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Biology

Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

Published: January 22, 2018 doi: 10.3791/56702
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 2, 1
1Clinical Neuroscience, Section for Ophtalmology and Vision, Karolinska Institutet, 2Clinical Sciences, Intervention and Technology, Division of Obstetrics and Gynecology, Karolinska Institutet
* These authors contributed equally

Summary

Retinalen Pigment Epithelzellen könnte als eine Zelle-Ersatz-Therapie für die fortgeschrittene Form der trockene altersbedingte Makuladegeneration dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen Modells der geografischen Atrophie und die subretinale Transplantation von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigment Epithelzellen auf dieses Modell der Krankheit.

Abstract

Geografischen Atrophie (GA), die späte Phase der trockene altersbedingte Makuladegeneration zeichnet sich durch Verlust der retinalen Pigment (RPE) Epithelschicht, führt zu einer nachfolgenden Degeneration des lebenswichtigen retinalen Strukturen (z.B. Photorezeptoren) verursacht schwere Sehbehinderung. Ebenso ist RPE-Verlust und Abnahme der Sehschärfe in langfristigen Folgen oben gesehen von Patienten mit fortgeschrittenen Feuchte altersbedingte Makuladegeneration (AMD), die intravitreale Anti-vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) Behandlung. Daher ist es auf der einen Seite grundlegende effizient RPE-Zellen aus einer unbegrenzten Quelle abgeleitet, die als Ersatz-Therapie dienen könnte. Auf der anderen Seite, es ist wichtig, das Verhalten und die Integration der abgeleiteten Zellen in einem Modell der Krankheit mit chirurgischen bewerten und bildgebende Verfahren wie nah wie möglich an die beim Menschen angewendet. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll basierend auf unseren bisherigen Veröffentlichungen, die die Generation der präklinischen Modell GA beschreibt mit Albino Kaninchenauge für Bewertung der menschlichen embryonalen Stammzellen retinalen Pigment Epithelzellen (hESC-RPE) abgeleitet in eine klinisch relevante Einstellung. Differenzierte hESC-RPE werden verpflanzt in naiven Augen oder mit NaIO3-GA-Like Netzhautdegeneration mit einer 25 G Transvitreal Pars Plana Technik induziert. Bewertung der degenerierten und transplantierten Gebieten erfolgt durch multimodale hochauflösende nichtinvasive Echtzeit-Bildgebung.

Introduction

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen präklinischen Modell der geografischen Atrophie (GA), die die Auswertung der Integration von transplantierten hESC-RPE in den subretinalen Raum ermöglicht. Die hier ausführlich beschriebenen Methoden wurden in 3 neueren Publikationen verwendet, die die Produktion einer angereicherten, rein und funktionale Bevölkerung von RPE-Zellen aus hESC1sowie die Schaffung der äußeren Netzhaut Schaden und ein GA-ähnlichen Phänotyp zeigen induziert durch die subretinale Injektion von physiologischen Salzlösungen (d.h., BSS und PBS) oder NaIO3 im Kaninchen Auge2,3. Wir zeigten weiter, dass subretinalen Aussetzung Transplantationen von hESC-RPE umfangreiche funktionale Monolagen mit Photorezeptor Rettung Kapazität2 bilden.

Mehrere Vorteile begleiten den Einsatz von Kaninchenauge zur Erzeugung von einem GA-Modell der Krankheit. Erstens, die Größe der Kaninchenauge, die 70 % das Volumen eines Erwachsenen menschlichen Auges, können klinisch bedeutsamen Transplantation mit einer Zelldichte, die viel niedriger als in kleinen Nagetier Augen (1.000 Zellen/µL vs. 50.000 Zellen/µL)4 routinemäßig eingesetzt , 5. Zweitens Chirurgie bei Nagetieren ist in der Regel Transscleral durch die Aderhaut, die Kompromisse der retinalen-Schranke und potenziell löst eine Entzündungsreaktion und eine mögliche Ablehnung-6. Beide Faktoren können zu Ölpauseverfahren und Verklumpung der transplantierten Zellen und einer insgesamt schlechten Integration der transplantierten Zellen in einem gestörten native Netzhautgewebe zusammen führen. Die großen Augen Kaninchen-Modell ermöglicht jedoch eine Operationstechnik mit Instrumentierung identisch mit einer klinischen Umgebung durchführen. Drittens ermöglicht eine große-Augen-Modell auch mit hoher Auflösung in Vivo imaging und Überwachung der transplantierten Zellen und der darüberliegenden Netzhaut durch Zeit1,2,3. So beschreiben wir eine klinisch relevante und kosteneffiziente präklinische Modell, die eine attraktive Alternative zu Nagetiere für jedermann mit einem Interesse in der Forschung der normalen und krankhaften Netzhaut und subretinalen Raum sein sollte.

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Protocol

Das folgende Protokoll folgt die Tierbetreuung Richtlinien des Karolinska Instituet. Alle Tierversuche mit Neuseeland Albino Kaninchen (Table of Materials) von der regionalen Tier Ethikkommission (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) genehmigt worden (zulassen: Dnr 56/15). Die Verwendung von hESC (Dnr 2011/745-31/3) und die Übertragung und Bearbeitung von hESC-RPE (Dnr 2013/813-31/2) steht auch im Einklang mit den schwedischen Gesetzen und Vorschriften des Karolinska Institutet und genehmigt wurde, von der regionalen menschliche Ethik Komitee ( Regionala Etikprövningsnämnden ich Stockholm).

1. subretinale Injektion von Natrium Jodat (NaIO3) in einem Tiermodell mit großen Augen

  1. Tiere durch intramuskuläre Verabreichung in den Oberschenkel mit einer Mischung aus 35 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin in Kochsalzlösung mit einer 30 G Spritze zu betäuben, und Schülerinnen und Schüler mit topischen Augentropfen mit einer Mischung aus Cyclopentolate und 2,5 % Phenylephrin 0,75 % dehnen. Richtige Anesthetization wird bestätigt, wenn das Tier nicht auf eine harte Prise seine hintere Bein reagiert.
  2. Legen Sie die Kaninchen unter dem Operationsmikroskop mit dem Kopf nach dem Chirurgen (Abbildung 1A). Verwenden Sie einen Deckel-Retraktor, um Augenlider und Nictitans Membran mit einem sterilen Tuch zur Minimierung des Risikos einer Kontamination zu entfernen. Verwendung ausgewogen Salzlösung (BSS), Trockenheit während Narkose in beiden Augen zu verhindern.
  3. Für Mikrochirurgie, Verwendung einer 2-Port (oder optional 3-Port) 25 G Transvitreal pars Plana Technik mit nicht geschlossenen Trokare für das Einfügen von mikrochirurgischen Instrumenten (Abbildung 1 b). Multifunktions-Vitrektomie-Maschine verfügt über Anschlüsse, eine Infusion Kanüle, Endoillumination, Vitrector und Endolaser zu verbinden. Für subretinalen Injektionen ist nur die Endoillumination obligatorisch, wodurch eine 2-Port-Einstellung ausreichend. Legen Sie die Endoillumation durch den oberen linken Trokar und verwenden Sie den oberen rechten Trokar für die subretinale Injektionskanüle.
    1. Verwenden Sie für eine 3-Port-Konfiguration den unteren zeitlichen Trokar für die BSS-Infusion-Kanüle. Wenn optionale Instrumente (z. B. eine Vitrector) werden verwendet, fügen Sie sie durch den oberen rechten Trokar.
    2. Legen Sie die oberen 2 Trokare 1-2 mm aus dem Limbus mit krallenbewehrten Pinzette zu greifen und die Bindehaut über die Einstichstelle zu verdrängen.
    3. Stellen Sie sicher der Trokare sind eingefügte Transsclerally in einem parallelen Winkel von 30-45° Limbus, und fahren Sie bis zur Mitte der Spitze der den Trokar. Dann drehen Sie den Trokar 90° und voraus in das Auge, mit dem Ziel am hinteren Pol des Auges. Dieses Verfahren wird postoperative Leckage aus der Sclerotomies vermeiden und auch verringern das Risiko von Endophthalmitis (z. B. bakterielle Infektion im Auge). Siehe auch Abbildung 2 b für Trokar Positionen.
    4. Setzen Sie einen einmaligen Gebrauch flache Kontaktlinsen auf der Hornhaut, die Netzhaut, mit synthetischen Tränen als Kontaktgel zwischen Auge und Kontaktlinse (Abbildung 1A) zu visualisieren.
    5. Ziehen Sie 500 µL NaIO3 in eine 1 mL Spritze verbunden mit einem Verlängerungsrohr (betrieben von der Assistentin) und 38 G Polytip Kanüle (betrieben durch den Chirurgen).
    6. Fügen Sie der Endoillumination Sonde durch den oberen linken Trokar und die Injektionskanüle durch den oberen rechten Trokar ein und fördern Sie die Kanüle durch den gläsernen Raum in Richtung der Netzhaut, mit dem Ziel, für den Bereich direkt unterhalb des Sehnervenkopfes.
    7. Lassen Sie die Spitze der Kanüle, die Netzhaut langsam zu berühren, bis eine fokale Aufhellung sichtbar ist. Die Injektion selbst dringt die Netzhaut, zulassend subretinalen Lieferung. Lassen Sie sich nicht die Kanüle die Netzhaut zu durchdringen, da dies zu Blutungen führen kann.
    8. Injizieren Sie 50 µL NaIO3 subretinally über einen Zeitraum von 5 s. Da gibt es eine natürliche Spaltung Ebene zwischen der Netzhaut und der darunter liegenden Aderhaut, sollte eine deutlich sichtbare halbtransparenten Lungenblase allmählich während der Injektion bilden.
    9. Während der Injektion langsam zurückziehen der Nadelöhrs, aber stellen Sie sicher, dass die Spitze innerhalb der Lungenblase Rückfluß zu minimieren eingehalten wird.
    10. Nach dem Entfernen der Kanüle Endoillumation und Injektion der Trokare mit krallenbewehrten Pinzette zu entfernen, und üben Sie leichten Druck für 30 s, um die selbstdichtenden Naht-weniger Sclerotomies mit der Spitze oder der stumpfen Ende der Zange.
  4. Postoperativ geben Sie 10 mL Kochsalzlösung subkutan, um Austrocknung zu verhindern. Geben Sie keine postoperative topische Steroide oder Antibiotika. Für Analgetika 0,5 mL Buprenorphin 0,3 mg/ml subkutan nach der Operation, als auch am Tag nach der Operation geben.
  5. Nach der Verwendung waschen alle Instrumente durch Eintauchen für ein paar Sekunden zunächst in 70 % igem Ethanol, zweitens in 45 % Ethanol, und schließlich in destilliertem Wasser. Richtig mit einem Papiertuch abtrocknen.
  6. Besuchen Sie Tiere, bis sie wieder genügend Bewusstsein und Sie sie alle einzelnen Tangotanzen legen. Auf Wunsch (z.B.Immunohistochemistry Zwecken) einschläfern von Tieren durch intravenöse Injektion von 100 mg/kg Pentobarbital (siehe Tabelle der Materialien).
  7. Warten Sie 7 Tage mit der Transplantation von hESC-RPE-Zellen fortfahren.

2. subretinalen Transplantationen von hESC-RPE-Zellen im behandelten Tiere

  1. Verwalten Sie 2 mg (100 µL) der intravitrealen Triamcinolon bei narkotisierten Tieren mit einer 30 g Injektionsnadel 1-2 mm aus dem Limbus im unteren temporalen Quadranten 1 Woche vor der Transplantation hESC-RPE und neu verwalten sie alle 3 Monate. Achten Sie darauf die Spitze in Richtung der hinteren Pol des Auges, einen Objektiv-Touch zu vermeiden.
  2. Kultur eine hESC-RPE Monolage wie zuvor1beschrieben.
  3. Zelle Differenzierung Media (siehe Tabelle der Materialien) von einer 24-Well konfluierende hESC-RPE monomolekularen Film zu entfernen und waschen jeweils gut mit 500 µL PBS ohne Ca2 + und Mg2 +. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal, für eine Gesamtmenge von 2 Wäschen.
  4. Überstand verwerfen, 500 µL von Trypsin pro Bohrloch hinzufügen und 12 min bei 37 ° c inkubieren
  5. Die Platte kippen und vorsichtig Trypsin (Zellen sollte die Platte befestigt bleiben). Zellen in 800 µL frische 37 ° C vorgewärmte Differenzierung Medien durch sanfte pipettieren, oder sogar kratzen, wenn nötig, um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten, zu sammeln.
    Hinweis: Verwenden einer 40 µm-Sieb Zelle Zelle Klumpen eingehalten.
  6. Anzahl der Zellen in einer Hemocytometer-Kammer mit 0,2 % Trypan blau, entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
  7. 5 mL Differenzierung Medien und Zentrifuge Zellen bei Raumtemperatur, 300 X g für 5 min zugeben.
  8. Überstand verwerfen und Pellet in frisch Filter sterilisiert PBS (durch eine 25 mm-Spritze-Filter geleitet), eine Endkonzentration von 1.000 Zellen/µL aufzuwirbeln.
  9. Aliquot der vorherigen Zellsuspension in 600 µL Aliquots und halten Sie auf dem Eis bis und während der Operation.
  10. Betäuben Sie Tiere durch intramuskuläre Verabreichung in den Oberschenkel mit einer Mischung aus 35 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin in Kochsalzlösung mit einer 30 G Spritze. Erweitern Sie Schülerinnen und Schüler mit topischen Augentropfen mit Amix von 0,75 % Cyclopentolate und 2,5 % Phenylephrin. Richtige Anesthetization wird bestätigt, wenn das Tier nicht auf eine harte Prise in seine hintere Bein reagiert.
  11. Legen Sie die Kaninchen mit dem Kopf nach dem Chirurgen. Verwenden Sie einen Deckel-Retraktor, um Augenlider und Nictitans Membran mit einem sterilen Tuch zur Minimierung des Risikos einer Kontamination zu entfernen. Verwenden Sie BSS Trockenheit während Narkose in beiden Augen zu verhindern.
  12. Für Mikrochirurgie, Verwendung einer 2-Port (oder optional 3-Port) 25 G Transvitreal pars Plana Technik mit Trokare platziert in den gleichen Positionen wie in Schritt 1.3 und Abbildung 2beschrieben. Wenn die vorherigen Sclerotomies sichtbar sind, führen Trokar einführen angrenzend, aber nicht durch diese, zur Minimierung des Risikos von postoperativen Leckage.
    1. Setzen Sie einen einmaligen Gebrauch flache Kontaktlinsen auf der Hornhaut, die Netzhaut, mit synthetischen Tränen als Kontaktgel zwischen Auge und Kontaktlinse (Abbildung 1A) zu visualisieren.
    2. Injizieren Sie nach der richtigen Spitze Positionierung (siehe Schritte 1.3.5 und 1.3.6) 50 µL einer sanft gemischt hESC-RPE-Suspension (50.000 Zellen) subretinally. Ziel für die Mitte des Bereichs NaIO3 vorbehandelt zeichnet sich durch einen charakteristischen "metallic" Endo-Beleuchtung-Reflex. Die neurosensorische Netzhaut sollte trennen leicht schaffen eine deutlich sichtbar auf. Bündig die Nadel mit sterilen H2O dazwischen Kaninchen/nach verwenden, um die Nadel verstopfen durch Zelle zu vermeiden Klumpen. Änderung der Nadel bei Verstopfung wird bemerkt.
    3. Während der Injektion langsam zurückziehen der Nadelöhrs, aber stellen Sie sicher, dass die Spitze innerhalb der Lungenblase Rückfluß zu minimieren eingehalten wird.
    4. Nach dem Entfernen der Kanüle Endoillumation und Injektion der Trokare mit krallenbewehrten Pinzette zu entfernen, und üben Sie leichten Druck für 30 s, um die selbstdichtenden Naht-weniger Sclerotomies mit der Spitze oder der stumpfen Ende der Zange.
  13. Postoperativ geben Sie 10 mL Kochsalzlösung subkutan, um Austrocknung zu verhindern. Geben Sie keine postoperative topische Steroide oder Antibiotika. Für Analgetika 0,5 mL Buprenorphin 0,3 mg/ml subkutan nach der Operation, als auch am Tag nach der Operation geben.
  14. Nach der Verwendung waschen alle Instrumente durch Eintauchen für ein paar Sekunden, zunächst in 70 % igem Ethanol, zweitens in 45 % Ethanol, und schließlich in destilliertem Wasser. Richtig mit einem Papiertuch abtrocknen.
  15. Besuchen Sie Tiere, bis sie wieder genügend Bewusstsein und Sie sie alle einzelnen Tangotanzen legen. Bei Bedarf (z.B. für Zwecke der Immunhistochemie) einschläfern von Tieren durch intravenöse Injektion von 100 mg/kg Pentobarbital.

3. in Vivo Retinal und subretinalen Imaging

  1. Spectral-Domain optische Kohärenz Tomographie (SD-OCT) Gerät mit der mitgelieferten Software zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien), Cross-sectional b-Scans von den behandelten Tieren, laut Angaben des Herstellers zu erhalten. Um Bild Unschärfe zu vermeiden, achten Sie darauf, die Hornhaut feucht zu halten, durch alle 30-60 s mit topischen Kochsalzlösung spülen.
    1. Legen Sie den narkotisierten und Pupille Tiere (siehe Schritte 1.1 und 2.10) in eine verstellbare Halterung, einen ungehinderten Weg von der Lichtquelle Instrument der Kaninchen Netzhaut zu erhalten.
    2. Erhalten Sie mindestens 3 OCT Scans mit gleichzeitiger Infrarot-konfokalen scanning Laser Ophthalmoskopie (IR-cSLO) Reflexion Referenzbilder repräsentiert die oberen, mittleren und untere Teil der Injektionsbereich.
    3. De-Gesicht Fundus Bilder mit cSLO blau, grün, Infrarot- und mehrfarbigen laser Reflexion (d.h. mehrere gleichzeitige Laser-Farben), bzw. zu erhalten.
    4. Aufnahmen Sie blaues Licht Autofluoreszenz (BAF) Verwendung der Blaulicht-Laser-Fähigkeit des Gerätes SD-OCT.

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Representative Results

Vertreter in Vivo Bilder von BAF, IR-cSLO und SD-OCT der normalen Albino Kaninchen Netzhaut sind in Abbildung 2dargestellt. Beachten Sie die verschiedenen Schichten der Netzhaut mit ihrer markanten Ebenen der Lichtreflexion von der SD-OCT Instrument erfasst.

In Abbildungen 1A und 1 b Abbildung, wird das Setup erstellen subretinalen Blebs dargestellt: ein Deckel Retraktor positioniert, unterwirft die Augenlider um das Einfügen von 3 Trokare (Abbildung 1 b) 1 – 2 mm weit von der Limbus zu ermöglichen, um ein Objektiv zu vermeiden Tippen Sie auf, und in einem 30-45 ˚ Limbus parallel Winkel. Trokare werden die Einführung einer optional Infusion Kanüle, zusätzlich ein Licht, und die Spritze durch die Sklera ermöglichen. Eine erweiterte Pupille zusammen mit einer flachen Kontaktlinse wird einen Blick auf das Auge-Fundus und den subretinalen Raum erleichtern, während der chirurgische Eingriff durchgeführt wird.

Nach der Injektion von 50 µL 1 mm NaIO3 Lösung entsteht eine Blase in den subretinalen Raum, der zu lösen und nach und nach der äußeren Netzhaut degenerieren wie drei Monate nach der Injektion in das SD-OCT-Bild in Abbildung 3A gezeigt. Zu schätzen wissen Sie, die Ausdünnung der äußersten neuroretinale Schichten in den SD-OCT und Hypo-BAF, RPE-Verlust, wodurch wieder einen GA-ähnlichen Phänotyp entspricht. Nach Identifikation des Bereichs Schaden ist 50.000 hESC-RPE in einem 50 µL Volumen wieder injiziert zur Transplantation, erstellen eine zweite Blase, die aufgelöst wird, wie in der BAF und Multi-Color (MC) Bild in Bild 3 bgezeigt. Erkennen Sie die leichte bis moderate hyper-BAF Bereiche mit einer fokalen erhöhte hyper-BAF inferior an der Grenze des Bereichs Schaden, Anzeichen für chronischen Stress der native RPE in den SD-OCT Scans sowie das Fehlen von pigmentierten Bereiche in der MC-Bild gezeigt. Die Lungenblase entspricht die Injektion von 50 µL hESC-RPE (50.000 Zellen) in nicht vorbehandelt Augen zeigen Flecken von pigmentierten Zellen (MC) und gut erhaltene retinalen Strukturen in den SD-OCT-Scan zeigt zum Vergleich (Abbildung 3).

Zusammen ermöglichen diese Vorgehensweise und Methodik der Studie über die Integration der subretinalen Aussetzung Transplantationen von hESC-RPE in einem entsprechenden Modell GA.

Figure 1
Abbildung 1: Injektion einrichten (A) Bilder Darstellung der chirurgischen Einrichtung für subretinalen Injektionen. Das Tier befindet sich unter dem Operationsmikroskop (links) und der Chirurg hält die Endoillumination Sonde eingefügt durch den linken Trokar in der linken Hand die intravitreale chirurgisches Instrument (z.B. subretinalen Injektionskanüle) eingefügt durch den linken Trokar in der rechten Hand (Mitte). Eine flache Kontaktlinse auf die Hornhaut gelegt ermöglicht eine vergrößerte Darstellung des Augenhintergrundes während des chirurgischen Eingriffs (rechts). (B) enge schematische Darstellung der Albino Kaninchenauge mit dem Deckel Retraktor und die Brustwarze aus der Trokare 1-2mm tief aus dem Limbus und eingefügt in einem parallel 30-45 °-Winkel, zusammen mit der Trokare, die die Einführung eines optionalen zu erleichtern Infusion-Kanülen, ein Licht, und die Nadel für die Injektion. Eine flache Lage auf der Pupille Kontaktlinse wird dazu beitragen, eine bessere Sicht des Augenhintergrundes Auge während des chirurgischen Eingriffs. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Normale Albino Kaninchen Netzhaut in-Vivo Bildgebung. In vivo BAF, IR-cSLO und SD-OCT Bilder, eine normaler Albino Kaninchen Netzhaut darstellt. Ein Schlag, von der SD-OCT mit der entsprechenden Kennzeichnung der verschiedenen retinalen Schichten ist in das SD-OCT Bild gesehen: GCL (Ganglion Zellschicht), IPL (innere plexiformer Schicht), INL (nukleare Innenschicht), OPL (äußeren plexiformen Schicht), ONL (nukleare Außenschicht), OLM (äußere Begrenzung der Membran), EZ (Ellipsoid-Zone), Betriebssystem (Außensegmenten), RPE (retinale Pigmentepithel) und BM (Bruch Membran). Skalieren von Balken = 1 mm (BAF und IR-cSLO Bilder), 200 µm (SD-OCT Bilder). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: subretinalen Aussetzung Injektionen in die großen Augen Kaninchen Modell. (A) BAF, MC und SD-OCT Bilder von subretinalen Injektion von 1 mM NaIO3 3 Monate nach Schaden Induktion. Beachten Sie die Hypo-BAF umgeben von hyper-BAF Bereiche entsprechend der Blase und der degenerierten Neuroretina in den SD-OCT (B) BAF, MC, und SD-OCT Bilder von Augen vorbehandelt mit 1 mM NaIO3 für 1 Woche, gefolgt von subretinalen Transplantationen von 50.000 hESC-RPE in Suspension und analysierten 3 Monate nach der Transplantation. Beachten Sie die hyper-BAF Bereiche im BAF Bild, das Fehlen von integrierten pigmentierten Zellen in der MC und der atrophischen Neuroretina in den SD-OCT (C) MC und SD-OCT Bildern entspricht nicht vorbehandelt naiven Augen 3 Monate nach der subretinalen Transplantation der hESC-RPE in der Schwebe. Beachten Sie, dass die pigmentierten Bereiche auf dem MC-Bild und die erhaltenen neuroretinale Struktur auf der SD-Okt. SD-OCT scan-Flugzeuge sind gekennzeichnet (grünen Pfeil). Weiße Pfeilspitzen markieren die Grenze von Blebs im de-Gesicht und SD-OCT Bilder. Skalieren von Balken = 1 mm (BAF und MC Bilder), 200 µm (SD-OCT Bilder). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

In diesem Protokoll wird die Generation eines großen Augen Modells der GA und den präklinischen Einsatz für die Bewertung der hESC-RPE Integration in Vivo beschrieben.

Für die Übersetzung der regenerative Therapien für GA und damit verbundenen Krankheiten in die Klinik-7ist es wichtig, Entwicklung und Optimierung von Methoden, die die klinischen Methoden für Transplantation und Imaging treu zu erfassen. Das Kaninchen ist in dieser Hinsicht attraktiv: Es hat ein relativ großes Auge, das intraokulare Chirurgie und Verwendung von standard-Bildgebung ermöglicht, und ist billig und leicht untergebracht im Vergleich zu anderen Tieren große Augen.

Wir beschreiben die Verwendung von standard-Transvitreal 25-Gauge Pars Plana Vitrektomie Technik zur Erstellung von subretinalen Blebs induzieren subretinalen Schaden oder hESC-RPE zu verpflanzen. Anfangs verwendeten wir eine 3-Port-Konfiguration, wie dargestellt in Abbildung 1 b, mit der Absicht des Infusion Ports (Trokar), für den Fall, dass während des Verfahrens eine Vitrektomie durchgeführt wurde. Da wir eine Vitrektomie erforderlich für die Anwendung von subretinalen Injektionen nicht gefunden haben, ist die Infusion Port ausgelassen worden. Dennoch sollte der dritte Port Option bleiben, wenn das Verfahren weiter angepasst und eine Vitrektomie durchgeführt.

Die große Augen Kaninchen ist ein etablierter okuläre Modell mit gesammelten Daten über Anatomie und Physiologie in den vergangenen Jahrhunderten8. Darüber hinaus Kaninchen sind einfach zu handhaben und Rasse, wirtschaftlich attraktiv (z.B. Kauf, Gehäuse und halten), und leicht zugänglich im Vergleich zu anderen großen Augen Säugetier-Modellen. Ein großer Vorteil eines großen Augen-Modells ist, dass es ermöglicht die Verwendung von hochauflösenden klinische bildgebende Verfahren, die wiederum für die Verfolgung von transplantierten hESC-RPE-Zellen in den subretinalen Raum im Laufe der Zeit zu ermöglichen. Jedoch trotz Gliedmaßen phylogenetisch näher an Menschen als Nagetiere, festzustellen, dass sie besitzen eine Merangiotic Netzhaut und eine visuelle Ader, im Vergleich zu einem Holangiotic Netzhaut und ein Fovea in Primaten9vorhanden. Merangiotic Netzhaut Mittel, die meisten des Blutes der inneren Netzhaut liefern leitet sich aus der Choriokapillaris, einen Unterschied, die man braucht, zu betrachten, da es das Risiko von Verletzung und Blutung erhöhen kann. Eine experimentelle Vorteil ist, dass es für die Modellierung von früherer Stadien von GA nach subretinalen Blebs der physiologischen Lösungen allein, wie schon zuvor nachgewiesene1,3. Diese Studien ergeben, dass ein subretinalen Lungenblase temporalen Retina Hypoxie im Merangiotic Milieu verursacht möglicherweise genug zum Photorezeptor Tode führen; jedoch in diesem Zusammenhang RPE Verlust nachweislich am ehesten durch den subretinalen Fluss induziert durch eine 1 mL Spritze und einem 50 µL Lungenblase Volumen, ein zufälliges Phänomen, das wiederum Neuro-retinalen Atrophie potenziert erzeugt werden. Daher haben die Lautstärke auf einen direkten Einfluss auf die Netzhaut Stretch Schaden verursacht, was bedeutet, dass je größer das Volumen verwendet (z. B.100 µL, wie in anderen Studien10verwendet wurde), desto mehr Schaden kann es werden.

Ein wichtiger Schritt zur Integration der injizierten Zellen ist Rückfluß der Zellen in den Glaskörper beim Einspritzen und die Positionierung der Nadel in den subretinalen Raum zu vermeiden. Wenn zu tief positioniert, der äußeren Netzhaut Barriere/Aderhaut durchdrungen werden und Immunzellen können dringen in den subretinalen Raum, Immunabwehr trotz des Einsatzes der Immunsuppression verursachen. Ein weiterer wichtiger Aspekt für den Erfolg der Transplantation ist der Zustand des Glaskörpers. Des gegenwärtigen Modells erfolgt Vitrektomie nicht um Reflux und chirurgische Trauma zu minimieren. Allerdings wurde festgestellt, dass in einigen Augen es schwierig ist, eine richtige Tipp-Position auf der Netzhaut zu bekommen, wie die Spitze in der Pre-retinalen Glaskörper Interphase führt zur Bildung von kleinen oder gar keinen Blebs stecken. Obwohl es ein relativ seltenes Ereignis ist, bedeutet es, dass die Variabilität des Kaninchens Glaskörper muss während der Operation und postoperative Analyse berücksichtigt werden.

Darüber hinaus ist die korrekte Injektion von Triamcinolon entscheidend zur Vermeidung des Augenhintergrundes durch weiße Steroid Kristalle, die dann Operation und postoperative Fundus Visualisierung von SD-OCT behindern werden verdeckt. Um dieses Problem zu minimieren, sollte die Injektion von Triamcinolon im unteren temporalen Quadranten erfolgen. Ebenso sollten Trokare 1-2 mm aus dem Limbus, Glaskörperhämorrhagie aus dem Ziliarkörper und berühren die unverhältnismäßig große Kaninchen-Linse mit der Nadel zu vermeiden platziert werden. Ein Objektiv-Touch wird ein grauer Star verursachen, die wiederum Visualisierung von subretinalen Raum während der postoperativen Bildgebung behindert werden.

Steroide, einschließlich Triamcinolon, können sich im Laufe der Zeit Katarakte verursachen. Wir haben dies nicht beobachtet, nach Gabe von Triamcinolon für bis zu 8 Monate. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass Steroid-induzierte Katarakte entwickeln werden, wenn Triamcinolon über große Zeiträume hinweg zu verwalten.

Die beschriebenen Methoden können für chirurgische Ausbildung und für die Analyse der Zelle-Integration und Funktion wie hier und in unseren früheren Publikationen beschrieben verwendet werden. Die Methode hat auch hohen Relevanz für die Verwaltung von subretinalen Virenvektoren jetzt in klinischen Studie für mehrere erbliche Netzhaut Dystrophien. Zukünftige Änderungen umfassen Transplantation komplexer Materialien, wie Blatt-Träger und Biogels. Neue klinische bildgebende Verfahren entstehen, werden diese Kaninchenauge, möglicherweise ohne Änderungen angepasst.

Lassen, zeigt das große Augen Kaninchen-Modell zu einer relevanten präklinischen Modell sein, das hat mehrere Vorteile im Vergleich zu Nager-Modelle für i) Rekapitulation der verschiedene Phasen des GA, Ii) Anwendung patientenrelevanten chirurgische und bildgebenden Methoden und iii ) Bewertung der Integration der Spenderzellen als Zellersatztherapie für GA und verwandten Erkrankungen verwendet werden.

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Disclosures

Die Autoren keine konkurrierenden Interessen oder widersprüchliche Interessen.

Acknowledgments

Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Karolinska-Institut, die Kronprinzessin Margareta Stiftung für Sehgeschädigte, Edwin Jordan Foundation für ophthalmologische Forschung, die schwedische Eye Foundation, der König Gustav V Foundation, der ARMEC Lindeberg Stiftung und die Stiftung Cronqvist.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
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Zellbiologie Ausgabe 131 Retinal Pigment Epithelzelle humanen embryonalen Stammzellen große Augen Modell geographische Atrophie Suspension subretinalen Transplantationen optische Kohärenztomographie Transvitreal Pars Plana
Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie
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Petrus-Reurer, S., Bartuma, H.,… More

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).

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