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Biology

Sous-rétinienne Transplantation de cellules souches embryonnaires humaines pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules épithéliales dans un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique

doi: 10.3791/56702 Published: January 22, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Cellules épithéliales pigmentaire rétinien pouvaient constituer une thérapie cellulaire-remplacement de la forme avancée de la dégénérescence maculaire sèche liée à l’âge. Ce protocole décrit la génération d’un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique et la sous-rétinienne transplantation de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines dans ce modèle de la maladie.

Abstract

L’atrophie géographique (GA), le dernier stade de la dégénérescence maculaire liée à l’âge sèche se caractérise par la perte de la couche pigmentaire rétinien épithéliale (RPE), qui mène à la dégénérescence ultérieure des structures rétiniennes vitales (par exemple, photorécepteurs) causant déficience visuelle grave. De même, pre-perte et diminution de l’acuité visuelle est vu dans suivre à long terme jusqu'à des diabétiques avancée liées à l’âge dégénérescence maculaire humide (AMD) recevant un traitement anti-vasculaire facteur de croissance endothéliale (VEGF) intravitréenne. Par conséquent, d’une part, il est fondamental pour calculer efficacement les cellules RPE provenant d’une source illimitée qui pourrait servir de traitement substitutif. En revanche, il est important d’évaluer le comportement et l’intégration des cellules dérivées d’un modèle de la maladie entraînant chirurgicale et des méthodes d’imagerie comme près que possible de celles appliquées dans les humains. Ici, nous fournissons un protocole détaillé basé sur nos publications antérieures qui décrit la génération d’un modèle préclinique de l’Assemblée générale à l’aide de le œil de lapin albinos, pour évaluer les cellules souches embryonnaires humaines dérivées des cellules épithéliales pigmentaire rétinien (CSEh-RPE) dans un paramètre cliniquement pertinente. PRE-CSEh différenciée sont transplantées yeux naïfs ou les yeux NaIO3-induite de GA-comme la dégénérescence rétinienne à l’aide d’une technique 25 G transvitreal pars plana. Évaluation des zones dégénérées et transplantés est réalisée par imagerie en temps réel non invasif multimodale à haute résolution.

Introduction

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Ce protocole décrit la génération d’un modèle préclinique grand aux yeux de l’atrophie géographique (GA) qui permet l’évaluation de l’intégration de CSEh-RPE transplanté dans l’espace sous-rétinienne. Les méthodes décrites en détail ici ont été utilisés dans les 3 publications récentes qui démontrent la production d’une population enrichie, pure et fonctionnelle des cellules RPE de CSEh1, ainsi que la création de dommages rétiniens externe et un phénotype de type GA induite par l’injection sous-rétinienne de solutions salines et physiologiques (c.-à-d., BSS et PBS) ou NaIO3 dans le lapin yeux2,3. De plus, nous avons démontré que greffes de suspension sous rétinien de CSEh-RPE forment une vaste monocouches fonctionnelles avec photorécepteur sauvetage capacité2.

Plusieurs avantages accompagnent l’utilisation de le œil du lapin pour la génération d’un modèle de GA de la maladie. Tout d’abord, la taille de le œil du lapin, qui est de 70 % le volume d’un œil humain adult, permet cliniquement significative transplantation en utilisant une densité cellulaire qui est beaucoup plus faible que couramment utilisés dans les petits yeux rongeur (1 000 cellules/µL par rapport à 50 000 cellules/µL)4 , 5. Deuxièmement, la chirurgie chez les rongeurs est généralement transscleral par le biais de la choroïde, qui compromet la barrière rétinienne et potentiellement déclenche une réaction inflammatoire et un éventuel rejet6. Ensemble, les deux facteurs peuvent conduire à multicouches et agglutination des cellules transplantées et une intégration dans l’ensemble pauvre des cellules transplantées dans un tissu rétinien natif perturbé. Toutefois, le modèle de lapin aux grands yeux permet de réaliser une technique chirurgicale avec instrumentation identique au milieu clinique. Troisièmement, un modèle aux grands yeux permet également à haute résolution in vivo d’imagerie et de surveillance des cellules transplantées et la rétine sus-jacente à temps1,2,3. Ainsi, les auteurs décrivent un modèle préclinique cliniquement pertinent et rentables qui devrait être une alternative intéressante aux rongeurs pour tous ceux qui s’intéressent à la recherche de la rétine normale et malade et l’espace sous rétinien.

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Protocol

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Le protocole suivant suit les directives de protection des animaux de Karolinska Instituet. Toutes les expérimentations animales, à l’aide de lapins albinos de Nouvelle-Zélande (Table des matières) ont été approuvées par le Comité régional d’éthique animale (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permis : dnr 56/15). L’utilisation des CSEh (dnr 2011/745-31/3) et le transfert et la manipulation des CSEh-RPE (dnr 2013/813-31/2) est aussi conformément à la législation suédoise Karolinska Institutet et a été approuvé par le (Comité de l’éthique humaine régionale Regionala Etikprövningsnämnden i Stockholm).

1. sous-rétinienne Injection d’Iodate sodique (NaIO3) dans un modèle Animal aux grands yeux

  1. Anesthésier les animaux par voie intramusculaire dans la cuisse avec un mélange de kétamine 35 mg/kg et de xylazine 5 mg/kg de sérum physiologique à l’aide d’une seringue de 30 G, et dilater les pupilles avec collyre topique à l’aide d’un mélange de phényléphrine cyclopentolate et 2,5 % de 0,75 %. Bonne anesthetization est confirmée si l’animal ne réagit pas à une pincée dure de sa patte arrière.
  2. Placer le lapin sous le microscope chirurgical avec la tête orientée vers le chirurgien (Figure 1 a). Utilisez un rétracteur de couvercle pour enlever une membrane nictitante et de paupières avec un linge stérile pour minimiser le risque de contamination. Utilisation équilibrée de solution saline (BSS) pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie dans les deux yeux.
  3. Pour microchirurgie, utiliser un port-2 (ou 3-port en option) 25 G transvitreal pars plana technique avec des valves des trocarts pour l’insertion des instruments microchirurgicaux (Figure 1 b). La machine de vitrectomie multifonction dispose de ports pour connecter une canule d’infusion unique, endoillumination, vitrector et endolaser. Pour les injections sous-rétinienne, seulement l’endoillumination est obligatoire, qui fait une mise en place de 2 ports suffisante. Insérer l’endoillumation par le trocart gauche supérieur et utiliser le trocart droit supérieur pour la canule d’injection sous-rétinienne.
    1. Pour une configuration 3-port, utilisez le trocart temporal inférieur pour la canule de perfusion BSS. Si les instruments optionnels (par exemple, un vitrector) sont utilisés, introduisez-les à travers le trocart droit supérieur.
    2. Insérer les trocarts supérieurs 2 1-2 mm du limbe à l’aide de pinces à griffes pour attraper et déplacer la conjonctive recouvrant le site d’insertion.
    3. Assurez-vous que les trocarts sont insérée transsclerally un angle 30-45° limbus parallèles et continuez jusqu’au milieu de la pointe du trocart. Puis tournez le trocart à 90° et avancer dans le œil, visant au pôle postérieur de l’oeil. Cette procédure va éviter une fuite après une chirurgie de le sclerotomies et également réduire le risque d’endophtalmie (c'est-à-dire, une infection bactérienne dans les yeux). Voir aussi la Figure 2 b pour les postes de trocart.
    4. Mettre une lentille de contact à usage unique plat sur la cornée afin de visualiser la rétine, avec des larmes synthétiques comme gel de contact entre l’oeil et la lentille de contact (Figure 1 a).
    5. Attirer 500 µL de NaIO3 dans une seringue de 1 mL relié à un tube d’extension (exploité par l’assistant) et une canule de polytip 38 G (opéré par le chirurgien).
    6. Insérer la sonde d’endoillumination par le trocart gauche supérieure et la canule d’injection par le trocart droit supérieur et faire avancer la canule à travers l’espace vitré vers la rétine, visant pour la zone juste en dessous de la tête du nerf optique.
    7. Permettre à l’extrémité de la canule au toucher lentement la rétine jusqu'à ce qu’un blanchiment focal est visible. L’injection elle-même va pénétrer la rétine, permettant une livraison sous-rétinienne. Ne laissez pas la canule pénètrent dans la rétine, car cela peut provoquer une hémorragie.
    8. Injecter 50 µL de NaIO3 subretinally pendant 5 s. Étant donné qu’un plan de clivage naturel entre la rétine et la choroïde sous-jacente, une cloque translucide visible fasse progressivement pendant l’injection.
    9. Pendant l’injection, lentement rétracter l’aiguille, mais veillez à ce que l’extrémité est maintenue dans la cloque pour minimiser le reflux.
    10. Après le retrait de la canule d’injection et d’endoillumation, enlever les trocarts, conformément à l’aide de pinces à griffes et appliquez une légère pression pendant 30 s aux sclerotomies sans suture hermétique à l’aide de la pointe ou l’extrémité arrondie de la pince.
  4. En donner 10 mL de sérum physiologique par voie sous-cutanée pour prévenir la déshydratation. Ne donnez pas de stéroïdes topiques post-chirurgicale ou antibiotiques. Analgésiques de donner 0,5 mL de buprénorphine 0,3 mg/ml par voie sous-cutanée après chirurgie, ainsi que le jour après la chirurgie.
  5. Après utilisation, lavez tous les instruments en immergeant pendant quelques secondes tout d’abord dans l’éthanol à 70 %, deuxièmement en éthanol à 45 % et enfin dans l’eau distillée. Séchez-les bien avec une serviette en papier.
  6. Assister les animaux jusqu'à ce qu’ils reprennent conscience suffisante et placent tout seul amincie. Si nécessaire (par exemple, aux fins de l’immunohistochimie), euthanasier les animaux par injection intraveineuse de 100 mg/kg de pentobarbital (voir Table des matières).
  7. Attendre 7 jours pour procéder à la transplantation de cellules de CSEh-RPE.

2. sous-rétinienne Transplantation de cellules de CSEh-RPE chez les animaux traités

  1. Administrer 2 mg (100 µL) de triamcinolone intravitréenne chez des animaux anesthésiés à l’aide d’une aiguille d’injection de 30 g insérée 1-2 mm à partir du limbe dans le quadrant temporal inférieur 1 semaine avant la transplantation des CSEh-RPE et re-administrer tous les 3 mois. Assurez-vous de la pointe vers le pôle postérieur de le œil pour éviter une touche de lentille.
  2. Culture une monocouche de CSEh-RPE comme décrit plus haut1.
  3. Supprimer les milieux de la différenciation cellulaire (voir Table des matières) d’une monocouche confluente 24 puits CSEh-RPE et laver chaque bien avec 500 µL de PBS sans Ca2 + et Mg2 +. Répétez l’opération une fois de plus, pour un total de 2 lavages.
  4. Jeter le surnageant, ajouter 500 µL de trypsine chaque puits et incuber pendant 12 min à 37 ° C.
  5. Inclinaison de la plaque et retirez délicatement la trypsine (cellules doivent rester attachées à la plaque). Prélever des cellules dans 800 µL de médias de différenciation préchauffée frais 37 ° C par la pipette doux, ou même gratter si nécessaire, pour obtenir une suspension monocellulaire.
    Remarque : Utilisez une passoire de cellule de 40 µm si on observe des amas de cellules.
  6. Comte de cellules dans une hémocytomètre chambre à l’aide de 0,2 % bleu de Trypan, selon les instructions du fabricant.
  7. Ajouter 5 mL de différenciation des cellules médias et centrifuger à température ambiante, 300 x g pendant 5 min.
  8. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans du PBS de fraîchement stérilisée par filtration (passé à travers un filtre de seringue 25 mm) à une concentration finale de 1 000 cellules/µL.
  9. Aliquote la suspension cellulaire précédent dans 600 µL d’extraits et de garder sur la glace jusqu'à et Pendant la chirurgie.
  10. Anesthésier les animaux par voie intramusculaire dans la cuisse avec un mélange de xylazine kétamine et 5 mg/kg de 35 mg/kg de sérum physiologique à l’aide d’une seringue de 30 G. Dilater les pupilles avec collyre topique à l’aide d’amix de phényléphrine cyclopentolate et 2,5 % de 0,75 %. Bonne anesthetization est confirmée si l’animal ne réagit pas à une pincée dure dans sa patte arrière.
  11. Placer le lapin avec la tête orientée vers le chirurgien. Utilisez un rétracteur de couvercle pour enlever une membrane nictitante et de paupières avec un linge stérile pour minimiser le risque de contamination. BSS permet de prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie dans les deux yeux.
  12. Pour microchirurgie, utiliser un port-2 (ou 3-port en option) 25 G transvitreal pars plana technique avec trocarts placés dans les mêmes positions, comme décrit dans l’étape 1.3 et la Figure 2. Si les sclerotomies précédentes sont visibles, effectuez insertion trocart juste à côté, mais pas par l’intermédiaire de ceux-ci, afin de minimiser le risque de fuite postopératoire.
    1. Mettre une lentille de contact à usage unique plat sur la cornée afin de visualiser la rétine, avec des larmes synthétiques comme le gel de contact entre l’oeil et la lentille de contact (Figure 1 a).
    2. Après pointe bon positionnement (voir les étapes 1.3.5 et 1.3.6), injecter 50 µL d’une suspension de CSEh-RPE doucement mélangé (50 000 cellules) subretinally. But pour le centre de la zone de3 prétraités NaIO que se distingue par un réflexe de la caractéristique « métallique » endo-illumination. La rétine neurosensorielle devrait séparer facilement créer une cloque clairement visible. Rincer l’aiguille stérile H2O entre les deux lapins/après utilisation pour éviter le colmatage en raison de la cellule de l’aiguille des touffes. Changement de l’aiguille lorsque l’obstruction est remarqué.
    3. Pendant l’injection, lentement rétracter l’aiguille mais veillez à ce que l’extrémité est maintenue dans la cloque pour minimiser le reflux.
    4. Après le retrait de la canule d’injection et d’endoillumation, enlever les trocarts, conformément à l’aide de pinces à griffes et appliquez une légère pression pendant 30 s aux sclerotomies sans suture hermétique à l’aide de la pointe ou l’extrémité arrondie de la pince.
  13. En donner 10 mL de sérum physiologique par voie sous-cutanée pour prévenir la déshydratation. Ne donnez pas de stéroïdes topiques post-chirurgicale ou antibiotiques. Analgésiques de donner 0,5 mL de buprénorphine 0,3 mg/ml par voie sous-cutanée après chirurgie, ainsi que le jour après la chirurgie.
  14. Après utilisation, lavez tous les instruments en immergeant pendant quelques secondes, tout d’abord dans l’éthanol à 70 %, deuxièmement en éthanol à 45 % et enfin dans l’eau distillée. Séchez-les bien avec une serviette en papier.
  15. Assister les animaux jusqu'à ce qu’ils reprennent conscience suffisante et placent tout seul amincie. Le cas échéant (p. ex. à des fins d’immunohistochimie), euthanasier les animaux par injection intraveineuse de 100 mg/kg de pentobarbital.

3. in Vivo rétinienne et imagerie sous-rétinienne

  1. Utiliser un appareil de tomographie par SD-domaine spectral cohérence optique avec le logiciel qui l’accompagne (voir Table des matières) pour obtenir la transversales b-scans des animaux traités, conformément aux instructions du fabricant. Pour éviter les images floues, assurez-vous de garder la cornée humide en rinçant avec une solution saline topique toutes les 30 à 60 s.
    1. Placer les animaux anesthésiés et élève-dilatées (voir étapes 1.1 et 2.10) dans un montage réglable pour obtenir un tracé dégagé de la source lumineuse de l’instrument à la rétine de lapin.
    2. Obtenir au moins 3 OCT scans avec simultanée infrarouge-confocale ophtalmoscopie balayage de laser (IR-cSLO) des images de référence de la réflectance représentant la partie supérieure et centrale inférieure de la zone injectée.
    3. Obtenir des images de fond de œil en face avec cSLO bleu, vert, multicolore et infrarouge laser réflectance (c.-à-d., des couleurs laser simultanées multiples), respectivement.
    4. Capturer des images d’autofluorescence lumière bleue (FBA) en utilisant la capacité de laser lumière bleue de l’appareil SD-OCT.

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Representative Results

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Représentant en vivo image de BAF, IR-cSLO et SD-OCT de la rétine de lapin albinos normales sont affichées à la Figure 2. Notez les différentes couches rétiniennes avec leurs niveaux distinctif de réflexion de la lumière captée par l’instrument de SD-OCT.

Dans les Figures 1 a et 1 b de la Figure, le programme d’installation crée des bulles sous rétiniens est illustré : un rétracteur de couvercle est placé, en soumettant les paupières pour permettre l’insertion de 3 trocarts (Figure 1 b) 1-2 mm loin du limbus, afin d’éviter une lentille toucher et à un angle parallèle de 30-45 ˚ limbus. Trocarts permettra l’introduction d’une canule de perfusion en option, en plus d’une lumière et l’aiguille d’injection à travers la sclère. Une pupille dilatée avec une lentille de contact plate facilitera une vue sur le fond de le œil et de l’espace sous rétinien, tandis que l’intervention chirurgicale est effectuée.

Après l’injection de 50 µL de 1 mM NaIO3 solution, une cloque se forme dans l’espace sous-rétinienne qui résoudra et dégénèrent progressivement la rétine externe, tel qu’illustré dans l’image SD-OCT dans la Figure 3 a , trois mois après l’injection. Apprécier l’amincissement des couches neuroretinal ultrapériphériques dans la SD-OCT et les zones d’hypo-BAF, correspondant à la perte RPE re-créant ainsi un phénotype de Gas. Sur la désignation des zones de dommages, 50 000 CSEh-RPE dans un volume µL 50 est réinjecté à la transplantation, en créant une deuxième cloque qui résout comme illustré à la BAF et images (MC) multicolores dans la Figure 3 b. Reconnaître la légère à zones hyper-BAF modérée avec une focale plue hyper-BAF inférieurement à la limite de la zone de dommages, indicative du stress chronique du RPP natif indiqué dans les scans de SD-OCT ainsi que l’absence de zones pigmentées à l’image de MC. La cloque correspondant à l’injection de 50 µL de CSEh-RPE (50 000 cellules) des yeux non prétraités montrant des îlots de cellules pigmentées dans l’image (MC) et des structures rétiniennes bien conservés dans l’analyse de SD-OCT est montré à titre de comparaison (Figure 3).

Collectivement, cette procédure et la méthodologie permettant l’étude de l’intégration des greffes sous-rétinienne suspension de CSEh-RPE dans un modèle pertinent pour GA

Figure 1
Figure 1 : Injection mis en place (A) photos illustrant le montage chirurgical pour les injections sous rétiniens. L’animal est placé sous le microscope chirurgical (à gauche) et le chirurgien tient la sonde endoillumination insérée à travers le trocart gauche dans la main gauche, et l’instrument chirurgical intravitréenne (p. ex. canule d’injection sous-rétinienne) inséré par le trocart gauche dans la main droite (au milieu). Une lentille de contact plate placée sur la cornée permet une vue agrandie de le œil pendant l’intervention chirurgicale (à droite). (B) étroite vue schématique de le œil de lapin albinos avec le rétracteur de couvercle en place et le mamelon des trocarts inséré 1-2 mm profondeur de la limbe et inclinant 30-45 ° parallèle, ainsi que les trocarts qui facilitent l’introduction d’une option canule d’infusion unique, une lumière et l’aiguille pour injection. Une lentille de contact plate située sur le dessus de la pupille vous aidera à obtenir une meilleure vue de le œil de le œil pendant l’intervention chirurgicale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Albino Normal lapin rétine en vivo imagerie. In vivo BAF, IR-cSLO et SD-OCT images représentant une rétine de lapin albinos normal. Un coup vers le haut de la SD-OCT avec l’étiquette correspondante des différentes couches rétiniennes est vu dans l’image SD-OCT : GCL (couche de cellules de ganglion), IPL (couche plexiforme interne), INL (couche nucléaire interne), OPL (couche plexiforme externe), ONL (couche nucléaire externe), OLM (externe limiter la membrane), EZ (zone ellipsoïde), OS (segments externes), RPE (épithélium pigmentaire rétinien) et BM (la membrane de Bruch). Barreaux de l’échelle = 1 mm (FBA et IR-cSLO images), 200 µm (images SD-OCT). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : injections de suspension sous-rétinienne dans le modèle de lapin aux grands yeux. Images de la BAF (A), MC et SD-OCT injection sous-rétinienne de 1 mM NaIO3 3 mois après l’induction de dommages. Notez l’hypo-BAF entourée de zones hyper-BAF correspondant à la cloque et la neuroretina dégénéré dans la SD-octobre (B), à la BAF, MC, et images SD-OCT des yeux prétraitement avec 1 mM NaIO3 pendant 1 semaine, suivie d’une transplantation sous-rétinienne de 50 000 CSEh-RPE en suspension et analysées à 3 mois après la transplantation. Notez les zones hyper-BAF dans l’image de la BAF, l’absence de cellules pigmentées intégrées dans le MC et le neuroretina atrophique dans les images SD-octobre (C) MC et SD-OCT correspondant aux yeux naïfs non prétraités 3 mois après la transplantation sous-rétinienne de CSEh-RPE en suspension. Remarque les zones pigmentées sur l’image de la MC et la structure neuroretinal préservé sur la SD SD-oct.-OCT scan avions sont marqués (flèche verte). Pointes de flèches blanches marquent la frontière de bulles dans les en-face et les images SD-OCT. Barreaux de l’échelle = 1 mm (images BAF et MC), 200 µm (images SD-OCT). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Dans ce protocole, la génération d’un modèle aux grands yeux de GA et son usage préclinique pour évaluer les CSEh-RPE integration in vivo est décrite.

Pour la traduction de thérapies régénératives pour GA et les maladies apparentées dans la clinique7, il est important de développer et d’optimiser des méthodes qui capturent fidèlement les méthodes cliniques de transplantation et d’imagerie. Le lapin est dans cet aspect attrayant : il a un œil relativement important qui permet la chirurgie intraoculaire et l’utilisation de l’imagerie standard, et sont bon marché et facilement logés par rapport à d’autres animaux aux grands yeux.

Nous décrivons l’utilisation de transvitreal standard calibre 25 pars plana vitrectomie technique pour la création de bulles sous rétiniens de transplanter les CSEh-RPE ou d’induire des dommages sous rétinien. Au départ, nous avons utilisé une configuration 3-port, comme l’illustre l' Figure 1 b, avec l’intention d’utiliser le port de perfusion (trocart), dans le cas où une vitrectomie s’est déroulée au cours de la procédure. Toutefois, étant donné que nous n’avons pas trouvé une vitrectomie pour être nécessaires à l’application des injections sous rétiniennes, le port de perfusion a été omis. Néanmoins, la troisième option de port doit rester si la procédure est plus adaptée et une vitrectomie est effectuée.

Le lapin aux grands yeux est un modèle oculaire bien établi avec données accumulées sur l’anatomie et la physiologie au cours des siècles,8. En outre, lapins sont faciles à manipuler et race, sur le plan économique (p. ex., achat, logement et de garder), et facilement disponibles par rapport aux autres modèles de mammifère aux grands yeux. Un avantage majeur d’un grand modèle-eyed, c’est qu’il permet l’utilisation de techniques d’imagerie cliniques haute résolution, ce qui permet à son tour pour le suivi des cellules transplantées CSEh-RPE dans l’espace sous-rétinienne au fil du temps. Cependant, malgré les lagomorphes sont phylogénétiquement plus proche de l’homme que les rongeurs, il convient de constater qu’ils possèdent un merangiotic de la rétine et une strie visuelle, par rapport à un holangiotic de la rétine et une fovéa présent dans les primates9. Merangiotic moyens de rétine qui la plupart du sang fourniture de la rétine interne sont dérivé de la choriocapillaire, une différence qu’on a besoin de débattre car il peut augmenter le risque de lésion et l’hémorragie. Un avantage expérimental, c’est qu’il permet à la modélisation des stades antérieurs du GA suite sous-rétinienne bulles de solutions physiologiques seules, comme cela a été précédemment démontré1,3. Ces études suggèrent qu’une cloque sous-rétinienne provoquant une hypoxie rétine temporale dans le milieu de merangiotic peut suffire à causer la mort de photorécepteur ; Toutefois, dans ce contexte, perte RPE s’est avéré très probablement être généré par l’écoulement sous rétinienne induite à l’aide d’une seringue de 1 mL et un volume de bleb 50 µL, un phénomène aléatoire qui à son tour potentialise l’atrophie neuro-rétinienne. Donc, le volume bleb peut avoir un effet direct sur la rétine stretch dégâts, ce qui signifie que plus le volume utilisé (par exemple, 100 µL, comme a été utilisé dans d’autres études10), il peut devenir plus préjudiciable.

Une étape essentielle pour assurer l’intégration des cellules injectées est d’éviter le reflux des cellules dans le corps vitré lors de l’injection et le positionnement de l’aiguille dans l’espace sous-rétinienne. Si positionné trop profondément, la barrière/choroïde rétinienne externe va être pénétrée et cellules immunitaires peuvent envahir l’espace sous rétinien, provoquant un rejet immunitaire malgré l’utilisation de l’immunosuppression. Un autre aspect important pour le succès de la transplantation est l’état du corps vitré. Dans le présent modèle, vitrectomie n’est pas effectuée afin de minimiser les reflux et traumatisme chirurgical. Toutefois, il a été remarqué que, aux yeux de certains, il est difficile d’obtenir une position correcte de l’extrémité sur la rétine comme la pointe reste coincée dans l’interphase vitrifiée pré-rétiniennes conduisant à la formation de petites ou même sans bulles. Même si c’est un événement relativement rare, elle n’indique que la variabilité du lapin vitrifiée doit être pris en compte pendant la chirurgie et l’analyse post-opératoire.

En outre, l’injection correcte de triamcinolon est cruciale pour éviter masquer le fond de l’oeil en cristaux blancs stéroïde, qui entravera alors la chirurgie et la visualisation du fond de œil après une chirurgie par SD-OCT. Pour minimiser ce problème, l’injection de triamcinolon devrait être faite dans le quadrant temporal inférieur. De même, les trocarts doivent être placés 1 à 2 mm de la limbe pour éviter une hémorragie vitréenne du corps ciliaire et toucher la lentille d’unproportionally grand lapin avec l’aiguille. Une touche de lentille va provoquer une cataracte qui ne nuira à son tour une visualisation correcte de l’espace sous rétinien durant l’imagerie postopératoire.

Stéroïdes, y compris la triamcinolone, peuvent causer des cataractes au fil du temps. Nous n’avons pas observé cela après l’administration de triamcinolone jusqu'à 8 mois. Toutefois, il est probable que cataracte induite par des stéroïdes se développera si administration de triamcinolone sur longues périodes de temps.

Les méthodes décrites peuvent servir tant pour la formation en chirurgie et pour l’analyse des cellules-intégration et fonction décrite ici et dans nos publications précédentes. La méthode a aussi grande pertinence pour l’administration de vecteurs viraux sous rétiniens maintenant dans un essai clinique pour plusieurs dystrophies rétiniennes héréditaires. Futures modifications peuvent inclure la transplantation des matériaux plus complexes, tels que les transporteurs de la feuille et biogels. Nouvelles méthodes d’imagerie cliniques se présenteront, ceux-ci seront facilement adaptables à le œil du lapin, éventuellement sans modification.

In conclusion, le modèle de lapin aux grands yeux est démontré pour être un modèle préclinique pertinent qui présente plusieurs avantages par rapport aux modèles de rongeurs pour i) récapitulant les différentes étapes de la GA, ii) application patient-les méthodes chirurgicales et d’imagerie et iii ) évaluation de l’intégration de cellules du donneur pour servir de cellule substitutive pour GA et des troubles associés.

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Disclosures

Aucun des auteurs ont des intérêts divergents ou conflits d’intérêts.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par des subventions de l’Institut Karolinska, Fondation de la princesse héritière Margareta pour déficients visuels, la Edwin Jordanie Fondation pour la recherche ophtalmologique, la Fondation suédoise de le œil, le roi Gustav V Foundation, le ARMEC Lindeberg Foundation et la Fondation Cronqvist.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

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References

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Sous-rétinienne Transplantation de cellules souches embryonnaires humaines pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules épithéliales dans un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique
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Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).More

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).

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