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Immunology and Infection

Aufbau einer Hochdurchsatz-Screening-Plattform zu beurteilen, die Heterogenität der HER2-Gene-Verstärkung in Brust-

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

Heterogene Verteilung der HER2-positiven Zellen in einer Teilmenge von Brustkrebs beobachtet werden und erzeugt klinischen Dilemmas. Hier stellen wir eine zuverlässige und kostengünstige Protokoll zu definieren, zu quantifizieren und HER2 Intra-Tumor genetische Heterogenität in einer großen Serie von heterogen verarbeiteten Brustkrebs zu vergleichen.

Abstract

Gezielte Therapien gegen die menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) haben die Ergebnisse von Patienten mit HER2-positivem Brustkrebs radikal verändert. Eine Minderheit der Fälle zeigt jedoch eine heterogene Verteilung der HER2-positiven Zellen, die wichtige klinischen Herausforderungen erzeugt. Bisher wurden keine zuverlässige und standardisierte Protokolle für die Charakterisierung und Quantifizierung von HER2 heterogene gen Verstärkung in großen Kohorten vorgeschlagen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Hochdurchsatz-Methodik um den HER2-Status gleichzeitig über verschiedene topographische Bereiche von mehreren Brustkrebs zu beurteilen. Insbesondere zeigen wir die Laborverfahren verstärkte Gewebe Microarrays (TMAs) Einbeziehung eine gezielte Zuordnung der Tumoren zu konstruieren. Alle TMA-Parameter wurden speziell für Silber in Situ -Hybridisierung () von Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Brustgewebe optimiert. Immunhistochemische Analyse der prognostische und prädiktive Biomarker (d. h., ER, PR, Ki67 und HER2) sollte mit Hilfe automatisierte Verfahren durchgeführt werden. Eine maßgeschneiderte Protokoll wurde implementiert, um eine qualitativ hochwertige molekulare Analyse über mehrere Gewebe zu ermöglichen, die unterschiedliche Fixierung, Aufbereitung und Lagerung Verfahren unterzogen. In dieser Studie bieten wir einen Proof-of-Principle, dass bestimmte DNA-Sequenzen lokalisierte gleichzeitig in verschiedene topographische Bereiche von mehreren und heterogen verarbeiteten Mammakarzinome mit einer effizienten und kostengünstigen Methode sein könnte.

Introduction

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HER2 ist ein Protoonkogenproduktes, das überexprimiert und verstärkt in 15-30 % aller invasiven Brustkrebs Krebs1,2. HER2-Überexpression wird abgeleitet durch das Vorhandensein von > 10 % Zellen mit starken Membran immunhistochemische (IHC) Färbung (3 +), während die gen-Amplifikation beurteilt werden kann, wenn das HER2/Zentromer-Verhältnis ≥2 ist oder die gen-Kopie-Anzahl ≥6 ist, zählen auf mindestens 20 Zellen durch in Situ Hybridisierung (ISH)3.

Intra-Tumor genetische Heterogenität ist weit verbreitet in Brustkrebs, einen möglichen negativen Beitrag zu Biomarkern Bewertung und Behandlungen Antwort4beschrieben worden. Nach dem College der amerikanischen Pathologen (GAP), HER2 Heterogenität liegt vor, wenn bei HER2 verstärkt ist > 5 % und < 50 % der Infiltration Tumor Zellen5. Bedauerlicherweise die tatsächliche Häufigkeit von HER2 räumliche Heterogenität in Brustkrebs bleibt ein Thema der Kontroverse unter den Pathologen mit einigen Autoren, die Pflege, es ist ein äußerst seltenes Ereignis, andere darauf hindeutet, dass bis zu 40 % der Fälle sind HER2-heterogene1,5,6,7,8,9,10. Trotz der biologischen Mechanismen, die diese Bedingung zu untermauern sind nicht noch vollständig geklärt die prognostischen und klinischen Auswirkungen der Intra-Tumor HER2 Heterogenität sind entscheidend für Brust Krebs Patienten11.

Vor kurzem entstanden Hellfeld Molekulare Techniken, wie chromogenen ISH (CISH) und Silber ISH (), als zuverlässige Methoden, HER2-Heterogenität in FFPE Gewebe, mit einigen Vorteilen im Vergleich zu Leuchtstofflampen ISH (Fisch)12zu erkennen. Leider bleibt die Massenanalyse von einzelnen Fällen unpraktisch in großen Kohorte-Studien. Mehrere Gruppen haben vorgeschlagen, dass die Kombination von Histochemie, IHC und ISH mit TMA-Technologien eine sinnvolle Strategie in der Studie von Krebs Biologie13,14,15,16darstellen könnte. Mit dieser weit verbreiteten Methode können Gewebeproben aus verschiedenen Patienten gleichzeitig, Minimierung der Gewebe und Reagenzien beschäftigt und dabei fördern die einheitliche Analyse einer großen Reihe von Fällen14analysiert werden. Jedoch gibt es keine Protokolle für die gleichzeitige Hochdurchsatz-molekulare Charakterisierung der mehrere Gewebeproben, die unterschiedliche Verarbeitung im Hinblick auf die Reagenzien, Fixierung Zeiten und Konservierungsmethoden eingesetzt, solche wie Archivierung unterzogen Blöcke.

Angesichts der prognostischen und klinischen Auswirkungen der HER2 räumliche Heterogenität in Brust-, entwickelten wir eine integrierte molekulare Plattform um es in großen Serien heterogen bearbeiteten Fälle zu beurteilen. Hier zeigen wir die Labor-Strategien zur Erzeugung und Analyse der Intra-Tumor Heterogenität der HER2 -Amplifikation in hochverzinsliche TMAs von Brustkrebs mittels. Das folgende Protokoll wurde entwickelt für Tumoren messen > 5 mm (> pT1b nach der TNM-2017)17. Für kleinere Läsionen empfehlen wir die Durchführung der Analyse auf Full-Face Schnittserien. Unser Verfahren ermöglicht die gleichzeitige IHC und Analyse von bis zu 30 Brustkrebs, mit einem Mittelwert von 6 verschiedene Bereiche (Bereich 4-8) für jeden Fall. Insgesamt werden 180 Gewebe Kerne von 1 mm im Durchmesser, mit 500 µm zwischen den Kernen und 2 mm zwischen dem Netz und Kanten für jeden TMA-Block generiert.

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Protocol

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Diese Studie wurde genehmigt durch die institutionelle Review Boards von IRCCS Ca' Granda-Stiftung, Policlinico Krankenhaus, Mailand, Italien.

1. Auswahl der Patienten und Gewebeproben

  1. Abrufen der Archivierung Folien aller Fälle analysiert werden, einschließlich aller verfügbaren Hämatoxylin und Eosin (H & E) und IHC Dias aus der ursprünglichen Diagnose und, falls vorhanden, ein H & E von nicht-neoplastischen Brustgewebe (z.B. chirurgische Marge) abgestimmt .
  2. Durchführen Sie Fallbesprechungen.
    Hinweis: Für diese Aufgabe sollte mindestens zwei Pathologen mit Erfahrung in der Brust Pathologie diagnostische Folien zu diskutieren und lösen Meinungsverschiedenheiten als Kollegium. Verwenden Sie eine konventionelle Mikroskop oder Telepathology Werkzeuge (Letzteres in multizentrischen Studien bevorzugen). Falls vorhanden, schließen Sie alle diskordanten Fälle aus.
    1. Führen Sie die histologische Neueinstufung aller Fälle nach der neuesten Ausgabe der World Health Organisation (WHO) Klassifizierung von Tumoren der Brust18.
    2. Sicherstellen Sie, dass das normale Gewebe für jeden Fall, falls vorhanden in der Archivierung klinischen Proben mindestens eine nicht-neoplastischen terminal duktale lobulären Einheit umfasst.
    3. Identifizieren Sie alle neoplastischen Bereiche, die heterogenen zeigen zytologische, Architektur, oder IHC-Features mit dem Hellfeld Mikroskop (durch ein Pathologe und die Techniker, die den TMAs konstruieren gemeinsam durchgeführt werden).
  3. Markieren Sie die diskreten topographische Bereiche mit einem Filzstift auf dem Objektträger oder mit dem richtigen Werkzeug auf einer digitalen Dia-Software (Abbildung 1A).
  4. Basierend auf der ausgewählten Folien, rufen Sie die entsprechenden FFPE-Blöcke aus den Archiven.
    Hinweis: Zur Optimierung der TMA Bau, um Gewebe Erschöpfung zu vermeiden und die TMA zu bewahren punch strukturelle Integrität, Fälle mit < 1 mm dicken verbleibende Gewebe ausgeschlossen werden sollte.

(2) entwerfen Sie und bauen Sie TMAs basiert auf der Kononen Technik

  1. Erstellen und Öffnen einer neuen Kalkulationstabellendatei unter Einbeziehung der Aufzeichnungen von den unterschiedlichen Bereichen des Einzelfalls. Umfassen die folgenden Daten auf getrennten Spalten, wie in Tabelle 1 veranschaulicht: Fall-ID, Block-ID, Bereichskennung, Gewebetyp (z.B.normales Gewebe, invasive Komponente Histotype, in Situ Komponente Histotype), Topographie (z.B., Tumor-Kern, invasive vorne), Morphologie (z.B., nuklearer Qualität, Architektur, Mitosen, zytologischen Merkmale), Biomarker Status (d.h., Östrogen-Rezeptor (ER) und Progesteron-Rezeptor (PR), Ki67 und HER2), und alle anderen IHC-Funktionen zur Verfügung.
    1. Speichern Sie das Dokument.
  2. Erstellen Sie ein TMA-Projekt.
    1. Installieren Sie und öffnen Sie der TMA-Designer-Software.
    2. Definieren den TMA-Empfänger Blöcke: Zugriff über das Menü Datei > Neu > Block oder mithilfe von Strg + B.
    3. Klicken Sie in das erste Feld ausfüllen oder drücken die Tab-Taste, und geben Sie in Dimensionen von den Paraffinblock: Breite 35 (mm), Höhe (mm) 20. Typ "2" als "Marge" Wert (d.h., Abstand von Paraffin in mm) (Abbildung 1 b). Sichern Sie die Daten, indem Sie auf die entsprechende Schaltfläche. Die neue Vorlage des Empfängers Block ist nun gespeichert und bereit, neue Gewebe Array Vorlagen verwendet werden.
    4. Erstellen Sie ein Array Projekt Gewebe: Zugriff auf das Menü Datei > Neu > Tissue Arrays oder mithilfe von Strg + T.
    5. Geben Sie den Namen der Gewebe-Array, Kommentare und Autor, und klicken Sie auf "weiter". Klicken Sie auf das Symbol "importieren", wählen Sie die Template-Datei des Empfängers Block zuvor erstellt, und klicken Sie auf "weiter".
    6. Wählen Sie 1 mm als die Punktgröße, indem Sie auf den runden Knopf. Wählen Sie 500 µm als Ort Abstand ist der Raum zwischen zwei Zentren der benachbarten Orte. Klicken Sie auf das Rechnersymbol berechnen die Gesamtzahl der Punkte erstellt, das 231 sein sollte. Klicken Sie auf "weiter".
    7. Definieren Sie den spot Nummerierungen-Modus, indem Sie einmal darauf klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche "definieren" Grids und Unterraster erstellen. Löschen der central Line (Linie 6) und die Spalten 8 und 15. 3 Spots von Linie 1 zur Orientierung zu erhalten. Die endgültige Karte sollte eine Gesamtanzahl von 183 Plätze umfassen, wie Sie in Abbildung 2dargestellt.
    8. Definieren Sie die Liste der Gewebetypen: Zugriff über das Menü Datei > Neu > Liste der Gewebearten oder mithilfe von Strg + L.
    9. Legen Sie die Gewebe Beschreibungen zuvor definiert. Drücken Sie Pfeil nach unten oder klicken Sie auf die Taste +, um eine Zeile hinzufügen.
    10. Das Projekt zu definieren: Zugriff über das Menü Datei > Neu > Booster Projekt oder mithilfe von Strg + P.
    11. Geben Sie den Namen der Gewebe Array, Kommentare und Autor, und klicken Sie auf "weiter". Importieren Sie die Kalkulationstabellendatei, Liste der Gewebetypen und das Gewebe Array Modell zuvor erstellt, indem Sie auf die entsprechenden Symbole.
    12. Klicken Sie auf "alle auswählen" und definieren Sie die Anzahl der Plätze für jede Art von Gewebe; Klicken Sie auf die "Match"-Taste, um die Einstellungen zu übernehmen. Es erscheint eine Tabelle mit der Gesamtzahl der Kerne, die abgetastet und auf Empfänger Blöcke in diesem Projekt übertragen werden. Speichern Sie das Projekt und schließen Sie das Programm.
  3. Bereiten Sie den Akzeptor-Blöcke (Abbildung 1 b).
    1. Füllen Sie gereinigte Metallformen mit elastischen Paraffin bei 65 ° C.
    2. Lassen Sie der Paraffin-Blöcke bei Raumtemperatur über Nacht innerhalb der Metallformen abkühlen.
    3. Auszug der Paraffin-Blöcke aus der Metallformen. Wenn Risse auftreten, verwerfen Sie den Block zu und wiederholen Sie die Schritte 2.3.1-2.3.3.
  4. Die TMA mit einer automatischen oder halbautomatischen Arrayer19zu konstruieren.
    1. Alle ausgewählten FFPE-Blöcke und die entsprechenden H & E Abschnitte mit Anmerkungen abrufen.
    2. Schalten Sie den Arrayer und legen Sie den Akzeptor-Blöcke auf dem Arrayer Karussell.
    3. Öffnen Sie die Arrayer Control Station Software zu, klicken Sie auf "Neues Gewebe Array" und laden Sie das Projekt zuvor erstellt (Abbildung 1).
    4. Klicken Sie auf "Weiter" und wählen Sie die Position des Spenders Blöcke aus dem Menü.
    5. Definieren Sie die Startposition auf jeden Empfänger Block: verwenden Sie die Pfeiltasten zu bewegen das Laserlicht und richten Sie ihn mit dem linken oberen Rand auf das Paraffin des Empfängers Blocks.
    6. Klicken Sie auf "weiter", und wiederholen Sie für die vertikale Ausrichtung.
    7. Klicken Sie "weiter", um automatisch ein Loch in die zuvor definierten Koordinate des Empfängers (Akzeptor) Block erstellen.
    8. Leeren Sie den Stempel.
    9. Positionieren Sie den Spender-Block für die Probenahme und entfernen Sie einen Gewebe-Kern aus zuvor kommentierte Interessengebiet.
    10. Legen Sie den Spender Gewebe Kern in das Loch in der Empfängersperrliste (Akzeptor).
    11. Entfernen Sie den Spender-Block aus den Arrayer.
    12. Wiederholen Sie Schritte 2.4.5-2.4.11, bis die TMA abgeschlossen ist.
  5. Der Gewebeseite der neu generierten TMA-Block auf eine sterile leere Folie und legen Sie sie in den Labor-Ofen bei 45 ° C für 5 min.
  6. Drücken Sie vorsichtig den Block auf der Folie für 5 s, die Gewebe-Kerne flach. Wiederholen Sie einmal (für insgesamt 2 Mal).
  7. Die TMA-Block zusammen mit der Folie aus dem Ofen nehmen, spiegeln und den Block aus der Folie vorsichtig lösen.
  8. Abdeckung der TMA-Gewebe-Oberfläche mit einer dünnen Schicht aus elastischen Paraffin bei 65 ° C.
  9. Lassen Sie den TMA-Block bei Raumtemperatur für 2 h.
  10. Übertragung der TMA-Block bei 4 ° C für 24 h.
    Hinweis: Die TMA-Block kann bei 4 ° C bis zur Erschöpfung gespeichert werden.

(3) histochemische und immunhistochemische Analysen

  1. TMA-Zuschnitte.
    1. Legen Sie die TMA-Akzeptor-Blöcke mit Paraffin-Seite nach unten auf einer Fläche von bis zu-10 ° C für 10 min das Paraffin zu entspannen.
    2. Füllen Sie zuerst eine Floating-Bad mit Reinstwasser und Hitze bis 38 ° C.
    3. Legen Sie ein neues Blatt auf ein rotary Mikrotom und fügen Sie den Block in das Mikrotom-Futter, so dass der Wachs-Block die Klinge steht und sich in der vertikalen Ebene orientiert.
    4. Nähern Sie sich des Blocks sorgfältig mit dem Messer und schneiden Sie ein paar dünne Abschnitte um sicherzustellen, dass die Positionierung stimmt; passen Sie bei Bedarf.
    5. Geschnitten Sie 3 µm dicke Abschnitte.
    6. Nehmen Sie die Abschnitte mit einer Pinzette und schweben sie über der Wasseroberfläche Bad.
    7. Wählen Sie die Abschnitte aus dem Wasserbad auf regelmäßige und IHC/ISH Objektträgern.
    8. Legen Sie die Folien auf einem Gestell und über Nacht im Backofen bei 45 ° C aufbewahren.
      Hinweis: Sobald vorbereitet, sollte die TMA-Abschnitte innerhalb von 24 h befleckt werden.
  2. Führen Sie histochemische Färbung (H & E) mit einem Autostainer.
    1. Legen Sie die Folien in Autostainer Rack und legen Sie sie bei 60 ° C für 10 Minuten.
    2. Öffnen Sie die Last-Schublade der Autostainer und legen Sie das Gestell mit der TMA in eines der Ladestationen mit einem standard H & E-Clip nach außen gleitet.
    3. Sobald die Schublade geschlossen, der Clip automatisch vom System erkannt wird und das folgende Protokoll starten: Ofen-Station bei 37 ° C (6 min), Xylol (2 min), Xylol (2 min), Ethanol 100 % (2 min), Ethanol 100 % (2 min), Ethanol 95 % (2 min), Ethanol 95 % (2 min) , destilliertes Wasser (4 min), Carazzis Hämatoxylin (9 min), Niederdruck fließendes Wasser (2 min), Eosin 1 % (1 min), Niederdruck fließendes Wasser (2 min), Ethanol 95 % (20 s), Ethanol 95 % (20 s), Ethanol 95 % (20 s), Ethanol 95 % (20 s), Ethanol 100 % (15 s), Ethanol 100 % (15 s) , Xylol (30 s), Xylol (30 s).
    4. Entladen Sie die Regale aus der Schublade und montieren Sie die Folie mit einem Deckglas.
      1. Einen Tropfen des Berges mit einer Pipette zu sammeln und legte es auf einen äußeren Rand der Abdeckung Folie.
      2. Legen Sie die nasse Seite des Deckglases auf der Folie und lassen Sie die Halterung für 30 min trocknen.
  3. Führen Sie IHC beflecken für ER, PR, Ki67 und HER2 mit einem automatisierten Immunostainer.
    Hinweis: Bevor Sie beginnen eine Färbung laufen, starten Sie das System und überprüfen Sie die Verbrauchsmaterialien Reagenz Flaschen (Table of Materials) und Abfall Container.
    1. Legen Sie die TMA-Folien, bei 60 ° C für 10 min zu analysieren.
    2. Starten Sie das Immunostainer Instrument und Software.
    3. Klicken Sie auf die Home-Ansicht auf Protokolle, und klicken Sie dann auf Protokolle erstellen/bearbeiten.
    4. Wählen Sie den standard DAB (3, 3'-Diaminobenzidine) IHC Verfahren die grundlegende Vorlage ändern.
    5. Flag "Deparaffinisierung" in der Liste und die mittlere Temperatur bei 72 ° C.
    6. Flagge der cc1 Demaskierung Lösung, stellen Sie die mittlere Temperatur bei 95 ° C und die Inkubationszeit bei 36 min.
    7. Flagge der Primärantikörper Box, legen Sie die ID des das ER Inline-Dispenser (die Gerätesoftware wird den Spender auf die Reagenzienkarussell erkennen) und legen Sie die Inkubationszeit bei 16 min.
    8. Kennzeichnen Sie das Counterstaining-Feld, wählen Sie Hämatoxylin ich und die Inkubationszeit bei 12 min-Set.
    9. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Speichern unter" und benennen Sie das Protokoll.
    10. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.3-3.3.9 für die übrigen Antikörper mit Hilfe der folgenden primären Antikörper Inkubationszeiten: PR 16 min, Ki67 16 min und HER2 12 min. verwenden vorverdünnt Ready to Use (RTU) Antikörper.
    11. Klicken Sie auf die Home-Ansicht auf Beschriftung erstellen.
    12. Klicken Sie auf Protokolle und fügen Sie die ER, PR, Ki67 und HER2 Protokolle für jede der TMA zu analysieren.
    13. Klicken Sie auf Close Aufttraggeber.
    14. Wie die Etikettenvorlage angezeigt wird, geben Sie die TMA-IDs für das Label.
    15. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Drucken", um die Etiketten zu drucken und dann auf den TMA-Folien anzuwenden.
    16. Klicken Sie auf Gerät und legen Sie den Startmodus Instrument als "Ready".
    17. Öffnen Sie die Motorhaube, die Reagenzien Karussell abdeckt, platzieren Sie das Erkennungssystem und Primärantikörper, schließen Sie die Motorhaube.
    18. Klicken Sie auf eine Folie-Schublade zu öffnen, laden die TMA-Folien und Schließen der Schublade mit dem gleichen Button Taste an die Vorderseite.
    19. Legen Sie den Startmodus Instrument "Laufen" und folgen Sie den Anweisungen.
    20. Am Ende der Laufzeit, entladen die TMA gleitet durch Drücken geöffnet alle Schubladen mit abgeschlossen Folien-Taste auf das Gerät schieben Sie Kontrolle und spülen wärmen sie in Seifenwasser entfernen Sie alle verbleibenden Reagenzien.
    21. Waschen Sie die Objektträger unter Niederdruck fließendem kalten Wasser, Entwässern Sie die TMA-Folien und wenden Sie einem Glas Deckgläschen auf jeder Folie an.
  4. IHC Analyse von ER, PR und HER2 nach der amerikanischen Gesellschaft der Clinical Oncology (ASCO) / Leitlinien, Kappe und der Ki67 entsprechend den Empfehlungen der internationalen Ki67 in Brustkrebs-Arbeitsgruppe (Tabelle 2).
    Hinweis: Diese Analyse sollte separat in den diskreten Gewebe stellen von einem Pathologen mit Erfahrung in der Brust Pathologie durchgeführt werden.
    1. Bewerten Sie den ER Ausdruck als positiv, wenn ≥ 1 % des Tumors Zellkerne immunreaktiven20,21,22,23 sind.
    2. Bewerten Sie den PR-Ausdruck als positiv, wenn ≥ 1 % des Tumors Zellkerne immunreaktiven20,21,22,23 sind.
    3. Die HER2-Expression als zu beurteilen: (a) score 3 + Wenn umlaufende Membran Färbung, die vollständig und intensiv, ist b) score 2 + Wenn umlaufende Membran Färbung unvollständig und/oder schwachen/mäßig ist und innerhalb von > 10 % der invasiven Tumorzellen oder komplette und umlaufende Membran Färbung ist intensiv und innerhalb von ≤ 10 % der invasiven Tumorzellen, C) score 1 + wenn unvollständige Membran Färbung schwache/kaum wahrnehmbar ist und innerhalb von > 10 % der invasiven Tumorzellen, d) negativ wenn keine Flecken vorhanden ist oder Membran Färbung ist unvollständig und schwache/kaum wahrnehmbar und innerhalb von ≤ 10 % der invasiven Tumor Zellen3,24.
    4. Den Ki67-Index zu bewerten, da der Anteil der Zellen mit nuklearen Färbung in mindestens 1.000 neoplastischen Zellen nach dem Zufallsprinzip über 10 Hochleistungs-Felder (400 X Vergrößerung ausgewählt)25.

(4)-Analyse von HER2

  1. TMA-Abschnitte (wiederholen Sie Schritt 3.1) schneiden.
  2. Führen Sie für HER2 mit einem automatisierten Immunostainer.
    1. Legen Sie die TMA-Folien, bei 60 ° C für 10 min zu analysieren.
    2. Starten Sie das Immunostainer Instrument und Software.
    3. Klicken Sie auf die Home-Ansicht auf Protokolle, und klicken Sie dann auf Protokolle erstellen/bearbeiten.
    4. Wählen Sie die "U Dual ISH CKT" Prozedur die grundlegende Vorlage ändern.
    5. Fahne "Trocknung" in der Liste und stellen Sie die Temperatur bei 63 ° C für 20 Minuten.
    6. Fahne "Konditionierung Zelle" in der Liste Feld, dann "Zelle Konditionierung CC2", und stellen Sie die Temperatur 86 ° C und Inkubation Zeitpunkt bei 4 min.
    7. Kennzeichnen Sie milde CC2 (Zyklus 1), Standard (Zyklus 2) und Extended (Zyklus 3) für 8 min, 12 min und 8 min, beziehungsweise.
    8. "ISH-Protease 3" in der Liste markieren und die Inkubationszeit bei 16 min. festgelegt.
    9. Wählen Sie die Sonden HER2DNP und CHR17DIG und die Inkubationszeit bei 6 h.
    10. Legen Sie die Wäsche bei 76 ° C 8 min.
    11. 32 min. die Inkubationszeit Multimer (SIL ISH DNP HRP) festgesetzt.
    12. Die silbernen Chromogen (SIL ISH DNP CHRC) Inkubationszeit bei 4 min eingestellt.
    13. Die rote Multimer (rote ISH Graben AP) Inkubationszeit bei 24 min eingestellt.
    14. Die rote Chromogen (rote ISH Graben FR) Inkubationszeit bei 8 min eingestellt.
    15. Flag "Counterstaining" in der Liste, wählen Sie "HÄMATOXYLIN II", und die Inkubationszeit bei 8 min.
    16. Fahne "Post-Gegenfärbung" in der Liste, wählen Sie "BLÄUEN Reagenz", und die Inkubationszeit bei 4 min.
    17. Wiederholen Sie die Schritte aus 3.3.11-3.3.15 (Wählen Sie modifizierte U Dual ISH CKT-Protokoll).
    18. Die Kapuze, die Reagenzien Karussell, deckt das Waschen und die ISH-Detection-Systeme legen, dann schließen Sie die Haube geöffnet.
    19. Wiederholen Sie die Schritte von 3.3.18-3.3.21.
  3. Führen Sie Analyse für HER2: die HER2 -gen-Amplifikation als positiv zu beurteilen, ob das HER2-/CEP17-Verhältnis ≥2.0 mit einer durchschnittlichen HER2 Kopie Nummer ≥4.0 Signalen pro Zelle ist, und negativ, wenn die HER2-/CEP17-Verhältnis ist < 2.0 mit durchschnittlich HER2 kopieren Anzahl < 4.0 Signale/Zelle3,24.
    Hinweis: Ähnlich wie bei IHC, diese Analyse durchgeführt werden separat in den diskreten Gewebe-Spots durch einen Pathologen mit Erfahrung in der Brust Pathologie.

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Representative Results

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Insgesamt 444 invasivem Brustkrebs, Krebserkrankungen in 15 TMAs speziell optimiert für ISH Analysen aufgenommen wurden. Unter den 2.664 Punkten abgetastet 2.651 (99,5 %) waren Vertreter der zuvor ausgewählten Bereiche und daher als für spätere Analysen. Intra-Tumor Heterogenität wurde durch IHC und SIH, mit besonderem Schwerpunkt auf die heterogene Verteilung der HER2-positivem Klone in der topographischen Bereiche der Tumoren bestimmt. Tabelle 3 zeigt die biologischen Eigenschaften der Fälle analysiert, mit Schwerpunkt auf den ER, PR, Ki67 und HER2-Status in verschiedenen Histotypes. 18 % der Fälle fanden sich insbesondere HER2-positiven Zellen in Anzeige > 10 % der Tumorzellen, und daher die Merkmale für HER2-positive Bewertung abgeglichen. Interessanterweise ist dieser Wert näher an das untere Ende der gemeldeten Fälle von HER2-positivem Brustkrebs. Auf der anderen Seite war der HER2-Status Variable in den diskreten Bereichen von HER2-positivem und HER2-negativem Brustkrebs (Abbildung 3, Tabelle 4), Bereitstellung von weiteren glauben an die Vorstellung, dass Brustkrebs eine sehr heterogene Erkrankung bei Genomebene. Die Ausfallrate von der-Analyse war 0,8 %, mit einer Gesamtzahl von 2.629/2.651 Flecken in dem Dinitrophenol-markierte Sonde an die Ziel-Sequenzen gebunden.

Figure 1
Abbildung 1 : Darstellung von Cornerstone Phasen bei der Realisierung einer Hochdurchsatz-Plattform für die Analyse von HER2 Heterogenität in großen Kohorten der Mammakarzinome. (A) Auswahl der Bereiche zu probieren sollte auch die Identifizierung und Höhepunkt aller Bereiche mit zytologischen, Architektur, oder IHC Heterogenität. (B) einer der wichtigsten Schritte dieses Verfahrens ist die Schaffung eines qualitativ hochwertigen Akzeptor-Blocks, angesichts der Tatsache, dass sogar ein mikroskopisch kleine Riss die Konsistenz der nachfolgenden in Situ Hybridisierung Analysen ableiten könnte. (C) ist es wichtig, eine digital geführten Arrayer mit einer 1 mm Durchmesser Nadel Hochverzinsliche TMA basiert auf der Technik Kononen bauen beschäftigen. (D) sollte die Erstellung des TMA-Projekts aus der Definition der Dimensionen und Grenzen der TMA beginnen. (E) alle IHC und ISH Analysen sollten digitale Pathologie Werkzeugen, um schnell über die TMA navigieren durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Planimetrischen Darstellung der TMA für dieses Protokoll realisiert. Insgesamt 180 Punkte von 1 mm Durchmesser, 500 µm auseinander, ermöglichen eine optimale in Situ Hybridisierung. Dichtere TMAs bieten unproduktive Ergebnisse in Bezug auf Qualität und Einheitlichkeit der Reaktionen auf alle Spots mit einer höheren Ausfallrate auf einer einzigen vor-Ort-Basis. Beachten Sie die "Ausrichtung" Spots in oben und Mitte-links des Rasters. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Repräsentative Mikrographen zeigt das Silber in situ Hybridisierung Analyse von einer HER2-heterogene Brustkrebs. In diesem paradigmatischen Beispiel zeigte zwei unterschiedliche Flecken von einem hochwertigen invasiven Brustkrebs keine besondere Art (BR_121) unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf HER2 -gen (schwarz)-Verstärkung im Vergleich zu dem Zentromer Enumeration Sonde 17 (rot). Insbesondere ein Bereich gehören zu den Tumor-Kern und zeigen, Cytokeratin 7 unregelmäßigen Muster Färbung war HER2 verstärkt (A), während ein einzelner Punkt von invasiven vorne (z.B. Tumor Rand) einen Wildtyp HER2 angezeigt Muster (B). Skalieren von Balken = 50 µm (20 µm in der Einsätze). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Fall-ID Block-ID Bereichskennung Gewebe Topographie Morphologie ER PR Ki67 HER2 Sonstige IHC-Funktionen
BR_121 A5 ein Normal Operative Marge
BR_121 A1 ein NST Tumor-Kern G2 CK7 +
BR_121 A1 b NST Tumor-Kern G3 CK7 + /-
BR_121 A3 ein NST Tumor-Kern Schleimigen stroma 90 100 12 2 +
BR_121 A3 b NST Invasive vorne Röhrenförmige 100 100 35 2 +
BR_121 A4 ein NST Invasive vorne G3
BR_121 A3 c DCIS (EIC +) Neben invasiven vorne Hochwertige 100 100 45 2 +

Tabelle 1: repräsentative Rekord von einem Fall in die Studie einbezogenen. Dieser Fall (BR_121) war eine hochwertige invasives Karzinom keine besondere Art mit Schwerpunkt myxoid Stroma, röhrenförmigen Nebenkomponente an der Peripherie der Läsion und fokale unregelmäßigen Verlust von CK7 Immunoexpression gezeichnet. Die immunhistochemische Features, einschließlich Biomarker Berichterstattung, bezieht sich auf den Analysen zum Zeitpunkt der Diagnose. NST, invasives Karzinom keine spezielle Art; DCIS, Duktales Karzinom in Situ; EIC +, umfangreiche intraduktale Komponente; CK7, Cytokeratin 7.

Marker Klon Unternehmen Verdünnung Entwachsen Antigen-retrieval Antikörper-Inkubation Scoring-system
ER SP1 Ventana RTU EZ Prep bei 72 ° C CC1 bei 95 ° C für 36 min 16 min. ASCO/CAP Richtlinien23
PR 1E2 Ventana RTU EZ Prep bei 72 ° C CC1 bei 95 ° C für 36 min 17 min. ASCO/CAP Richtlinien23
HER2 4 B 5 Ventana RTU EZ Prep bei 72 ° C CC1 bei 95 ° C für 36 min 18 min. ASCO/CAP Richtlinien3
Ki67 30-9 Ventana RTU EZ Prep bei 72 ° C CC1 bei 95 ° C für 36 min 12 min. Internationalen Ki67 bei Brustkrebs arbeiten Gruppe Empfehlungen25

Tabelle 2: Liste der Antikörper, Klone, Verdünnungen, Antigen Abrufmethoden und scoring-Systeme für immunhistochemische Analysen angenommen. ER, Östrogen-Rezeptor; PR, Progesteron-Rezeptor; RTU, Ready-to-Use.

Histotype n (%) ER + (%) PR + (%) Ki67-niedrig (%) Ki-67-hoch (%) HER2 + (%)
Invasives Karzinom keine besondere Art 344 (77,5) 301 (87,5) 257 (74,7) 85 (24,7) 259 (75,3) 71 (20,6)
Invasives lobuläres Karzinom 53 (11,9) 53 (100,0) 44 (83,0) 36 (67,9) 17 (32,0) 4 (7,5)
Invasives Karzinom, gemischten Typ 9 (2.0) 8 (88,9) 6 (66,7) 0 (0,0) 9 (100,0) 1 (11.1)
Tubuläre Karzinom 8 (1.8) 8 (100,0) 8 (100,0) 8 (100,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
Muzinösen Karzinom 11 (2.4) 11 (100,0) 9 (81,8) 7 (63,6) 4 (36,4) 0 (0,0)
Micropapullary Karzinom 7 (1.6) 7 (100,0) 7 (100,0) 5 (71,4) 2 (28,6) 2 (28,6)
Invasives Karzinom mit apokrinen featueres 5 (1.1) 3 (60,0) 1 (20,0) 1 (20,0) 4 (80,0) 3 (60,0)
Papilläres Karzinom 1 (0.2) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (100,0) 0 (0,0)
Medulläre Karzinome 4 (0,9) 0 (0,0) 1 (25,0) 0 (0,0) 4 (100,0) 0 (0,0)
Metaplastische Karzinome 2 (0,5) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (100,0) 0 (0,0)
Insgesamt 444 391 (88,0) 333 (75,0) 142 (32,0) 302 (68,0) 81 (18,2)

Tabelle 3: Brust-Krebs Histotypes, Rezeptor-Status und HER2-Status Heterogenität. ER, Östrogen-Rezeptor; PR, Progesteron-Rezeptor; Ki67-niedrig, Ki67 Index < 18 %; Ki67-High, Ki67 > 18 %.

Interpretierbare neoplastischen Flecken HER2-positiver Flecken (%) Hormonstatus Rezeptoren HER2-heterogene Fälle
6 5 (83) positive 10
6 5 (83) negative 1
6 4 (67) positive 7
6 4 (67) negative 1
6 2 (33) negative 1
6 1 (17) positive 1
5 3 (60) positive 10
5 1 (20) positive 2
4 3 (75) positive 9
4 2 (50) positive 8
4 1 (25) negative 1
3 2 (67) positive 5
3 1 (33) positive 2
46 25 (54) 53 (93) 57

Tabelle 4: HER2 Ausdruck, Hormon-Rezeptor-Status und HER2-heterogene Fälle. Unter 57 HER2-heterogene Fälle waren 4 (7 %) der Fälle ER negativ und PR-Negative, die klinische Bedeutung der Bewertung HER2 Heterogenität zu bestätigen.

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Discussion

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Hier haben wir die Labor-Strategien Analysen das HER2 -gen und seine entsprechenden Zentromer in hochverzinsliche TMAs der heterogen verarbeiteten Mammakarzinome durchführen detaillierte. Diese Methode ist kostengünstig und kann in den meisten Labors für die Untersuchung von HER2 Gens Verstärkung Heterogenität in großen Kohorten der Brust Krebs abgerufen Form Pathologie Archive durchgeführt werden.

Aufgrund der klinischen Bedeutung des HER2 Tests bei Brustkrebs und die Herausforderungen, die durch ihren heterogenen Ausdruck erzeugt entwickelten wir eine Hochdurchsatz-Testprotokoll um Intra - und inter - tumor HER2 genetische Heterogenität zu beurteilen. Die analysierten Bereiche umfassen Pre-invasive und invasive Komponenten auf der Grundlage der spezifischen zytologische, architektonischen und IHC Features.

Es gibt mehrere kritische Phasen, die in diesem Protokoll sorgfältig verwaltet werden sollen. Ein wesentlicher Schritt ist die Auswahl der Regionen von Interesse. Wir haben festgestellt, dass die Beschriftung der einzelnen topographischen Bereiche durch einen multidisziplinären Ansatz entscheidend ist für die Qualität der endgültigen molekulare Analyse zu gewährleisten. Insbesondere die gemeinsame Revision der diagnostischen Folien von einem Pathologen durchgeführt und ein Techniker enorm erhöhen Sie die Anzahl der angemessene Spots (d.h. Spots reflektieren Bereich identifiziert auf der Folie) und anschließend reduzieren die Ausfallrate von die Single-Spots-Analyse. Allerdings können mehrere Tumor Spots Schnittserien für mehrere IHC und ISH Analysen verloren. Um diese Unannehmlichkeit zu überwinden, empfehlen wir konstruieren TMAs in doppelt oder dreifach, wenn überhaupt möglich nach Gewebe Verfügbarkeit je. Darüber hinaus unterstreichen wir die Bedeutung der Festlegung strenger Laborverfahren für die Erstellung der Akzeptor FFPE Blöcke für die TMAs. In der Tat haben wir beobachtet, dass ein minimaler Riss in der TMA-Block die gesamte ISH-Analyse in Bezug auf Qualität, Reproduzierbarkeit und Klarheit der Reaktion ableiten könnte. Wenn Risse auftreten, sollte der Spender-Block für TMA Bau ignoriert werden. Es sollte jedoch anerkannt werden, dass IHC auch in suboptimalen TMAs durchgeführt werden konnte, und nach unserer Erfahrung keine Hinweise auf technische Probleme bei solchen Analyse eingehalten worden.

Trotz, dass dieses Protokoll speziell für HER2 Analysen hochverzinsliche Brust TMAs optimiert ist, ist es bemerkenswert, dass andere Analysen wie Fisch und IHC, zuverlässig in verschiedenen Gewebetypen, wie zuvor beschrieben14ausgeführt werden können, 19,26. Allerdings haben wir hier die ideale Anzahl von Flecken und das topographische Merkmal der TMA Sicherstellung qualitativ hochwertige und reproduzierbare Analysen des HER2 -Gens bei Brust Krebs Proben definiert. Ein weiterer wichtiger Punkt ist vertreten durch die Umgestaltung des automatisierten Standardprotokolle entsprechen die Besonderheit der mehrere Proben analysiert werden. In der Tat, die Hersteller Richtlinien werden im Allgemeinen für die molekulare Analysen der konventionellen Full-Face Abschnitte gebildet und sind daher nicht in der Lage, hohe Standards auf heterogen verarbeitete Gewebe Proben, wie z. B. in TMAs aus archivalischen FFPE-Blöcken zu erreichen. Zu diesem Zweck haben wir eine schrittweise Beschreibung eines zuverlässigen benutzerdefinierten Protokolls für-Analysen in diesen problematischen Proben bereitgestellt.

Es wäre äußerst nützlich, um die Heterogenität der HER2-Expression und Amplifikation Gen in Bezug auf die heterogene Verteilung der anderen klinisch verwertbare molekularen Biomarker bei Brustkrebs zu erkunden. Zu diesem Zweck sind weitere translationale Forschungsstudien erforderlich, um die Gültigkeit unserer Methode für andere klinisch relevanten molekulare Analysen, wie Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie imaging (MALDI-MSI)27zu erkunden. Vor kurzem geworden das Management von FFPE Gewebe für MALDI-MSI Analyse machbar, wenn auch eine Herausforderung. Diese in Situ Proteomik-Technik ermöglicht die Visualisierung der räumlichen Verteilung von Proteinen und Peptiden in pathologischen Gewebeschnitten, einschließlich Brustkrebs.

Dieses Protokoll hat einige wichtige Schritte, die letzten Endes möglicherweise beeinträchtigen können. Erste, besondere Augenmerk ist auf die verschiedenen Mechanismen, die HER2 -Amplifikation. Chromosom 17 polysomy ist beispielsweise eine genetische Anomalie, die auftreten, in der Brust Krebs11, einen bekannten alternativen Mechanismus für die erhöhte Anzahl der HER2 -Kopie darstellt. Diese Bedingung kann wenn auch nicht häufig, nicht nur die biologischen Funktionen von Krebs und Patientenmanagement, sondern auch die ISH-Analysen auswirken. Zweitens ist es beschrieben worden, dass genetische Heterogenität Intra-Tumor auch auf eine einzelne Zelle Ebene und nicht nur in verschiedenen neoplastischen Bereichen auftreten. Dieses Protokoll ist nicht in der Lage, die Erkennung macht diese besondere Situation im Vergleich zu Full-Face Abschnitten zu erhöhen. Darüber hinaus ist es wichtig hervorzuheben, dass die TMA-basierte Studie der räumliche Heterogenität einige immanente Grenzen hat, auch das Fehlen einer umfassenden Analyse des gesamten Abschnitts. Diese Studie sollte jedoch ein Proof of Principle betrachtet werden, dass die Heterogenität der HER2 -gen-Amplifikation mittels einer Hochdurchsatz- und kostengünstige Plattform, mit standard-Labor-Ausrüstung bewertet werden kann. Weitere Studien analysieren Integralhelm Schnittserien der HER2-heterogene Fälle, gepaart mit modernster Molekular-Studien und klinischen Patientendaten müssen dieses Protokoll zu überprüfen.

Abschließend sollten die umfassende Kartierung des HER2-Status in heterogenen HER2 Brustkrebs Krebs Proben und die Untersuchung der möglichen Fahrer Genmutationen in HER2-negativem Komponenten auf die Analyse mehrerer neoplastischen Regionen verlassen. Diese Analyse würde unerträglich Kosten und Anstrengungen mit standard diagnostischen Einrichtungen erfordern. Diese Methode stellt ein zuverlässiges Werkzeug für die gleichzeitige Charakterisierung von HER2 genetische Heterogenität in große Mengen von mehreren und heterogen verarbeiteten Mammakarzinome.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Keine.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

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References

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Aufbau einer Hochdurchsatz-Screening-Plattform zu beurteilen, die Heterogenität der HER2-Gene-Verstärkung in Brust-
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Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

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