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Immunology and Infection

Costruire una piattaforma di High-throughput Screening per valutare l'eterogeneità dell'amplificazione del Gene HER2 nei cancri al seno

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

Distribuzione eterogenea delle cellule HER2-positive può essere osservato in un sottogruppo di tumori al seno e genera dilemmi clinici. Qui, presentiamo un protocollo affidabile ed economico per definire, quantificare e confrontare eterogeneità genetica intra-tumore di HER2 in un'ampia serie di cancri al seno eterogeneo trasformati.

Abstract

Terapie mirate contro il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2) hanno cambiato radicalmente il risultato dei pazienti con tumori al seno HER2-positivo. Tuttavia, una minoranza dei casi viene visualizzata una distribuzione eterogenea delle cellule HER2-positive, che genera grandi sfide cliniche. Fin qui, nessun protocolli affidabili e standardizzati per la caratterizzazione e la quantificazione dell'amplificazione del gene HER2 eterogenei in larghe coorti sono state proposte. Qui, presentiamo una metodologia di alto-rendimento per valutare contemporaneamente lo stato di HER2 in diverse aree topografiche dei cancri al seno più. In particolare, vi illustriamo la procedura di laboratorio per la costruzione di microarrays di avanzata del tessuto (TMAs) incorporando una mappatura mirata dei tumori. Tutti i parametri di TMA sono stati ottimizzati in modo specifico per l'argento in situ ibridazione (SISH) di formalina-fisso la tessuti del seno di paraffina (FFPE). L'analisi di Immunohistochemical dei biomarcatori prognostici e predittivi (cioè, ER, PR, Ki67 e HER2) deve essere eseguita utilizzando procedure automatizzate. Un protocollo personalizzato di SISH è stato implementato per consentire un'analisi molecolare di alta qualità attraverso tessuti multipli che ha subito diverse procedure di fissazione, elaborazione e archiviazione. In questo studio, forniamo un prova-de-principio che sequenze specifiche del DNA potrebbero essere tumori della mammella localizzate simultaneamente in distinte aree topografiche della multipla ed eterogeneo trasformati utilizzando un metodo efficiente ed economico.

Introduction

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HER2 è un proto-oncogene che è overexpressed ed amplificato in 15-30% di tutti i invasivo al seno tumori1,2. Iperespressione di HER2 è dedotto dalla presenza di > 10% di cellule con membrana forte immunoistochimica (IHC) colorazione (3 +), mentre l'amplificazione del gene può essere valutato quando il rapporto di HER2/centromero è ≥ 2 oppure il numero di copie del gene è ≥ 6, sul conteggio almeno 20 celle di in situ di ibridazione (ISH)3.

Eterogeneità genetica intra-tumorale è stata ampiamente descritta nei cancri al seno, essendo un contributo potenzialmente negative per valutazione di biomarcatori e trattamenti risposta4. Secondo la College di patologi americani (PAC), eterogeneità di HER2 esiste se HER2 è amplificato > 5% e < 50% di infiltrazione del tumore cellule5. Purtroppo, l'incidenza effettiva della eterogeneità spaziale HER2 nei cancri al seno rimane un argomento di polemica tra patologi, con alcuni autori sostenendo che è un evento eccessivamente raro, e altri che suggeriscono che fino al 40% dei casi sono HER2-eterogenei1,5,6,7,8,9,10. Nonostante i meccanismi biologici che sono alla base di questa condizione non sono ancora completamente chiariti, l'impatto prognostico e clinico di eterogeneità di intra-tumore HER2 è cruciale per seno cancro pazienti11.

Recentemente, luminoso-campo tecniche molecolari, quali ISH cromogenica (CISH) e argento ISH (SISH), sono emersi come metodi affidabili per rilevare HER2 eterogeneità nei tessuti FFPE, con alcuni vantaggi rispetto al fluorescenti ISH (pesce)12. Purtroppo, l'analisi di massa di singoli casi rimane impraticabile in studi di coorte di grande ricerca. Parecchi gruppi hanno suggerito che la combinazione di istochimica, IHC e ISH con tecnologie TMA potrebbe rappresentare una strategia utile nello studio della biologia del cancro13,14,15,16. Con questo metodo ampiamente adottato, campioni di tessuto da pazienti diversi possono essere analizzati contemporaneamente, riducendo al minimo il tessuto e i reagenti impiegati e promuovendo così l'analisi uniforme di una grande serie di casi14. Tuttavia, nessun protocolli sono disponibile per la caratterizzazione molecolare di alto-rendimento simultanea di più campioni di tessuto che ha subito diverse elaborazione in termini di reagenti, tempi di fissazione e metodi di conservazione autonomi, tali come archivio storico blocchi.

Date le implicazioni cliniche e prognostiche di eterogeneità spaziale HER2 nei cancri al seno, abbiamo sviluppato una piattaforma integrata molecolare per valutarlo in ampia serie di casi eterogeneo trasformati. Qui, abbiamo ritrarre le strategie di laboratorio per generare e analizzare l'eterogeneità intra-tumorale di amplificazione di HER2 in high yield TMAs di cancro al seno per mezzo di SISH. Il seguente protocollo è stato sviluppato per i tumori di misura > 5 mm (> pT1b secondo il TNM 2017)17. Per le più piccole lesioni, si consiglia di eseguire l'analisi su sezioni di serie integrale. La nostra procedura consente l'analisi simultanea di IHC e SISH di fino a 30 cancri al seno, che comprende una media di 6 zone distinte (gamma 4-8) per ciascun caso. Complessivamente, 180 nuclei di tessuto di 1 mm di diametro, con 500 µm tra il core e 2 mm tra la griglia e bordi verranno generati per ogni blocco TMA.

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Protocol

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Questo studio è stato approvato dalla Institutional Review Boards da IRCCS Ca' Granda Foundation, ospedale Policlinico, Milano, Italia.

1. selezione dei pazienti e dei campioni di tessuto

  1. Recuperare le diapositive archiviazione di tutti i casi per essere analizzati, compresi tutti i disponibile ematossilina ed eosina (H & E) e diapositive IHC dalla diagnosi originale e, se presente, un H & E di abbinati tessuto neoplastico mammario (ad es., margine chirurgico) .
  2. Eseguire revisioni di caso.
    Nota: Per questa attività, almeno due patologi con esperienza in patologia mammaria dovrebbero discutere le diapositive diagnostiche e risolvere disaccordi collegialmente. Utilizzare un microscopio convenzionale o strumenti di telepatologia (quest'ultimo in studi multicentrici di favore). Se del caso, escludere tutti i casi discordanti.
    1. Eseguire la ri-classificazione istologica di tutti i casi secondo l'ultima edizione della classificazione World Health Organization (WHO) dei tumori del seno18.
    2. Assicurarsi che il tessuto normale per ogni caso, se presenti nei campioni clinici archivistici, comprende almeno una unità duttale lobulare terminale non-neoplastico.
    3. Identificare tutte le aree neoplastiche che mostrano eterogenee citologico, architettonico, o caratteristiche IHC usando un microscopio a campo chiaro (da effettuarsi congiuntamente da un patologo e il tecnico che costruirà il TMAs).
  3. Evidenziare le aree topografiche discrete con un pennarello su vetrino o con l'apposito attrezzo sul software diapositiva digitale (Figura 1A).
  4. Basato su diapositive selezionate, recuperare i corrispondenti blocchi FFPE dagli archivi.
    Nota: Per ottimizzare la TMA costruzione, per evitare lo svuotamento del tessuto e per preservare la TMA punch integrità strutturale, casi con < 1 mm di spessore tessuto residuo dovrebbe essere escluso.

2. progettare e costruire TMAs basato sulla tecnica Kononen

  1. Creare e aprire un nuovo file di foglio di calcolo che incorporano i record delle zone distinte di ogni caso. Includere i seguenti dati su colonne separate, come esemplificato nella tabella 1: caso ID, ID del blocco, Area ID, tipo di tessuto (ad es., tessuto normale, componente invasiva istotipo, in situ componente istotipo), topografia (ad es., nucleo del tumore, invasivo anteriore), morfologia (ad es., grado nucleare, architettura, mitosi, caratteristiche citologiche), lo stato di biomarcatori (cioè, ricevitore dell'estrogeno (ER), ricevitore del progesterone (PR), Ki67 e HER2) e tutte le altre caratteristiche IHC disponibili.
    1. Salvare il documento.
  2. Creare un progetto TMA.
    1. Installare e aprire il software di progettazione di TMA.
    2. Definire il destinatario TMA blocchi: accesso tramite il menu File > New > blocco o utilizzando CTRL + B.
    3. Fai clic nel campo primo di riempire o premere il tasto Tab e digitare nelle dimensioni del blocco paraffina: larghezza 35 mm, altezza 20 (mm). Tipo "2" come il valore di "margine" (cioè, la distanza dal bordo di paraffina in mm) (Figura 1B). Salvare i dati facendo clic sul pulsante appropriato. Il nuovo modello di destinatari bloccati verranno salvate e pronto per essere utilizzato nei nuovi modelli di matrice del tessuto.
    4. Creare un progetto di matrice del tessuto: accesso al menu File > New > tessuto matrice o utilizzando CTRL + T.
    5. Immettere il nome della matrice del tessuto, commenti e autore, quindi fare clic su "Avanti". Fare clic sull'icona di "importazione", scegliere il file di modello di destinatari bloccati precedentemente creato e fare clic su "Avanti".
    6. Scegliere 1 mm come la dimensione dello spot facendo clic sul pulsante rotondo. Scegliere 500 µm come spaziatura spot che è lo spazio tra i due centri dei luoghi vicini. Fare clic sull'icona calcolatrice per calcolare il numero totale di punti creati, che dovrebbe essere 231. Fare clic su "Avanti".
    7. Definire le modalità di numerazione spot facendo clic una volta su di esso. Fare clic sul pulsante "definire" per creare reti e sotto-reti. Elimina la central line (linea 6) e le colonne 8 e 15. Mantenere 3 punti della linea 1 per l'orientamento. La mappa finale dovrebbe comprendere un numero totale di 183 macchie, come rappresentato nella Figura 2.
    8. Definire l'elenco di tipi di tessuto: accesso tramite il menu File > New > elenco di tipi di tessuto o utilizzando CTRL + L.
    9. Inserire le descrizioni di tessuto precedentemente definite. Premere freccia giù oppure fare clic sul pulsante + per aggiungere una riga.
    10. Definire il progetto: accesso tramite il menu File > nuovo > progetto Booster o utilizzando CTRL + P.
    11. Immettere il nome della matrice di tessuto, commenti e autore, quindi fare clic su "Avanti". Importare il file di foglio di calcolo, elenco di tipi di tessuto e modello di matrice del tessuto creato in precedenza cliccando le icone corrette.
    12. Fare clic su "Seleziona tutto" e definire il numero di punti per ogni tipo di tessuto; fare clic sul pulsante "partita" per applicare le impostazioni. Verrà visualizzata una tabella che elenca il numero totale di core che verranno campionate e trasferito al destinatari blocchi in questo progetto. Salvare il progetto e chiudere il programma.
  3. Preparare i blocchi accettore (Figura 1B).
    1. Riempire detersa stampi in metallo con inserti paraffina a 65 ° C.
    2. Lasciare i blocchi di paraffina a raffreddare a temperatura ambiente durante la notte all'interno di stampi in metallo.
    3. Estrarre i blocchi di paraffina da stampi in metallo. In caso di crepe, scartare il blocco e ripetere i passi 2.3.1-2.3.3.
  4. Costruire la TMA utilizzando un arrayer automatizzata o semi-automatico19.
    1. Recuperare tutti i selezionati FFPE blocchi e le corrispondenti sezioni H & E con annotazioni.
    2. Accendere il arrayer e inserire i blocchi di ricettore sulla giostra arrayer.
    3. Aprire il software arrayer control station, cliccare su "Nuovo tessuto Array" e caricare il progetto creato in precedenza (Figura 1).
    4. Fare clic su "Continua" e selezionare la posizione di blocco il donatore dal menu.
    5. Definire la posizione iniziale su ogni blocco di destinatari: utilizzare i tasti freccia per spostare la luce laser e allinearlo con il bordo superiore sinistro sulla paraffina del blocco destinatario.
    6. Fare clic su "Avanti" e ripetere per l'allineamento verticale.
    7. Fare clic su "Avanti" per creare automaticamente un buco nella coordinata precedentemente definita del blocco destinatario (accettore).
    8. Svuotare il pugno.
    9. Posizionare il blocco di donatori per il campionamento e rimuovere un nucleo di tessuto dalla zona precedentemente annotata di interesse.
    10. Inserire il nucleo del tessuto donatore nel foro del blocco di destinatario (accettore).
    11. Rimuovere il blocco di donatore dal arrayer.
    12. Ripetere i passaggi 2.4.5-2.4.11 fino al completamento della TMA.
  5. Mettere il lato del tessuto del blocco TMA appena generato su una diapositiva vuota sterile e metterli in forno laboratorio a 45 ° C per 5 min.
  6. Premere delicatamente il blocco sulla diapositiva per 5 s per appiattire i nuclei di tessuto. Ripetere una volta (per un totale di 2 volte).
  7. Rimuovere il blocco TMA insieme con la diapositiva dal forno, capovolgerli e staccare delicatamente il blocco dalla diapositiva.
  8. Coprire la superficie del tessuto TMA con un sottile strato di paraffina elasticizzato a 65 ° C.
  9. Lasciare il blocco TMA a temperatura ambiente per 2 h.
  10. Trasferimento del blocco TMA a 4 ° C per 24 h.
    Nota: Il blocco TMA può essere memorizzato a 4 ° C fino ad esaurimento.

3. istochimiche e Immunohistochemical analisi

  1. Tagliare sezioni TMA.
    1. Posizionare i blocchi di accettore TMA con il paraffina-lato verso il basso su una superficie di-10 ° C per 10 min raffreddare la paraffina.
    2. Riempire una vasca di galleggiamento con acqua ultrapura e impostare calore a 38 ° C.
    3. Inserire una nuova lama su un microtomo rotativo e inserire il blocco nel mandrino microtomo così il blocco di cera si affaccia la lama ed è allineato sul piano verticale.
    4. Avvicinarsi con cautela il blocco con la lama e tagliare alcune sezioni sottili per garantire che il posizionamento è corretto; regolare se necessario.
    5. Tagliare 3 µm di spessore sezioni.
    6. Pick up le sezioni usando la pinzetta e li galleggiare sulla superficie della vasca dell'acqua.
    7. Scegli le sezioni fuori il bagno di acqua su vetrini IHC/ISH e regolari.
    8. Porre i vetrini in un rack e memorizzarli in forno a 45 ° C durante la notte.
      Nota: Una volta preparato, le sezioni TMA dovrebbero essere macchiate entro 24 h.
  2. Eseguire la colorazione istochimica (H & E) utilizza un autostainer.
    1. Inserire le diapositive nel rack autostainer e metterli a 60 ° C per 10 min.
    2. Aprire il cassetto di caricamento del autostainer e Inserisci che il rack con TMA i vetrini in una delle stazioni di carico con una clip standard di H & E rivolto verso l'esterno.
    3. Una volta che il cassetto è chiuso, il clip verrà riconosciuto automaticamente dal sistema e verrà avviato il seguente protocollo: Stazione forno a 37 ° C (6 min), xilene (2 min), xilene (2 min), etanolo 100% (2 min), etanolo 100% (2 min), etanolo 95% (2 min), etanolo 95% (2 min) , acqua distillata acqua (4 min), ematossilina di Carazzi (9 min), acqua corrente a bassa pressione (2 min), eosina 1% (1 min), acqua corrente a bassa pressione (2 min), etanolo 95% (20 s), etanolo 95% (20 s), etanolo 95% (20 s), etanolo 95% (20 s), etanolo 100% (15 s), etanolo 100% (15 s) , xilene (30 s), xilene (30 s).
    4. Scaricare il rack dal cassetto e montare il vetrino con un vetrino coprioggetto.
      1. Raccogliere una goccia di montaggio con una pipetta e metterlo su un bordo esterno della diapositiva coperchio.
      2. Posizionare il lato bagnato del coprioggetto sul vetrino e lasciare il Monte asciugare per 30 min.
  3. Eseguire IHC che macchia per ER, PR, Ki67 e HER2 utilizzando un immunostainer automatizzato.
    Nota: Prima di iniziare a correre colorazione, avviare il sistema e controllare i flaconi di reagenti consumabili (Tabella materiali) e contenitori di rifiuti.
    1. Porre i vetrini TMA per analizzare a 60 ° C per 10 min.
    2. Avviare lo strumento di immunostainer ed il software.
    3. La vista Home, fare clic sul pulsante di protocolli e quindi fare clic su Crea/modifica protocolli.
    4. Selezionare standard DAB (3, 3'-diaminobenzidina) procedura di IHC per modificare il modello di base.
    5. Bandiera "Sparaffinatura" nell'elenco della casella e impostare la temperatura media a 72 ° C.
    6. La soluzione che smaschera cc1 di flag, impostare la temperatura media a 95 ° C e il tempo di incubazione a 36 min.
    7. Contrassegnare la casella di anticorpo primario, inserire l'ID del dispenser inline ER (software dello strumento riconoscerà l'erogatore sulla giostra reagente) e impostare il tempo di incubazione a 16 min.
    8. Contrassegnare la casella controcolorazione, selezionare ematossilina io e impostare il tempo di incubazione a 12 min.
    9. Fare clic sul pulsante "Salva con nome" e il nome del protocollo.
    10. Ripetere la procedura 3.3.3-3.3.9 per i restanti anticorpi usando i seguenti tempi di incubazione gli anticorpi primari: PR 16 min, Ki67 16 min e HER2 12 min utilizzare anticorpi pre-diluito ready-to-use (RTU).
    11. La vista Home, fare clic sul pulsante Crea etichetta.
    12. Fare clic sul pulsante di protocolli e aggiungere i protocolli ER, PR, Ki67 e HER2 per ciascuna della TMA per analizzare.
    13. Fare clic sul pulsante Chiudi /Print.
    14. Come il modello di etichetta viene visualizzata, immettere gli ID di TMA per l'etichetta.
    15. Fare clic sul pulsante stampa per stampare le etichette e quindi applicarli sulle diapositive TMA.
    16. Fare clic sull'icona dello strumento e impostare la modalità di avvio dello strumento come "Pronto".
    17. Aprire il cappuccio che copre il carosello di reagenti, collocare il sistema di rilevamento e gli anticorpi primari, quindi chiudere il cofano.
    18. Fare clic sul pulsante frontale su un cassetto scorrevole per aprirlo, caricare i vetrini TMA e chiudere il cassetto facendo clic sul pulsante stesso.
    19. Impostare la modalità di avvio dello strumento come "in esecuzione" e seguire le istruzioni.
    20. Alla fine dell'esecuzione, scarico TMA diapositive premendo l'aperto tutti i cassetti con risciacquo e completato diapositive pulsante sullo strumento controllo Slide in caldo acqua e sapone per rimuovere eventuali reagenti restanti.
    21. Lavare i vetrini sotto acqua corrente fredda a bassa pressione, disidratare i vetrini TMA e applicare un vetrino coprioggetti a ogni diapositiva.
  4. Eseguire analisi IHC di ER, PR e HER2 seguendo la società americana di oncologia clinica (ASCO) / CAP linee guida e di Ki67 secondo le raccomandazioni dell'internazionale Ki67 nel gruppo di lavoro di cancro al seno (tabella 2).
    Nota: Questa analisi deve essere eseguita separatamente nei punti discreti del tessuto da un patologo con un'esperienza in patologia mammaria.
    1. Valutare l'espressione di ER come positiva se ≥ 1% dei nuclei delle cellule del tumore sono immunoreactive20,21,22,23.
    2. Valutare l'espressione di PR come positiva se ≥ 1% dei nuclei delle cellule del tumore sono immunoreactive20,21,22,23.
    3. Valutare l'espressione di HER2 come: a) Punteggio 3 + se membrana circonferenza macchiatura completo e intenso, b) Punteggio 2 + se colorazione circonferenziale della membrana è incompleta e/o debole/moderata e all'interno di > 10% delle cellule del tumore invasivo o completa e colorazione di membrana della circonferenza è intenso e ≤ 10% delle cellule del tumore invasivo, c) score 1 + se membrana incompleta colorazione è debole/appena percettibile e all'interno di > 10% delle cellule del tumore invasivo, d) negativo se nessuna macchiatura è presente o membrana la colorazione è incompleta e debole/appena percettibile e all'interno di ≤ 10% del tumore invasivo cellule3,24.
    4. Valutare l'indice di Ki67, come la percentuale di cellule con colorazione nucleare in almeno 1.000 cellule neoplastici casualmente selezionati oltre 10 campi ad alta potenza (ingrandimento, 400 X)25.

4. SISH analisi di HER2

  1. Tagliare sezioni TMA (ripetere il punto 3.1).
  2. Eseguire SISH per HER2 utilizzando un immunostainer automatizzato.
    1. Porre i vetrini TMA per analizzare a 60 ° C per 10 min.
    2. Avviare lo strumento di immunostainer ed il software.
    3. La vista Home, fare clic sul pulsante di protocolli e quindi fare clic su Crea/modifica protocolli.
    4. Selezionare la procedura di "U Dual ISH CKT" per modificare il modello di base.
    5. Bandiera "Asciugatura" nell'elenco della casella e impostare la temperatura a 63 ° C per 20 min.
    6. Bandiera "Cella condizionata" nell'elenco della casella, quindi "cella condizionata CC2" e impostare la temperatura a 86 ° C e a incubazione a 4 min.
    7. Bandiera mite CC2 (ciclo 1), Standard (ciclo 2) ed Extended (ciclo 3) per 8 min, 12 min e 8 min, rispettivamente.
    8. Bandiera "ISH-proteasi 3" nell'elenco della casella e impostare il tempo di incubazione a 16 min.
    9. Selezionare le sonde HER2DNP e CHR17DIG e impostare il tempo di incubazione a 6 h.
    10. Impostare il lavaggio a 76 ° C per 8 minuti.
    11. Impostare il tempo di incubazione multimer (SIL ISH DNP HRP) SISH a 32 min.
    12. Impostare il tempo di incubazione di argento Cromogeno (SIL ISH DNP CHRC) a 4 min.
    13. Impostare il tempo di incubazione multimer rosso (rosso ISH scavare AP) a 24 min.
    14. Impostare il tempo di incubazione di cromogeno rosso (rosso ISH scavare FR) a 8 min.
    15. Bandiera "controcolorazione" nell'elenco della casella, selezionare "Ematossilina II" e impostare il tempo di incubazione a 8 min.
    16. Bandiera "post-Counterstaining" nell'elenco della casella, selezionare "Reagente blu" e impostare il tempo di incubazione a 4 min.
    17. Ripetere i passaggi da 3.3.11-3.3.15 (selezionare modificato protocollo U Dual ISH CKT).
    18. Aprire il cappuccio che copre il carosello di reagenti, posizionare il lavaggio e i sistemi di rilevamento di ISH, quindi chiudere il cofano.
    19. Ripetere i passaggi da 3.3.18-3.3.21.
  3. Eseguire analisi SISH per HER2: valutare l'amplificazione del gene HER2 come positivo se il rapporto di /CEP17 di HER2è  2,0 con una media HER2 copia numero ≥4.0 segnali per cella e negativa se il rapporto di /CEP17 di HER2è < 2.0 con una media di HER2 copia numero < 4.0 segnali/cella3,24.
    Nota: Simile a IHC, questa analisi deve essere eseguita separatamente nei punti discreti del tessuto da un patologo con esperienza in patologia mammaria.

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Representative Results

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Nel complesso, al seno invasivo 444 cancri sono stati incorporati in 15 TMAs specificamente ottimizzato per analisi ISH. Tra i luoghi di 2.664 campionati, 2.651 (99,5%) fossero rappresentative delle zone precedentemente selezionate e quindi considerati suscettibili per analisi successive. Eterogeneità intra-tumorale è stata determinata mediante IHC e SIH, con un focus particolare sulle distribuzioni eterogenee dei cloni di HER2-positive nelle distinte aree topografiche dei tumori. Tabella 3 descrive le caratteristiche biologiche dei casi analizzati, concentrandosi sullo stato ER, PR, Ki67 e HER2 all'interno di diversi istotipi. In particolare, il 18% dei casi sono stati trovati per visualizzare le celle di HER2-positivo in > 10% delle cellule del tumore e quindi abbinato le caratteristiche per la valutazione di positività di HER2. Interessante, questo valore è più vicino all'estremità inferiore dei cancri al seno incidenza segnalata gamma di HER2-positivo. D'altra parte, lo stato di HER2 era variabile in aree distinte di cancro al seno HER2-positivo sia HER2-negativo (Figura 3, tabella 4), fornendo ulteriore credito alla nozione che il cancro al seno è una malattia estremamente eterogenea alle livello genomico. Il tasso di fallimento dell'analisi SISH era 0,8%, con un numero totale di 2.629/2.651 punti in cui la sonda dinitrofenolo-tag associato alle sequenze di destinazione.

Figure 1
Figura 1 : Rappresentazione di cornerstone fasi nella realizzazione di una piattaforma ad alta produttività per l'analisi di eterogeneità di HER2 in larghe coorti di cancri al seno. (A) selezione delle zone a campione deve includere l'identificazione e l'evidenziazione di tutte le aree con citologico, architettonico, o eterogeneità IHC. (B), una delle fasi più critiche di questa procedura è la creazione di un blocco di accettore di alta qualità, dato che anche una crepa microscopica potrebbe dedurre la consistenza delle analisi successive in situ di ibridazione. (C) è importante impiegare un arrayer digitalmente guidata con un ago di diametro di mm 1 per costruire TMA ad alto rendimento basato sulla tecnica Kononen. (D) la creazione del progetto TMA dovrebbe iniziare dalla definizione delle dimensioni e delle frontiere della TMA. (E) tutte le IHC e ISH analisi devono essere effettuate utilizzando strumenti digitali patologia, al fine di navigare velocemente attraverso la TMA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Rappresentazione planimetrica della TMA realizzato per questo protocollo. Un numero totale di 180 punti di 1 mm di diametro, 500 µm, consentono un'ottimale in situ di ibridazione. Più densa TMAs fornire improduttivi risultati in termini di qualità complessiva e l'uniformità delle reazioni attraverso tutti i punti, con un più alto tasso di guasto su una base di singolo-punto. Notare i punti di "orientamento" in alto e medio-a sinistra della griglia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Rappresentante micrografie mostrando l'argento in situ analisi di ibridazione di un cancro al seno HER2-eterogenei. In questo esempio paradigmatico, due punti distinti di un cancro al seno invasivo prima scelta di nessun tipo speciale (BR_121) ha mostrato risultati diversi in termini di amplificazione del gene (nero) HER2 rispetto alla sonda centromerica enumerazione 17 (rosso). In particolare, una zona appartenente al nucleo del tumore e mostrando il cytokeratin 7 irregolare modello di macchiatura è stato HER2 amplificato (A), mentre un solo punto dalla parte anteriore invasiva (cioè, tumore edge) visualizzato un selvaggio-tipo HER2 modello (B). Scala bar = 50 µm (20 µm gli inset). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ID caso ID del blocco ID area Tessuto Topografia Morfologia ER PR KI67 HER2 Altre caratteristiche IHC
BR_121 A5 un Normale Margine chirurgico
BR_121 A1 un NST Nucleo del tumore G2 CK7 +
BR_121 A1 b NST Nucleo del tumore G3 CK7 + /-
BR_121 A3 un NST Nucleo del tumore Stroma mucinous 90 100 12 2 +
BR_121 A3 b NST Invasivo anteriore Tubolare 100 100 35 2 +
BR_121 A4 un NST Invasivo anteriore G3
BR_121 A3 c CARCINOMA DUTTALE IN SITU (EIC +) Adiacente alla dilagante anteriore Prima scelta 100 100 45 2 +

Tabella 1: record di rappresentante di un caso incluso nello studio. Questo caso (BR_121) era un carcinoma invasivo prima scelta di nessun tipo speciale con lo stroma myxoid focale, mostrando una componente tubolare secondaria alla periferia della lesione e focale irregolare perdita di CK7 immunoexpression. Le caratteristiche immunohistochemical, compreso biomarcatori reporting, fa riferimento per le analisi eseguite al momento della diagnosi. NST, carcinoma dilagante di nessun tipo speciale; Carcinoma duttale in situ, carcinoma duttale in situ; EIC +, componente intraduttale esteso; CK7, il cytokeratin 7.

Marcatore Clone Azienda Diluizione Deparaffinazione Ricupero dell'antigene Incubazione dell'anticorpo Sistema di Punteggio
ER SP1 Ventana RTU Preparazione EZ a 72 ° C CC1 a 95 ° C per 36 min 16 min ASCO/CAP linee guida23
PR 1E2 Ventana RTU Preparazione EZ a 72 ° C CC1 a 95 ° C per 36 min 17 min ASCO/CAP linee guida23
HER2 4B5 Ventana RTU Preparazione EZ a 72 ° C CC1 a 95 ° C per 36 min 18 min ASCO/CAP linee guida3
KI67 30-9 Ventana RTU Preparazione EZ a 72 ° C CC1 a 95 ° C per 36 min 12 min Internazionale Ki67 nel cancro al seno lavoro gruppo consigli25

Tabella 2: elenco degli anticorpi, cloni, diluizioni, metodi di ricupero dell'antigene e sistemi di valutazione adottati per le analisi di immunohistochemical. ER, ricevitore dell'estrogeno; PR, ricevitore del progesterone; RTU, ready-to-use.

Istotipo n (%) ER + (%) PR + (%) KI67-basso (%) Ki-67-alta (%) HER2 + (%)
Carcinoma invasivo di nessun tipo speciale 344 (77,5) 301 (87,5) 257 (74,7) 85 (24,7) 259 (75,3) 71 (20,6)
Carcinoma lobulare invasivo 53 (11,9) 53 (100.0) 44 (83.0) 36 (67,9) 17 (32,0) 4 (7,5)
Carcinoma invasivo, tipo misto 9 (2.0) 8 (88,9) 6 (66,7) 0 (0,0) 9 (100.0) 1 (11.1)
Carcinoma tubulare 8 (1,8) 8 (100.0) 8 (100.0) 8 (100.0) 0 (0,0) 0 (0,0)
Carcinoma mucinous 11 (2,4) 11 (100.0) 9 (81,8) 7 (63,6) 4 (36,4) 0 (0,0)
Carcinoma Micropapullary 7 (1.6) 7 (100.0) 7 (100.0) 5 (71,4) 2 (28,6) 2 (28,6)
Carcinoma invasivo con featueres apocrine 5 (1.1) 3 (60,0) 1 (20.0) 1 (20.0) 4 (80,0) 3 (60,0)
Carcinoma papillare 1 (0,2) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (100.0) 0 (0,0)
Carcinoma midollare 4 (0,9) 0 (0,0) 1 (25,0) 0 (0,0) 4 (100.0) 0 (0,0)
Carcinoma metaplastico 2 (0,5) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (100.0) 0 (0,0)
Totale 444 391 (88,0) 333 (75.0) 142 (32,0) 302 (68.0) 81 (18,2)

Tabella 3: al seno cancro istotipi, lo stato del ricevitore e stato HER2 eterogeneità. ER, ricevitore dell'estrogeno; PR, ricevitore del progesterone; KI67-basso, Ki67 Indice < 18%; KI67-alto, Ki67 > 18%.

Interpretabile macchie neoplastici Macchie di HER2-positive (%) Stato di recettori dell'ormone Casi HER2-eterogenei
6 5 (83) positivo 10
6 5 (83) negativo 1
6 4 (67) positivo 7
6 4 (67) negativo 1
6 2 (33) negativo 1
6 1 (17) positivo 1
5 3 (60) positivo 10
5 1 (20) positivo 2
4 3 (75) positivo 9
4 2 (50) positivo 8
4 1 (25) negativo 1
3 2 (67) positivo 5
3 1 (33) positivo 2
46 25 (54) 53 (93) 57

Tabella 4: HER2 espressione, stato del recettore ormonale e HER2-eterogenei casi. Tra 57 casi HER2-eterogeneo, 4 casi (7%) erano ER-negativo e PR-negativo, confermando l'importanza clinica di valutazione HER2 eterogeneità.

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Discussion

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Qui, noi abbiamo dettagliato le strategie di laboratorio per eseguire analisi di SISH del gene HER2 e suo centromero corrispondente in TMAs ad alto rendimento dei cancri al seno eterogeneo trasformati. Questo metodo è conveniente e può essere effettuato nella maggior parte dei laboratori per lo studio dell'eterogeneità di amplificazione genica di HER2 in larghe coorti di seno tumori Estratto forma patologia archivi.

Data l'importanza clinica di HER2 test nel cancro al seno e le sfide generate dalla relativa espressione eterogenei, abbiamo sviluppato un protocollo di prova ad alta velocità per valutare intra - e inter - tumore HER2 eterogeneità genetica. Le aree analizzate includono componenti pre-invasive e invasive, sulla base di specifiche citologico, architettura e funzionalità di IHC.

Ci sono varie fasi critiche che devono essere gestiti con attenzione in questo protocollo. Un passo essenziale è la selezione delle regioni di interesse. Abbiamo determinato che l'annotazione delle diverse aree topografiche attraverso un approccio multidisciplinare è fondamentale per garantire la qualità dell'analisi molecolare finale. In particolare, la revisione congiunta delle diapositive diagnostiche effettuata da un patologo e un tecnico aumentare enormemente il numero di punti adeguati (cioè, macchie che riflette l'area identificata sulla diapositiva) e successivamente ridurre il tasso di fallimento del l'analisi single-macchie. Tuttavia, diversi punti di tumore possono essere persi dopo le sezioni di serie per analisi multiple di IHC e ISH. Per ovviare a questo inconveniente, si consiglia di costruire TMAs in doppio o triplice copia, se affatto fattibile in base alla disponibilità del tessuto. Inoltre, evidenziamo l'importanza di definire procedure di laboratorio rigorosa per la creazione di blocchi FFPE acceptor per il TMAs. Infatti, abbiamo osservato che una minima crepa nel blocco TMA potrebbe dedurre l'intera analisi ISH in termini di qualità, riproducibilità e la chiarezza della reazione. In caso di crepe, il blocco del donatore deve essere ignorato per la costruzione di TMA. Va riconosciuto, tuttavia, che IHC potrebbe essere eseguita anche in TMAs non ottimali, e nessuna evidenza di problemi tecnici durante tale analisi sono stati osservati nella nostra esperienza.

Nonostante che questo protocollo è specificamente ottimizzato per analisi SISH HER2 del seno ad alto rendimento TMAs, è da notare che altre analisi, come il pesce e IHC, possono essere eseguite in modo affidabile in diversi tipi di tessuto, come descritto in precedenza14, 19,26. Tuttavia, abbiamo definito nel presente documento il numero ideale di spot e la caratteristica topografica della TMA per garantire alta qualità e riproducibili analisi SISH del gene HER2 in esemplari del cancro al seno. Un altro punto significativo è rappresentato dal rimodellamento di protocolli standard di SISH automatizzati per abbinare la peculiarità di più campioni da analizzare. Infatti, le linee guida dei costruttori sono generalmente realizzate per le analisi molecolari delle sezioni integrale convenzionale e pertanto non sono in grado di raggiungere alti standard su campioni di tessuti eterogeneo trasformati, come in TMAs da blocchi di FFPE archival. A tal fine, abbiamo fornito una descrizione dettagliata di un protocollo affidabile e su misura per le analisi SISH in questi campioni problematici.

Sarebbe estremamente utile esplorare l'eterogeneità dell'espressione di HER2 e amplificazione genica rispetto alla distribuzione eterogenea di altri biomarcatori molecolari clinicamente utili nel cancro al seno. A tal fine, occorrono ulteriori studi di ricerca traslazionale per esplorare la validità del nostro metodo per altre analisi molecolare clinicamente rilevanti, come ad esempio matrix-assisted laser desorption/ionization spettrometria totale imaging (MALDI-MSI)27. Recentemente, la gestione dei tessuti FFPE per analisi MALDI-MSI è diventato fattibile, anche se impegnativo. Questa tecnica di proteomica in situ permette di visualizzare la distribuzione spaziale delle proteine e dei peptidi in sezioni di tessuto patologico, compreso cancro al seno.

Questo protocollo ha diversi passaggi critici che possono potenzialmente interferire con l'analisi finale. In primo luogo, particolare attenzione verso i diversi meccanismi di amplificazione di HER2 . Ad esempio, il cromosoma 17 polysomy è un'aberrazione genetica che può verificarsi in seno cancro11, che rappresenta un ben noto meccanismo alternativo per il maggiore numero di copia di HER2 . Questa condizione, anche se non frequenti, può interessare non solo le caratteristiche biologiche del cancro e gestione del paziente, ma anche le analisi ISH. In secondo luogo, è stato descritto che eterogeneità genetica intra-tumorale si verificano anche a livello di singola cellula e non solo in diverse aree neoplastiche. Questo protocollo non è in grado di aumentare la potenza di rilevazione di questa particolare condizione rispetto alle sezioni integrale. Inoltre, è importante sottolineare che lo studio basato su TMA di eterogeneità spaziale ha alcune limitazioni intrinseche, tra cui la mancanza di un'analisi completa di tutta la sezione. Questo studio, tuttavia, dovrebbe essere considerato un prova-de-principio che l'eterogeneità dell'amplificazione del gene HER2 può essere valutata per mezzo di una piattaforma di alto-rendimento e costi contenuta, utilizzando la normale attrezzatura da laboratorio. Ulteriori studi analizzando sezioni seriali integrale dei casi HER2-eterogeneo, accoppiati con gli studi molecolari all'avanguardia ed i dati clinici dei pazienti saranno necessario convalidare questo protocollo.

In conclusione, la mappatura completa di stato HER2 negli esemplari di cancro al seno HER2 eterogenei e le indagini di potenziali mutazioni genetiche driver nei componenti di HER2-negativo deve basarsi sull'analisi di più aree neoplastiche. Questa analisi richiederebbe costi insostenibili e sforzi utilizzando servizi diagnostici standard. Questo metodo rappresenta uno strumento affidabile per la caratterizzazione simultanea di HER2 eterogeneità genetica in grandi insiemi di multiplo e cancri al seno eterogeneo trasformati.

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Disclosures

Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Nessuno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

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References

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Costruire una piattaforma di High-throughput Screening per valutare l'eterogeneità dell'amplificazione del Gene HER2 nei cancri al seno
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Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

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