Summary

Aufbau einer Hochdurchsatz-Screening-Plattform zu beurteilen, die Heterogenität der HER2-Gene-Verstärkung in Brust-

Published: December 05, 2017
doi:

Summary

Heterogene Verteilung der HER2-positiven Zellen in einer Teilmenge von Brustkrebs beobachtet werden und erzeugt klinischen Dilemmas. Hier stellen wir eine zuverlässige und kostengünstige Protokoll zu definieren, zu quantifizieren und HER2 Intra-Tumor genetische Heterogenität in einer großen Serie von heterogen verarbeiteten Brustkrebs zu vergleichen.

Abstract

Gezielte Therapien gegen die menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) haben die Ergebnisse von Patienten mit HER2-positivem Brustkrebs radikal verändert. Eine Minderheit der Fälle zeigt jedoch eine heterogene Verteilung der HER2-positiven Zellen, die wichtige klinischen Herausforderungen erzeugt. Bisher wurden keine zuverlässige und standardisierte Protokolle für die Charakterisierung und Quantifizierung von HER2 heterogene gen Verstärkung in großen Kohorten vorgeschlagen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Hochdurchsatz-Methodik um den HER2-Status gleichzeitig über verschiedene topographische Bereiche von mehreren Brustkrebs zu beurteilen. Insbesondere zeigen wir die Laborverfahren verstärkte Gewebe Microarrays (TMAs) Einbeziehung eine gezielte Zuordnung der Tumoren zu konstruieren. Alle TMA-Parameter wurden speziell für Silber in Situ -Hybridisierung () von Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Brustgewebe optimiert. Immunhistochemische Analyse der prognostische und prädiktive Biomarker (d. h., ER, PR, Ki67 und HER2) sollte mit Hilfe automatisierte Verfahren durchgeführt werden. Eine maßgeschneiderte Protokoll wurde implementiert, um eine qualitativ hochwertige molekulare Analyse über mehrere Gewebe zu ermöglichen, die unterschiedliche Fixierung, Aufbereitung und Lagerung Verfahren unterzogen. In dieser Studie bieten wir einen Proof-of-Principle, dass bestimmte DNA-Sequenzen lokalisierte gleichzeitig in verschiedene topographische Bereiche von mehreren und heterogen verarbeiteten Mammakarzinome mit einer effizienten und kostengünstigen Methode sein könnte.

Introduction

HER2 ist ein Protoonkogenproduktes, das überexprimiert und verstärkt in 15-30 % aller invasiven Brustkrebs Krebs1,2. HER2-Überexpression wird abgeleitet durch das Vorhandensein von > 10 % Zellen mit starken Membran immunhistochemische (IHC) Färbung (3 +), während die gen-Amplifikation beurteilt werden kann, wenn das HER2/Zentromer-Verhältnis ≥2 ist oder die gen-Kopie-Anzahl ≥6 ist, zählen auf mindestens 20 Zellen durch in Situ Hybridisierung (ISH)3.

Intra-Tumor genetische Heterogenität ist weit verbreitet in Brustkrebs, einen möglichen negativen Beitrag zu Biomarkern Bewertung und Behandlungen Antwort4beschrieben worden. Nach dem College der amerikanischen Pathologen (GAP), HER2 Heterogenität liegt vor, wenn bei HER2 verstärkt ist > 5 % und < 50 % der Infiltration Tumor Zellen5. Bedauerlicherweise die tatsächliche Häufigkeit von HER2 räumliche Heterogenität in Brustkrebs bleibt ein Thema der Kontroverse unter den Pathologen mit einigen Autoren, die Pflege, es ist ein äußerst seltenes Ereignis, andere darauf hindeutet, dass bis zu 40 % der Fälle sind HER2-heterogene1,5,6,7,8,9,10. Trotz der biologischen Mechanismen, die diese Bedingung zu untermauern sind nicht noch vollständig geklärt die prognostischen und klinischen Auswirkungen der Intra-Tumor HER2 Heterogenität sind entscheidend für Brust Krebs Patienten11.

Vor kurzem entstanden Hellfeld Molekulare Techniken, wie chromogenen ISH (CISH) und Silber ISH (), als zuverlässige Methoden, HER2-Heterogenität in FFPE Gewebe, mit einigen Vorteilen im Vergleich zu Leuchtstofflampen ISH (Fisch)12zu erkennen. Leider bleibt die Massenanalyse von einzelnen Fällen unpraktisch in großen Kohorte-Studien. Mehrere Gruppen haben vorgeschlagen, dass die Kombination von Histochemie, IHC und ISH mit TMA-Technologien eine sinnvolle Strategie in der Studie von Krebs Biologie13,14,15,16darstellen könnte. Mit dieser weit verbreiteten Methode können Gewebeproben aus verschiedenen Patienten gleichzeitig, Minimierung der Gewebe und Reagenzien beschäftigt und dabei fördern die einheitliche Analyse einer großen Reihe von Fällen14analysiert werden. Jedoch gibt es keine Protokolle für die gleichzeitige Hochdurchsatz-molekulare Charakterisierung der mehrere Gewebeproben, die unterschiedliche Verarbeitung im Hinblick auf die Reagenzien, Fixierung Zeiten und Konservierungsmethoden eingesetzt, solche wie Archivierung unterzogen Blöcke.

Angesichts der prognostischen und klinischen Auswirkungen der HER2 räumliche Heterogenität in Brust-, entwickelten wir eine integrierte molekulare Plattform um es in großen Serien heterogen bearbeiteten Fälle zu beurteilen. Hier zeigen wir die Labor-Strategien zur Erzeugung und Analyse der Intra-Tumor Heterogenität der HER2 -Amplifikation in hochverzinsliche TMAs von Brustkrebs mittels. Das folgende Protokoll wurde entwickelt für Tumoren messen > 5 mm (> pT1b nach der TNM-2017)17. Für kleinere Läsionen empfehlen wir die Durchführung der Analyse auf Full-Face Schnittserien. Unser Verfahren ermöglicht die gleichzeitige IHC und Analyse von bis zu 30 Brustkrebs, mit einem Mittelwert von 6 verschiedene Bereiche (Bereich 4-8) für jeden Fall. Insgesamt werden 180 Gewebe Kerne von 1 mm im Durchmesser, mit 500 µm zwischen den Kernen und 2 mm zwischen dem Netz und Kanten für jeden TMA-Block generiert.

Protocol

Diese Studie wurde genehmigt durch die institutionelle Review Boards von IRCCS Ca’ Granda-Stiftung, Policlinico Krankenhaus, Mailand, Italien. 1. Auswahl der Patienten und Gewebeproben Abrufen der Archivierung Folien aller Fälle analysiert werden, einschließlich aller verfügbaren Hämatoxylin und Eosin (H & E) und IHC Dias aus der ursprünglichen Diagnose und, falls vorhanden, ein H & E von nicht-neoplastischen Brustgewebe (z.B. chirurgische Marge) abgestimmt . …

Representative Results

Insgesamt 444 invasivem Brustkrebs, Krebserkrankungen in 15 TMAs speziell optimiert für ISH Analysen aufgenommen wurden. Unter den 2.664 Punkten abgetastet 2.651 (99,5 %) waren Vertreter der zuvor ausgewählten Bereiche und daher als für spätere Analysen. Intra-Tumor Heterogenität wurde durch IHC und SIH, mit besonderem Schwerpunkt auf die heterogene Verteilung der HER2-positivem Klone in der topographischen Bereiche der Tumoren bestimmt. Tabelle 3 zeigt die biologisc…

Discussion

Hier haben wir die Labor-Strategien Analysen das HER2 -gen und seine entsprechenden Zentromer in hochverzinsliche TMAs der heterogen verarbeiteten Mammakarzinome durchführen detaillierte. Diese Methode ist kostengünstig und kann in den meisten Labors für die Untersuchung von HER2 Gens Verstärkung Heterogenität in großen Kohorten der Brust Krebs abgerufen Form Pathologie Archive durchgeführt werden.

Aufgrund der klinischen Bedeutung des HER2 Tests bei Brustkrebs und die…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Keine.

Materials

Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26×76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device – digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

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Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

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