Summary
يمكن أن تكون الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية كعلاج استبدال خلية لشكل متقدمة من الجفاف المرتبطة بالسن البقعي. ويصف هذا البروتوكول توليد نموذج كبير العينين من ضمور الجغرافية وزرع الخلايا الظهارية الإنسان صبغة الشبكية المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية سوبريتينال إلى هذا النموذج من المرض.
Abstract
ضمور الجغرافية (GA)، مرحلة متأخرة من الجافة المرتبطة بالسن البقعي تتسم بفقدان طبقة (RPE) الظهارية الصبغية الشبكية، الأمر الذي يؤدي إلى انحطاط اللاحقة للهياكل الشبكية الحيوية (مثلاً، فوتوريسيبتورس) مما تسبب في ضعف الرؤية حادة. وبالمثل، RPE-الخسارة وانخفاض في حدة البصر هو ينظر في المتابعة طويلة الأجل عن مرضى المتقدمة الرطب المرتبطة بالسن البقعي (AMD) يتلقون العلاج حقن الأوعية الدموية المضادة عامل نمو غشائي (VEGF). ولذلك، من ناحية، أنه أمر أساسي لكفاءة استخلاص الخلايا RPE من مصدر غير محدود يمكن أن تستخدم كعلاج بديل. من ناحية أخرى، من المهم تقييم السلوك ودمج الخلايا المشتقة في نموذج تستتبع الأمراض الجراحية وأساليب التصوير كقريبة قدر الإمكان من تلك المطبقة في البشر. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل استناداً إلى المنشورات السابقة التي تصف توليد نموذج الإكلينيكية للجمعية العامة استخدام العين أرنب ألبينو، لتقييم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المستمدة من الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية (هيس-RPE) في الإعداد ذات الصلة سريرياً. RPE هيس متباينة يتم زرعها في عيون ساذجة أو العيون مع نيو3-الناجم عن تنكس الشبكية GA-مثل استخدام تقنية بلانا بارس ترانسفيتريل ز 25. تقييم للمناطق المزروعة وتحولت يؤديها المتعدد الوسائط عالي الدقة من التصوير في الوقت الحقيقي غير الغازية.
Introduction
ويصف هذا البروتوكول توليد نموذج السريرية كبيرة العينين من ضمور الجغرافية (GA) التي تتيح تقييم إدماج RPE هيس المزروعة في الفضاء سوبريتينال. وقد استخدمت الأساليب الموصوفة هنا بالتفصيل 3 المنشورات الأخيرة التي تثبت إنتاج السكان المخصب ونقية والوظيفية للخلايا RPE من هيس1، فضلا عن خلق تلف الشبكية الخارجي والنمط الظاهري مثل GA الناجم عن حقن سوبريتينال لحلول الملح الفسيولوجي (أي، BSS وبرنامج تلفزيوني) أو نيو3 في أرنب العين2،3. كذلك أثبتنا أن تشكل عمليات زرع الشبكية دون تعليق من RPE هيس مونولاييرس وظيفية واسعة النطاق مع مستقبله الإنقاذ قدرة2.
مرافقة عدة مزايا استخدام العين أرنب لتوليد نموذج ألجأ للمرض. أولاً، الحجم العين الأرانب، والذي هو 70% حجم العين البشرية الكبار، يسمح زرع سريرياً ذات مغزى استخدام كثافة خلية التي أقل بكثير مما يستخدم عادة في عيون القوارض الصغيرة (1,000 الخلايا/ميليلتر مقابل 50,000 الخلايا/ميليلتر)4 , 5-وثانيا، عملية جراحية في القوارض هو عادة ترانسكليرال عبر المشيمية، مما يهدد الجدار الشبكية، ويحتمل أن يؤدي استجابة تحريضية و رفض ممكن6. هذان العاملان معا قد يؤدي إلى مولتيلاييرينج والتثاقل زرع الخلايا، ودمج الخلايا المزروعة في نسيج شبكية أصلية تعطل فقراء عموما. ومع ذلك، يسمح نموذج أرنب كبير العينين أداء تقنية جراحية مع الأجهزة مطابقة لإعداد سريرية. وثالثاً، نموذج كبير العينين أيضا تصاريح ذات الدقة العالية في فيفو التصوير ورصد الخلايا المزروعة والشبكية السطحية من خلال الساعة1،،من23. وهكذا يصف لنا نموذج السريرية ذات الصلة سريرياً وفعالة من حيث التكلفة التي ينبغي أن تكون بديلاً جذاباً للقوارض لأي شخص لديه مصلحة في البحوث الشبكية المريضة وطبيعية والمساحة الشبكية الفرعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
البروتوكول التالي المبادئ التوجيهية الرعاية الحيوانية من إينستيتويت كارولينسكا. جميع التجارب على الحيوانات باستخدام نيوزيلندا ألبينو الأرانب (جدول المواد) أقرتها لجنة الأخلاقيات الحيوانية الإقليمية (Stockholms التاريخي Djurförsöksetiska Nämnd) (تصريح: dnr 56/15). استخدام هيس (dnr 2011/745-31/3)، ونقل والتلاعب في هيس-RPE (dnr 2013/813-31/2) هو أيضا وفقا للتشريع السويدي ومعهد كارولينسكا الأنظمة، وقد أقرها (لجنة الأخلاقيات البشرية الإقليمية Etikprövningsnämnden ريجيونالا أنا ستوكهولم).
1-سوبريتينال حقن يودات الصوديوم (نيو3) إلى نموذج حيوان كبير العينين
- تخدير الحيوانات قبل الاعطاء العضلي في الفخذ مع خليط الكيتامين 35 مغ/كغ وإكسيلازيني 5 مغ/كغ في المالحة باستخدام المحاقن 30 غرام، وتمدد التلاميذ مع قطره الموضعية باستخدام مزيج فينيليفريني سيكلوبينتولاتي و 2.5% 0.75 في المائة. تأكد أنيسثيتيزيشن المناسبة إذا كان الحيوان لا تستجيب لقرصة الثابت في الساق مرة أخرى.
- ضع الأرنب تحت المجهر الجراحي مع الرأس التي تواجه الجراح (الشكل 1A). استخدام ضام غطاء لإزالة الغشاء الجفون ونيكتيتانس بقطعة قماش معقمة التقليل من مخاطر التلوث. استخدام موازنة الحل الملح (BSS) لمنع جفاف بينما تحت التخدير في كلتا العينين.
-
للجراحة أو استخدام منفذ 2 (أو 3-منفذ اختياري) ترانسفيتريل ز 25 فارس بلانا تقنية مع تروكارس غير-المزودة بصمامات لإدراج الصكوك microsurgical (الشكل 1B). آلة متعددة الوظائف الاستئصال الكلي الزجاجية قد منافذ الاتصال قنية التسريب، اندويلومينيشن، فيتريكتور، واندولاسير. لحقن سوبريتينال، إلا اندويلومينيشن إلزامي، مما يجعل هيكل 2-الميناء كافية. إدراج في اندويلوميشن عن طريق تروكار الأيسر العلوي واستخدام تروكار الأيمن العلوي قنية الحقن سوبريتينال.
- لمجموعة 3-الميناء، استخدم تروكار الزمنية الدنيا قنية ضخ BSS. إذا كانت الصكوك الاختيارية (مثل فيتريكتور) المستخدمة، بإدراجها عن طريق تروكار الأيمن العلوي.
- إدراج تروكارس 2 العلوي 1-2 مم من ليمبوس استخدام الملقط المخالب لانتزاع وتشريد الملتحمة تغمر الموقع الإدراج.
- تأكد من تروكارس هي ترانسكليرالي المدرجة في زاوية موازية ليمبوس 30-45 درجة مئوية، والشروع في منتصف غيض من تروكار. ثم تتحول تروكار 90°، والمضي قدما في العين، ويهدف القطب الخلفي للعين. هذا الإجراء سوف تجنب تسرب بعد الجراحة من سكليروتوميس، وأيضا تقليل خطر اندوفثالميتيس (أي، العدوى البكتيرية في العين). راجع أيضا الشكل 2B لمواقف تروكار.
- وضع عدسات اللاصقة شقة استخدام واحد على القرنية لتصور الشبكية، بالدموع الاصطناعية كجل الاتصال بين العين والعدسات اللاصقة (الشكل 1A).
- رسم 500 ميليلتر من نيو3 إلى 1 مل حقنه متصلة بأنبوب تمديد (يشغلها المساعد) وقنية بوليتيب ز 38 (يشغلها الجراح).
- إدراج التحقيق اندويلومينيشن عن طريق تروكار الأيسر العلوي وقنية الحقن عن طريق تروكار الأيمن العلوي، ودفع قنية عبر الفضاء الزجاجي نحو الشبكية، تهدف إلى تحقيق منطقة أسفل رأس العصب البصري.
- تسمح غيض قنية للمس الشبكية ببطء حتى تبييض تنسيق مرئياً. حقن نفسه سوف تخترق الشبكية، السماح بتسليم سوبريتينال. لا تدع قنية اختراق الشبكية، حيث قد يؤدي ذلك إلى نزيف.
- حقن 50 ميليلتر من نيو3 سوبريتينالي على مدى فترة s 5. تدريجيا نظراً لوجود طائرة انقسام طبيعي بين الشبكية والمشيميه الكامنة، ينبغي أن تشكل بليب شبه شفاف مرئية بوضوح خلال الحقن.
- أثناء الحقن، ببطء سحب الإبرة، ولكن تأكد من التلميح يتم الاحتفاظ داخل بليب للتقليل من الجزر.
- بعد إزالة قنية اندويلوميشن وحقن، إزالة تروكارس استخدام الملقط المخالب، وتطبيق الضغط الخفيف لمدة 30 ثانية إلى سكليروتوميس أقل خياطة الختم الذاتي باستخدام التلميح أو النهاية غير حادة الملقط.
- بوستسورجيكالي إعطاء 10 مل من المحلول الملحي تحت الجلد منع الجفاف. لا تعطي المنشطات بعد الجراحة الموضعية أو المضادات الحيوية. لإعطاء المسكنات 0.5 مل من البوبرينورفين 0.3 ملغ/مل تحت الجلد بعد الجراحة، فضلا عن اليوم بعد عملية جراحية.
- بعد الاستخدام، غسل جميع الصكوك التي غمر بها لبضع ثوان أولاً في الإيثانول 70%، ثانيا في الإيثانول بنسبة 45%، وأخيراً في ماء مقطر. تجفيفها بشكل صحيح مع منشفة ورقية.
- حضور الحيوانات حتى يستعيد وعيه كافية ووضع كل واحد منهم انكاجيد. إذا لزم الأمر (مثلاً، لأغراض إيمونوهيستوتشيميستري)، euthanize الحيوانات عن طريق الحقن الوريدي من بينتوباربيتال 100 مغ/كغ (انظر الجدول للمواد).
- الانتظار 7 أيام للمضي قدما في زرع خلايا RPE هيس.
2-سوبريتينال زرع الخلايا RPE هيس في "معاملة الحيوانات"
- إدارة 2 مغ (100 ميليلتر) لحقن سينولون في الحيوانات تخديره باستخدام إبرة حقن ز 30 تدخل 1-2 مم من ليمبوس في الربع الزمني السفلي 1 أسبوع قبل زرع RPE هيس، وإعادة إدارته كل 3 أشهر. تأكد من نقطة التلميح نحو القطب الخلفي للعين لتجنب لمس عدسة.
- الثقافة من أحادي الطبقة هيس-RPE كما هو موضح سابقا1.
- قم بإزالة الوسائط تمايز الخلية (انظر الجدول للمواد) من أحادي الطبقة RPE هيس المتلاقية 24-البئر ويغسل كل جيدا مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني دون Ca2 + و Mg2 +. كرر هذا الإجراء مرة أخرى، ليصبح مجموع يغسل 2.
- تجاهل المادة طافية، وإضافة 500 ميليلتر من التربسين كل بئر، واحتضان لمدة 12 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- إمالة اللوحة وإزالة بعناية التربسين (الخلايا ينبغي أن تظل متمسكة باللوحة). جمع الخلايا في 800 ميليلتر الطازج 37 درجة مئوية التمايز بريوارميد وسائل الإعلام بيبيتينج لطيف، أو حتى إلغاء إذا لزم الأمر، للحصول على تعليق خلية مفردة.
ملاحظة: استخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر إذا لوحظت كتل الخلية. - حساب عدد الخلايا في دائرة هيموسيتوميتير باستخدام 0.2% تريبان الأزرق، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- إضافة 5 مل من تمايز الخلايا وسائل الإعلام وأجهزة الطرد المركزي عند درجة حرارة الغرفة، 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في طازجة تصفية تعقيم PBS (تم تمريرها من خلال مرشح حقنه 25 مم) إلى تركيز نهائي من الخلايا 1,000/ميليلتر.
- قاسمة تعليق الخلية السابقة إلى 600 ميليلتر مختبرين والحفاظ على الجليد حتى وأثناء الجراحة.
- تخدير الحيوانات قبل الاعطاء العضلي في الفخذ مع خليط من 35 ملغ/كغ xylazine الكيتامين و 5 ملغ/كغ في المالحة باستخدام المحاقن 30 جرام. تمدد التلاميذ مع قطره الموضعية باستخدام أم فينيليفريني سيكلوبينتولاتي و 2.5% 0.75 في المائة. تأكد أنيسثيتيزيشن المناسبة إذا كان الحيوان لا تستجيب لقرصة الثابت في الساق الخلفية لها.
- مكان الأرنب مع الرأس التي تواجه الجراح. استخدام ضام غطاء لإزالة الغشاء الجفون ونيكتيتانس بقطعة قماش معقمة التقليل من مخاطر التلوث. استخدام BSS لمنع جفاف بينما تحت التخدير في كلتا العينين.
-
للجراحة أو استخدام منفذ 2 (أو 3-منفذ اختياري) ترانسفيتريل ز 25 فارس بلانا تقنية مع تروكارس التي توضع في نفس المواضع كما هو موضح في الخطوة 1، 3 و الشكل 2. إذا كانت سكليروتوميس السابقة مرئية، أداء تروكار الإدراج المجاورة فقط، ولكن ليس عن طريق هذه، التقليل من مخاطر تسرب بعد العملية الجراحية.
- وضع عدسات اللاصقة شقة استخدام واحد على القرنية لتصور الشبكية، بالدموع الاصطناعية كهلام الاتصال بين العين والعدسات اللاصقة (الشكل 1A).
- بعد تلميح الصحيح (انظر الخطوات 1.3.5 و 1.3.6) لتحديد المواقع، حقن 50 ميليلتر من تعليق مختلطة بلطف هيسك-RPE (50,000 الخلايا) سوبريتينالي. وتهدف لمركز منطقة3 pretreated نايو تتميز منعكس مميزة "معدني" إندو-إضاءة. يجب فصل الشبكية الحسية بسهولة إنشاء بليب مرئية بوضوح. كتل دافق الإبرة مع العقيم ح2س في بين الأرانب بعد استخدامها لتجنب إبرة انسداد نتيجة للخلية. ولوحظ تغير الإبرة عند انسداد.
- أثناء الحقن، ببطء سحب الإبرة ولكن تأكد من التلميح يتم الاحتفاظ داخل بليب لتقليل ارتداد.
- بعد إزالة قنية اندويلوميشن وحقن، إزالة تروكارس استخدام الملقط المخالب، وتطبيق الضغط الخفيف لمدة 30 ثانية إلى سكليروتوميس أقل خياطة الختم الذاتي باستخدام التلميح أو النهاية غير حادة الملقط.
- بوستسورجيكالي إعطاء 10 مل من المحلول الملحي تحت الجلد منع الجفاف. لا تعطي المنشطات بعد الجراحة الموضعية أو المضادات الحيوية. لإعطاء المسكنات 0.5 مل من البوبرينورفين 0.3 ملغ/مل تحت الجلد بعد الجراحة، فضلا عن اليوم بعد عملية جراحية.
- بعد الاستخدام، غسل جميع الصكوك التي غمر بها لبضع ثوان، أولاً في الإيثانول 70%، ثانيا في الإيثانول بنسبة 45%، وأخيراً في ماء مقطر. تجفيفها بشكل صحيح مع منشفة ورقية.
- حضور الحيوانات حتى يستعيد وعيه كافية ووضع كل واحد منهم انكاجيد. إذا لزم الأمر (مثلاً لأغراض إيمونوهيستوتشيميستري)، euthanize الحيوانات عن طريق الحقن الوريدي من بينتوباربيتال 100 مغ/كغ.
3. في فيفو الشبكية وتصوير سوبريتينال
-
استخدام جهاز التصوير المقطعي (SD--أكتوبر) تماسك ضوئية مجال طيفي مع البرامج المرفقة (انظر الجدول للمواد) للحصول على فحص ب مستعرضة من الحيوانات المعالجة، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. لتجنب عدم وضوح الصورة، تأكد من إبقاء القرنية رطبة بالتنظيف مع المالحة الموضعية كل 30-60 ثانية.
- ضع الحيوانات تخديره والمتوسعة تلميذ (انظر الخطوات 1-1 و 2، 10) في جبل قابل لتعديل للحصول على مسار دون عائق من صك مصدر الضوء إلى الشبكية أرنب.
- الحصول على مالا يقل عن 3 أكتوبر الأشعة مع تزامن المسح الضوئي الأشعة تحت الحمراء [كنفوكل] تنظير العين الليزر الصور مرجع الانعكاس (الأشعة تحت الحمراء-كسلو) تمثل الجزء العلوي والوسطى والسفلي من منطقة الحقن.
- الحصول على صور النظارة أون-الوجه مع كسلو الأزرق، والأشعة تحت الحمراء والخضراء ومتعدد الألوان بالليزر الانعكاس (أي، ألوان الليزر متزامنة متعددة)، على التوالي.
- التقاط الصور أوتوفلوريسسينسي الضوء الأزرق (BAF) باستخدام الليزر الضوء الأزرق قدرة الجهاز SD، تشرين الأول/أكتوبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الممثل في فيفو الصور BAF، والأشعة تحت الحمراء-كسلو، و SD--أكتوبر من الشبكية أرنب ألبينو عادي مبينة في الشكل 2. ملاحظة مختلف طبقات الشبكية مع مستويات مميزة من انعكاس الضوء التي استولت عليها الصك SD، تشرين الأول/أكتوبر.
ويتضح في الأرقام 1A و 1B الشكل، الإعداد لإنشاء بليبس الشبكية دون: يتم وضع ضام غطاء، إخضاع الجفون للسماح بإدراج تروكارس 3 (الشكل 1B) 1-2 مم بعيدة عن ليمبوس، تفاديا لعدسة تعمل باللمس، وزاوية 30-45 ˚ ليمبوس موازية. وسيمكن تروكارس الأخذ قنية ضخ اختيارية، بالإضافة إلى ضوء، وابرة حقن من خلال الصلبة العينية. تلميذ متوسعة جنبا إلى جنب مع عدسة الاتصال شقة ستسهل طريقة عرض لقاع العين والشبكية دون الفضاء بينما يتم إجراء العملية الجراحية.
بعد حقن 50 ميليلتر من 1 مم نيو3 الحل، يتم إنشاء بليب في الفضاء سوبريتينال أنه سيتم حل وتتدهور تدريجيا شبكية العين الخارجي، كما هو موضح في الصورة SD، تشرين الأول/أكتوبر في الشكل 3 ألف ثلاثة أشهر بعد الحقن. نقدر رقيق الطبقات نيوروريتينال الأبعد في التنمية المستدامة-OCT والمناطق هيبو BAF، المقابلة لفقدان RPE ومن ثم إعادة إنشاء النمط الظاهري مثل ألجأ. عند تحديد المنطقة للضرر، RPE هيس 50,000 في وحدة تخزين 50 ميليلتر من إعادة حقن للزرع، خلق بليب ثاني الذي يحل كما هو موضح في معامل التراكم الأحيائي والصور (MC) متعدد الألوان في الشكل 3B. تعترف خفيفة إلى معتدلة من فرط BAF المناطق تنسيق زيادة فرط-معامل التراكم الأحيائي إينفيريورلي على الشريط الحدودي منطقة الضرر، ويدل على الإجهاد المزمن من RPE الأصلي سيظهر في فحص SD، تشرين الأول/أكتوبر إلى جانب غياب المناطق المصطبغة بالصورة MC. ويرد بليب المقابلة لحقن 50 ميليلتر من هيس-RPE (50,000 الخلايا) في عيون غير pretreated تظهر بقع مصطبغة الخلايا في صورة (MC) والهياكل الشبكية يتم الحفاظ عليها جيدا في مسح SD، تشرين الأول/أكتوبر للمقارنة (الشكل 3).
جماعياً، هذا الإجراء ومنهجية تسمح دراسة تكامل عمليات زرع الأعضاء تعليق سوبريتينال هيس-RPE في نموذج ذات صلة للجمعية العامة.
رقم 1: حقن مجموعة المكياج. (أ) الصور التي تصور إقامة العمليات الجراحية لحقن الشبكية دون. يتم وضع الحيوان تحت المجهر الجراحي (يسار) والجراح يحمل المسبار اندويلومينيشن إدراجها عن طريق تروكار اليسرى في اليد اليسرى، وإدراج الأدوات الجراحية حقن (مثل حقن سوبريتينال قنية) من خلال تروكار الأيسر باليد اليمنى (وسط). عدسات اللاصقة مسطح على القرنية تسمح طريقة عرض مكبرة للنظارة أثناء العملية الجراحية (يمين). (ب) إغلاق العرض التخطيطي العين أرنب ألبينو مع ضام الغطاء في المكان والحلمة من تروكارس 1-2 مم العميق من ليمبوس وإدراجها بزاوية 30-45 ° موازية، جنبا إلى جنب مع تروكارس التي تسهل إدخال اختياري القنية التسريب، وضوء، والإبرة لحقن. وسيساعد عدسات اللاصقة شقة تقع على رأس التلميذ للحصول على عرض أفضل لقاع العين خلال العملية الجراحية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: ألبينو عادي الأرنب الشبكية في فيفو التصوير- في فيفو صور BAF، والأشعة تحت الحمراء-كسلو، والتنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر تمثل شبكية أرنب ألبينو عادي. ويعتبر ضربة حتى للتنمية المستدامة-OCT مع العلامات المطابقة لمختلف طبقات الشبكية في صورة SD، تشرين الأول/أكتوبر: جكل (العقدة خلية طبقة)، الشعيرات (الطبقة الداخلية بليكسيفورم)، المكتب (الطبقة الداخلية النووية)، ومنظمة الشعب المناضل (الطبقة الخارجية بليكسيفورم)، ONL (الطبقة الخارجية النووية)، OLM (الخارجي الحد من غشاء)، لوبيز (منطقة الاهليلجي) ونظام التشغيل (الأجزاء الخارجية)، RPE (ظهارة صباغ الشبكية) وبي أم (غشاء بروخ 's). تغيير حجم أشرطة = 1 مم (معامل التراكم الأحيائي والأشعة تحت الحمراء-كسلو الصور)، 200 ميكرومتر (صور SD، تشرين الأول/أكتوبر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: حقن تعليق سوبريتينال في نموذج أرنب كبير العينين. صور BAF (A)، مولودية، والتنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر لحقن سوبريتينال 1 مم نيو3 3 أشهر بعد التعريفي الضرر. ملاحظة هيبو-معامل التراكم الأحيائي محاطة بمناطق فرط BAF تناظر بليب ونيوروريتينا تدهورت في التنمية المستدامة-أكتوبر (ب) BAF، مولودية، وصور التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر لعيون pretreated مع 1 مم نايو3 لمدة أسبوع واحد متبوعاً بزرع سوبريتينال 50000 RPE هيس في تعليق وتحليل 3 أشهر بعد الزرع. ملاحظة مجالات فرط BAF في الصورة BAF، نظراً لغياب الخلايا المصطبغة متكاملة في المنهج النموذجي ونيوروريتينا ضامر في صور MC SD--أكتوبر (ج)، والتنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر تناظر عيون ساذجة غير pretreated 3 أشهر بعد زرع سوبريتينال RPE هيس في التعليق. يتم وضع علامة ملاحظة المناطق المصطبغة على الصورة MC وهيكل نيوروريتينال المحافظة على التنمية المستدامة-أكتوبر SD-OCT طائرات المسح الضوئي (السهم الأخضر). رؤوس بيضاء علامة الحدود بليبس en-الوجه والصور SD، تشرين الأول/أكتوبر. تغيير حجم أشرطة = 1 مم (معامل التراكم الأحيائي ومولودية الصور)، 200 ميكرومتر (صور SD، تشرين الأول/أكتوبر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويرد في هذا البروتوكول، وتوليد نموذج كبير العينين GA واستخدامها الإكلينيكية لتقييم RPE هيس التكامل في فيفو .
لترجمة العلاجات التجديدي للجمعية العامة والأمراض ذات الصلة إلى عيادة7، من المهم تطوير وتحسين الأساليب التي صدق التقاط الطرق السريرية لزرع الأعضاء والتصوير. الأرنب في هذا الجانب من جوانب جذابة: فقد عين كبيرة نسبيا تسمح بجراحه العين واستخدام التصوير القياسية، ورخيصة ومساكن بسهولة مقارنة بغيرها من الحيوانات الكبيرة العينين.
يصف لنا استخدام تقنية الاستئصال الكلي الزجاجية بلانا بارس 25-قياس ترانسفيتريل القياسية لإنشاء بليبس الشبكية الفرعية للحث على الشبكية دون الأضرار أو لزرع RPE هيس. في البداية، كنا مجموعة 3-الميناء، كما هو مبين في الشكل 1 باء، قصد استخدام المنفذ التسريب (تروكار)، في حال كان يؤديها الاستئصال الكلي الزجاجية أثناء الإجراء. ومع ذلك، نظراً لأننا لم نجد من الاستئصال الكلي الزجاجية ضرورية لتطبيق حقن الشبكية الفرعية، تم حذف المنفذ التسريب. ومع ذلك، ينبغي أن يظل الخيار المنفذ الثالث إذا هو مواصلة تكييف الإجراء وتتم الاستئصال الكلي الزجاجية.
أرنب كبير العينين نموذج العين راسخة مع البيانات المتراكمة على علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء على مدى قرون8. وعلاوة على ذلك، الأرانب سهلة التعامل وتولد جاذبية من الناحية الاقتصادية (مثلاً، الشراء، والإسكان، وحفظ)، ومتاحة بسهولة بالمقارنة مع نماذج أخرى من الثدييات الكبيرة العينين. وميزة رئيسية لنموذج العينين كبير هو أنه يمكن استخدام تقنيات التصوير السريرية ذات الدقة العالية، التي تتيح بدورها لتعقب RPE هيس زرع الخلايا في الفضاء سوبريتينال مع مرور الوقت. ومع ذلك، على الرغم من لاجومورفس يجري فيلوجينيتيكالي أقرب إلى البشر من القوارض، يجب القول أن لديهم شبكية ميرانجيوتيك ومسحه بصرية، بالمقارنة مع شبكية هولانجيوتيك ومنتظمة في الرئيسات9. ميرانجيوتيك الشبكية يعني أن معظم الدم إمداد الشبكية الداخلية مشتق من تشوريوكابيلاريس، فرق التي يحتاج المرء النظر في ما يمكن أن تزيد من خطر الإصابة بالآفة ونزيف. ميزة تجريبية واحدة أنه يسمح للنمذجة المراحل السابقة للجمعية العامة عقب بليبس سوبريتينال الفسيولوجية الحلول وحدها، كما كان سابقا أظهرت1،3. واقترحت هذه الدراسات أن بليب سوبريتينال مما تسبب في نقص الشبكية الزمانية في الوسط ميرانجيوتيك قد تكون كافية للتسبب في الموت مستقبله؛ ومع ذلك، وفي هذا السياق، قد تبين فقدان RPE الأرجح يمكن إنشاؤها بواسطة تدفق الشبكية الفرعية الناجمة عن استخدام المحاقن 1 مل وكمية بليب 50 ميليلتر، ظاهرة عشوائية بدوره يقوي التي تعالج ضمور الشبكية العصبية. ولذلك يمكن أن يكون حجم بليب لها تأثير مباشر على شبكية العين تمتد الأضرار، مما يعني أنه كلما زاد حجم المستخدمة (مثلاً، 100 ميليلتر، كما استخدمت في دراسات أخرى10)، أنها يمكن أن تصبح أكثر ضارة.
خطوة حاسمة لضمان دمج حقن الخلايا تجنب ارتداد للخلايا في الجسم الزجاجي بينما الحقن، وتحديد المواقع من الإبرة في الفضاء سوبريتينال. إذا وضع عميق جداً، سوف تكون اخترقت الحاجز الخارجي الشبكية/المشيمية والخلايا المناعية قد تغزو الفضاء دون الشبكية، تسبب الرفض المناعي وعلى الرغم من الاستخدام للكبت المناعي. جانب آخر مهم لنجاح زرع هو حالة الجسم الزجاجي. في هذا النموذج، لا يتم الاستئصال الكلي الزجاجية بغية التقليل من الجزر والصدمة الجراحية. ومع ذلك، قد لاحظت أن من الصعب الحصول على موقف نصيحة سليم على الشبكية كما يحصل عالقاً نصيحة في الطور البيني الزجاجي قبل الشبكية التي تفضي إلى تشكيل الصغيرة أو حتى لا بليبس في عيون بعض. على الرغم من أنه حدث نادر نسبيا، تشير إلى أن تقلب الأرنب الزجاجي بحاجة إلى أن تؤخذ في الاعتبار أثناء عملية جراحية والتحليل بعد الجراحة.
بالإضافة إلى ذلك، حقن تريامسينولون المناسب أمر حاسم لتجنب التعتيم النظارة من بلورات ستيرويد بيضاء، ثم سوف تعرقل عملية جراحية، والتصور النظارة بعد الجراحة بالتنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر. وللحد من هذه المشكلة، وينبغي أن يتم حقن تريامسينولون في الربع العلوي الزمانية. وبالمثل، ينبغي أن توضع تروكارس 1-2 مم من ليمبوس لتجنب النزف الزجاجي من الجسم الهدبي ولمس العدسة أرنب اعتبارهم كبير مع الإبرة. لمسة عدسة سيتسبب إعتام عدسة العين وسوف تعوق بدورها التصور السليم للمساحة الشبكية الفرعية أثناء التصوير بعد العملية الجراحية.
قد تسبب المنشطات، بما في ذلك سينولون، أنفسهم إعتام عدسة العين على مر الزمن. لا لاحظنا هذا عقب الإدارة سينولون لمدة تصل إلى 8 أشهر. ومع ذلك، فمن المحتمل أن إعتام عدسة العين الناجم عن الستيرويد سيتم تطوير إذا إدارة سينولون على مدى فترات طويلة من الزمن.
يمكن استخدام الأساليب المذكورة للتدريب الجراحي وتحليل الخلية-التكامل والدالة كما هو موضح هنا، وفي منشوراتنا السابقة. وقد الأسلوب أيضا أهمية عالية لإدارة ناقلات الأمراض الفيروسية الفرعية الشبكية الآن في التجارب السريرية لعدة من ضمور الشبكية الوراثي. وتشمل التعديلات المقبلة قد زرع مواد أكثر تعقيداً، مثل ورقة الناقلين وبيوجلس. كما تبرز أساليب التصوير السريري جديدة، ستكون هذه تكييفها بسهولة للعين الأرانب، وربما دون تعديلات.
In conclusion، يتجلى نموذج أرنب كبير العينين لتكون نموذجا ما قبل سريرية ذات صلة يحتوي على العديد من المزايا مقارنة بنماذج القوارض ط) لخص المراحل المختلفة للجمعية العامة، والثاني) تطبيق الطرق الجراحية والتصوير ذات الصلة بالمريض، وثالثاً ) تقييم التكامل بين الجهات المانحة الخلايا التي سيتم استخدامها كعلاج استبدال خلية للجمعية العامة، والاضطرابات ذات الصلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لدى أي من أصحاب المصالح المتنافسة أو المصالح المتضاربة.
Acknowledgments
هذه الدراسة كانت تدعمها المنح المقدمة من معهد كارولينسكا، مؤسسة مارغريتا الأميرة للمكفوفين، مؤسسة الأردن إدوين لبحوث طب العيون، ومؤسسة العين السويدية، مؤسسة الملك جوستاف الخامس، في أرميك مؤسسة ليندبيرج، ومؤسسة كرونقفيست.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4% trypan blue | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Use at 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Use 35 mg/kg ketamine |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Use 5 mg/kg xylazine |
| Triescence, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 2 mg intraviterial |
| Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% | APL | 321968 | Use 1 drop in each eye |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| Topical saline | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Use 100 mg/mL pentobarbital |
| Extension tube (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25 G/38 G polytip subretinal cannula | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25 G/38 G |
| Single Use Flat Lens | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri lid retractor | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Non-valved trocars | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Clawed forceps | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0 |
| 24 well plates | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer hemocytometer | VWR | 631-0925 | |
| New Zealand albino rabbits | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE cells | See reference number 1 | ||
| Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml | Dechra | 660500 | Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously |
References
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
- Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).
- Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
