 (100.0) 7 (100.0) 5 (71.4) 2 (28.6) 2 (28.6)
뽀 featueres와 침 윤 성 암 5 (1.1) 3 (60.0) 1 (20.0) 1 (20.0) 4 (80.0) 3 (60.0)
젖꼭지 암 1 (0.2) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (100.0) 0 (0.0)
골 수 암 4 (0.9) 0 (0.0) 1 (25.0) 0 (0.0) 4 (100.0) 0 (0.0)
Metaplastic 암 2 (0.5) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (100.0) 0 (0.0)
444 391 (88.0) 333 (75.0) 142 (32.0) 302 (68.0) 81 (18.2)

표 3: 유 방 암 histotypes, 수용 체 상태 및 HER2이 상태. 응급실, 에스트로겐 수용 체; 홍보, 황 체 호르몬 수용 체; Ki67 로우, Ki67 인덱스 < 18%; Ki67 높은, Ki67 > 18%.

해석할 종양 약 명소 HER2 양성 명소 (%) 호르몬 수용 체 상태 HER2 유형이 다른 경우
6 5 (83) 긍정적인 10
6 5 (83) 네거티브 1
6 4 (67) 긍정적인 7
6 4 (67) 네거티브 1
6 2 (33) 네거티브 1
6 1 (17) 긍정적인 1
5 3 (60) 긍정적인 10
5 1 (20) 긍정적인 2
4 3 (75) 긍정적인 9
4 2 (50) 긍정적인 8
4 1 (25) 네거티브 1
3 2 (67) 긍정적인 5
3 1 (33) 긍정적인 2
46 25 (54) 53 (93) 57

표 4: HER2 표현, 호르몬 수용 체 상태, 그리고 HER2 이질적인 경우. 57 HER2 다른 유형의 경우, 가운데 4 (7%)의 경우 응급실-부정과 홍보-부정, HER2이 평가의 임상 중요성을 확인 했다.

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Discussion

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여기, 우리가 heterogeneously 처리 유방암의 높은 수율 TMAs HER2 유전자와 그 해당 centromere SISH 분석을 수행 하는 실험실 전략 세부. 이 방법은 비용 효율적 이며 유 방 암 검색 양식 병 리 기록 보관소의 큰 동료에서 HER2 유전자 증폭이 연구에 대 한 대부분 실험실에서 실시 될 수 있습니다.

때문에 HER2의 임상 중요성 유방암과 그것의 다른 유형의 식에 의해 생성 된 과제에서 테스트, 우리는 평가 하기 위해 내부-및 남북-tumor HER2 유전자이 높은 처리량 테스트 프로토콜을 개발 했다. 분석된 분야 특정 cytological, 건축, IHC 특징 기준 미리 침략과 침략 적 구성 요소를 포함합니다.

이 프로토콜에서 신중 하 게 관리 해야 하는 몇 가지 중요 한 단계 있다. 한 필수 단계는 관심의 영역의 선택 이다. 우리은 다양 한 접근 방식을 통해 다른 지형 지역 주석 최종 분자 분석의 품질을 보장 하는 것을 결정 했다. 특히, 진단 슬라이드의 공동 개정 병리학 자에 의해 수행 및 기술자 적절 한 장소 (, 슬라이드에서 식별 된 영역을 반영 하는 관광 명소)의 수를 엄청나게 증가 하 고 그 후의 실패율을 줄일 수 단일 명소 분석입니다. 그러나, 몇몇 종양 명소 여러 IHC와 ISH 분석에 대 한 직렬 섹션 후 손실 될 수 있습니다. 이 불편을 극복 하기 위해 좋습니다 복제 또는 3 중, TMAs 건설 조직 가용성에 따라 모든 가능한 경우. 또한, 우리는 TMAs 위한 수락자 FFPE 블록의 창조에 대 한 엄격한 실험실 프로시저 정의의 중요성을 강조 표시 합니다. 실제로, 우리는 TMA 블록에서 최소한의 균열 품질, 재현성, 및 선명도 반응의 전체 분 분석을 유추할 수 있습니다 관찰. 균열 발생, TMA 건설에 대 한 기증자 블록을 무시 한다. 그러나 그것은 해야 인정,, IHC 차선 TMAs 에서도 수행할 수와 같은 분석 하는 동안 기술적인 문제의 증거가 우리의 경험에서 관찰 되었습니다.

도 불구 하 고가이 프로토콜 특히 높은 수율 유방암 TMAs HER2 SISH 분석에 대 한 최적화 된, 그것은 메모는 물고기 등 IHC, 다른 분석을 수행할 수 있습니다 안정적으로 여러 조직 유형, 앞에서 설명한14 19,26. 그러나, 우리가 여기 이상적인 관광 명소와 유 방 암 표본에서 HER2 유전자의 높은 품질과 재현성 SISH 분석 되도록 TMA의 지형 특성을 정의 했습니다. 또 다른 중요 한 포인트는 여러 샘플 분석의 특성에 맞게 표준 automatized SISH 프로토콜의 재편으로 표시 됩니다. 사실, 제조업체의 지침 기존의 탈모 섹션의 분자 분석에 대 한 일반적으로 만들어진다 고 따라서 보관 FFPE 블록에서 TMAs에와 같은 heterogeneously 처리 조직 샘플에서 높은 수준에 도달 수 있습니다. 이 위해, 우리가 제공한 신뢰할 수 있는 사용자 지정된 프로토콜에 대 한 단계별 설명 SISH 분석 문제가이 샘플에서에 대 한.

그것은 매우 유익한 HER2 식 및 유방암에 다른 임상 실용 분자 biomarkers의 이질적인 배급에 유전자 증폭의이 탐험 것입니다. 이 위해, 추가 변환 연구 연구는 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징 (MALDI-MSI)27등 다른 임상 관련 분자 분석에 대 한 우리의 방법의 타당성을 찾아보기 필요 합니다. 도전 이기는 하지만 최근, MALDI MSI 분석 FFPE 직물의 관리 가능, 되고있다. 이 현장에서 proteomic 기술을 단백질 및 펩 티 드 병 적인 조직 섹션에서 유 방 암 등의 공간 배급의 시각화 할 수 있습니다.

이 프로토콜은 잠재적으로 최종 분석을 방해할 수 있는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 특정 주의 HER2 증폭을 기본 서로 다른 메커니즘으로 지불 되어야 합니다. 예를 들어, 염색체 17 polysomy 유 방 암11, 대표 하는 HER2 복사 증가 대 한 잘 알려진 대체 메커니즘에서에서 발생할 수 있는 유전 착오입니다. 이 조건은 빈번 하지 않은 식물 이기는 하지만 수 있습니다 영향을 암 생물학 기능 및 환자 관리 뿐만 아니라 분 분석. 둘째, 그것은 내부 종양 유전자이 단일 세포 수준에서 그리고 다른 종양 약 지역에서 뿐만 아니라 또한 발생 설명 되었습니다. 이 프로토콜은 지문과 섹션에 비해이 특정 조건의 탐지 전력을 증가 수 없습니다. 또한, 그것은 공간이 성분의 TMA 기반 연구 전체 섹션의 포괄적인 분석의 부족을 포함 하 여 몇 가지 기본 제한이 있다는 것을 강조 하는 것이 중요. 그러나이 연구,, 증거-의-원칙 HER2 유전자 증폭의이 질 표준 실험실 장비를 사용 하 여 높은 처리량 및 비용 효율적인 플랫폼을 통해 평가 될 수 있다 고려 되어야 한다. 최첨단 분자 연구와 환자 들의 임상 데이터와 결합 하는 HER2 이기종 경우 직렬 들고 섹션을 분석 하는 추가 연구가이 프로토콜을 확인 하기 위해 필요 합니다.

결론적으로, HER2 상태 이기종 HER2 유방암 암 표본에서의 포괄적인 매핑 및 HER2 부정 구성 요소에서 잠재적인 드라이버 유전자 변이 조사 여러 종양 약 영역 분석에 의존 한다. 이 분석 참을 비용과 노력 표준 진단 기능을 사용 하 여 필요 합니다. 이 메서드는 다중의 큰 세트와 heterogeneously 처리 유방암에서 HER2 유전자이 동시 특성에 대 한 신뢰할 수 있는 도구를 나타냅니다.

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Disclosures

저자는 관심의 충돌이 있다.

Acknowledgments

없음입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

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유방암에서 HER2 유전자 증폭의이 질을 평가 하기 위해 높은 처리량 검열 플랫폼을 구축
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Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

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