Heterogen distribusjon av HER2-positiv celler kan observeres i et delsett av brystkreft og genererer klinisk dilemmaer. Her introduserer vi en pålitelig og kostnadseffektiv protokoll for å definere kvantifisere og sammenligne HER2 intra-svulst genetisk heterogenitet i en stor serie heterogeneously behandlet brystkreft.
Målrettet terapi mot menneskelig epidermal vekstfaktor reseptor 2 (HER2) har radikalt forandret utfallet av pasienter med HER2-positiv brystkreft. Et mindretall av tilfellene viser imidlertid en heterogen fordeling av HER2-positiv celler, som genererer store klinisk utfordringer. Hittil har foreslått ingen pålitelig og standardiserte protokollene for karakterisering og kvantifisering HER2 heterogene gene forsterkning i store kohorter. Her presenterer vi en høy gjennomstrømming metodikk for å evaluere samtidig HER2 over ulike topografiske områder på flere brystkreft. Spesielt illustrere vi laboratorium prosedyre for å lage forbedret vev microarrays (TMAs) omfatter en målrettet tilordning av tumorer. Alle TMA-parameterne er spesifikt optimalisert for sølv i situ hybridization (SISH) av formalin-fast parafin-embedded (FFPE) bryst vev. Immunohistochemical analyse av de prognostiske og prediktiv biomarkers (dvs., ER, PR, Ki67 og HER2) skal utføres ved hjelp av automatiserte prosedyrer. En tilpasset SISH protokollen er implementert for å tillate en høy kvalitet molekylær analyse over flere vev som gjennomgikk forskjellige fiksering, behandling og lagring prosedyrer. I denne studien gir vi bevis på prinsippet-at spesifikke DNA-sekvenser kan være lokalisert samtidig i forskjellige topografiske områder av flere og heterogeneously behandlet brystkreft ved hjelp av en effektiv og kostnadseffektiv metode.
HER2 er en proto-oncogene som overexpressed og forsterket i 15-30% av alle invasiv bryst kreft1,2. HER2 overuttrykte utledes av tilstedeværelsen av > 10% celler med sterk membran immunohistochemical (IHC) flekker (3 +), mens gene forsterkning kan vurderes ved HER2/centromere er ≥2 eller genet kopi er ≥6, på telling på minst 20 celler av i situ hybridisering (ISH)3.
Intra-svulst genetisk heterogenitet har blitt mye beskrevet i brystkreft, være en potensielt uønskede bidragsyter til biomarkers evaluering og behandling respons4. Etter College av amerikanske patologer (CAP), HER2 heterogenitet finnes hvis HER2 forsterkes i > 5% og < 50% av infiltrere tumor celler5. Dessverre faktiske forekomsten av HER2 romlige heterogene i brystkreft er omstridt blant patologer, med noen forfattere innledningsvis at det er en svært sjelden hendelse og andre tyder på at opp til 40% av tilfellene er HER2-heterogene1,5,6,7,8,9,10. Til tross for de biologiske mekanismene som understøtter denne tilstanden er ikke ennå fullt ut avklart, prognostiske og klinisk virkningene av intra-svulst HER2 heterogenitet er avgjørende for breast cancer pasienter11.
Nylig, lyse-feltet molekylær teknikker, som kromogent ISH (CISH) og sølv ISH (SISH), har dukket opp som pålitelig metoder å oppdage HER2 heterogenitet i FFPE vev, med noen fordeler sammenlignet med fluorescerende ISH (fisk)12. Dessverre fortsatt bulk analyse av enkelt tilfeller upraktisk i stor-kohort forskningsstudier. Flere grupper har antydet at kombinasjonen av histochemistry, IHC og ISH med TMA teknologier kan representere en verdifull strategi i studiet av kreft, biologi,13,,14,,15,,16. Med denne vidt vedtatt metoden kan vevsprøver fra pasienter analyseres samtidig, minimere vev og reagenser ansatt og dermed fremme uniform analyse av en stor rekke tilfeller14. Men er ingen protokoller tilgjengelig for samtidig høy gjennomstrømming molekylær karakterisering av flere vevsprøver som gjennomgikk ulike behandling reagenser, fiksering ganger og bevaring metoder ansatt, slik som arkivering blokker.
Gitt prognostiske og klinisk implikasjonene av HER2 romlige heterogenitet i brystkreft, utviklet vi en integrert molekylær plattform for å vurdere det i stor serie heterogeneously behandlet tilfeller. Her portrettere vi laboratorium strategier for å generere og analysere den intra-svulst heterogenitet HER2 forsterkning i høy avkastning TMAs for brystkreft med SISH. Følgende protokollen er utviklet for svulster måle > 5 mm (> pT1b ifølge TNM 2017)17. For mindre lesjoner anbefaler vi utføre analyser på hele føljetong deler. Vår prosedyre tillater samtidig IHC og SISH analyse av opptil 30 brystkreft, omfatter et gjennomsnitt på 6 forskjellige områder (range 4-8) for hvert enkelt tilfelle. Helt, 180 vev prosessorkjerner 1 mm i diameter, med 500 µm mellom kjerner og 2 mm mellom rutenettet og kanter genereres for hver TMA-blokk.
Her har vi detaljerte laboratorium-strategier for å utføre SISH analyser av HER2 genet og det tilsvarende centromere i høy avkastning TMAs av heterogeneously behandlet brystkreft. Denne metoden er kostnadseffektive og kan utføres i de fleste laboratorier for studier av HER2 genet forsterkning heterogenitet i store kohorter av bryst kreft Hentet skjemaet patologi arkiver.
På grunn av klinisk viktigheten av HER2 testing i brystkreft og utfordringene generert av heterogene …
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 39601006 | Tissue embedding medium, 56 °C melting point |
Eosin Y 1% water solution | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 510002 | Eosin yellowish, water-soluble |
Carazzi’s hematoxylin | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 506012 | Alum hematoxylin ripened using potassium iodate |
Diamond quality | Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU | 33533 | 26×76 mm microscope slides |
Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 14046430011 | Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene |
FLEX IHC microscope slides | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC |
BenchMark ULTRA | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | N750-BMKU-FS | Slide staining system |
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Primary antibody, ready-to-use |
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Primary antibody, ready-to-use |
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Primary antibody, ready-to-use |
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Primary antibody, ready-to-use |
ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies |
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients |
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
ultraView Red ISH DIG Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest |
Hematoxylin | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent |
Hematoxylin II Counterstaining | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent |
Bluing reagent | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides |
HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Formamide-based buffer for ISH assays |
EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10. |
SSC Buffer (10X) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5. |
ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions |
Reaction Buffer (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10. |
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use. |
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
ultraView Silver Wash II | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps |
Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | RM 2255 | Automated rotary microtome |
Multistainer | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | ST 5020 | Workstation for automated staining and coverslipping |
Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, France, EU | 00-MICO-1 | Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software |
Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | K080254 | Image capture device – digital pathology scanner |
Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | Cassette |
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | Stainless-Steel base metal mold |