Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית

doi: 10.3791/56702 Published: January 22, 2018
* These authors contributed equally

Summary

תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית יכול לשמש כטיפול חלופי תא עבור הטופס מתקדם של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש. פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית והשתלות את subretinal של תאי אפיתל כנגד האדם מתחלקים נגזר תאי הפיגמנט ברשתית לתוך מודל זה של המחלה.

Abstract

אטרופיה גיאוגרפית (ג'י אי), בשלב מאוחר של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש מאופיין על ידי אובדן הפיגמנט ברשתית אפיתל (RPE) השכבה, מה שמוביל ניוון עוקבות של מבנים חיוניים ברשתית (למשל, photoreceptors) גורם ליקוי ראייה חמור. באופן דומה, RPE- ואובדן של ירידה חדות הראייה נתפסת ב מעקב ארוך טווח למעלה של חולים עם מתקדמות הקשורות לגיל ניוון מקולרי רטוב (AMD) טיפול אנטי-כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF) intravitreal. לכן, מצד אחד, זה היסוד להפיק ביעילות תאי RPE ממקור בלתי מוגבל העשויה לשמש כטיפול חלופי. מצד שני, זה חשוב להעריך את התנהגות ושילוב של התאים נגזר במודל של המחלה פרוגרמה כירורגי, שיטות הדמיה כמו קרוב ככל האפשר לאלה חלה אצל בני אדם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט המבוסס על פרסומים קודמים המתארת את הדור של דגם פרה של GA באמצעות העין ארנב לבקן, עבור הערכה של תאי גזע עובריים אדם נגזר בתאי אפיתל הפיגמנט ברשתית (hESC-RPE) ב ההגדרה הרלוונטית קלינית. HESC הבדיל-RPE מושתלים לתוך העיניים תמים או עיניים עם NaIO3-induced GA כמו ניוון הרשתית בטכניקה 25 גרם transvitreal pars plana. הערכה של אזורי מנוונת המושתלים מתבצע על ידי עם מודאלים מרובים ברזולוציה גבוהה הדמיה בזמן אמת לא פולשנית.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול זה מתאר את הדור של דגם פרה עם עיניים גדולות של אטרופיה גיאוגרפית (ג'י אי) המאפשר את ההערכה של אינטגרציה של hESC-RPE המושתלים במרחב subretinal. השתמשו בשיטות המתוארות כאן בפירוט בפרסומים האחרונים 3 הממחישים את הייצור של אוכלוסיה מועשר, טהור, פונקציונלי תאי RPE hESC1, כמו גם היצירה של נזק הרשתית החיצונית הפנוטיפ GA דמוי המושרה על ידי הזרקה subretinal של פתרונות מלח הפיזיולוגיות (קרי, BSS ו- PBS) או NaIO3 הארנב עיניים2,3. אנחנו עוד הוכיח כי ההשעיה תת ברשתית השתלות של hESC-RPE טופס monolayers תפקודית מקיפה עם קולט אור הצלה קיבולת2.

מספר יתרונות מלווים את השימוש של העין ארנב לדור של דגם GA של המחלה. קודם כל, הגודל של העין ארנב, אשר הוא 70% הנפח של עין אנושיים בוגרים, מאפשר השתלת משמעותיים קלינית באמצעות צפיפות התאים כי הוא נמוך בהרבה מאשר בשימוש שגרתי עיניים קטנות מכרסמים (1,000 תאים/µL נ' 50,000 תאים/µL)4 , 5. שנית, ניתוח בחולדות הוא בדרך כלל transscleral דרך דמית, אשר פוגעת המכשול ברשתית, שעשוי להיות מפעיל לתגובה דלקתית, דחייה אפשרית6. שני גורמים ביחד עלול להוביל multilayering הצליעה של התאים המושתלים, ושילוב כללי ירוד של התאים המושתלים ברקמת הרשתית יליד שיבשו. עם זאת, המודל ארנב גדול-עיניים מאפשר ביצוע טכניקה כירורגית עם מכשור זהה להגדרה הקלינית. שלישית, מודל עם עיניים גדולות מאפשרת גם ברזולוציה גבוהה ויוו הדמיה וניטור של התאים המושתלים, הרשתית שמעליה עד זמן1,2,3. לפיכך, אנו מתארים דגם פרה קליניות הרלוונטיים, חסכוניים שאמורים להיות חלופה אטרקטיבית מכרסמים לכל בעל עניין במחקר של הרשתית נורמלי וחולים ובשטח תת ברשתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

להלן כללי התנהגות בעקבות הנחיות טיפול בבעלי חיים קרולינסקה Instituet. כל הניסויים באמצעות ניו זילנד לבקן ארנבים (טבלה של חומרים) אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי חיים אזוריות (ל"ואסה Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (היתר: להחיות 56/15). השימוש hESC (לא להחיות 2011/745-31/3) ואת העברת מניפולציה של hESC-RPE (לא להחיות 2013/813-31/2) הוא גם בהתאם שבדי החקיקה והתקנות Institutet קרולינסקה, אושרה על ידי (ועדת האתיקה של האדם אזוריים Regionala Etikprövningsnämnden אני שטוקהולם).

1. subretinal הזרקת סודיום יודייט (NaIO3) למודל חיות גדולות-עיניים

  1. עזים ומתנגד בעלי חיים על ידי ניהול שרירית בירך בתערובת של קטמין 35 מ"ג/ק"ג ו 5 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים מלוחים באמצעות מזרק 30 גרם, להתרחב תלמידים עם טיפות העיניים אקטואלי, באמצעות שילוב של 0.75% phenylephrine cyclopentolate ו- 2.5%. ההרדמה המתאים הוא אישר אם החיה לא מגיבים קמצוץ קשה של הרגל האחורית שלה.
  2. הצב את הארנב תחת מיקרוסקופ כירורגי עם הראש מול המנתח (איור 1 א'). השתמש מפסק המכסה להסרת קרום העפעפיים, nictitans עם מטלית סטרילי כדי למזער את הסיכון של זיהום. שימוש מאוזן תמיסת מלח (BSS) כדי למנוע יובש תחת הרדמה בשתי העיניים.
  3. למיקרו, להשתמש 2-יציאה (או 3 אופציונלי-port) 25 גרם transvitreal pars plana טכניקה עם trocars שאינם valved עבור החדרת מכשירים השתלה (איור 1B). המכונה vitrectomy רב-תכליתית יש יציאות לחיבור של אינפוזיה בצינורית, endoillumination, vitrector ו endolaser. לזריקות subretinal, רק endoillumination הוא חובה, מה שהופך את מלכודת 2 פורטים מספיקות. להוסיף את endoillumation דרך הנקז השמאלי העליון ומשתמשים את הנקז נכון העליון הצינורית הזרקת subretinal.
    1. תרגיל 3-port, להשתמש את הנקז הזמני נמוך יותר עבור הצינורית אינפוזיה BSS. אם כלי אופציונלי (כגון vitrector) הם בשימוש, הוסף אותם דרך הנקז נכון העליון.
    2. להוסיף את trocars העליון 2, 1-2 מ מ לימבוס בעזרת מלקחיים שנחטף ייזרק תפוס, תחסיר לחמית המכסים את האתר ההכנסה.
    3. ודא trocars הם transsclerally שנוסף בזווית 30-45° לימבוס מקבילים, והמשך לאמצע קצה הנקז. לאחר מכן הפעל את הנקז 90°, להתקדם לתוך העין, מכוון העמוד האחורי של העין. הליך זה למנוע זליגות sclerotomies לאחר ניתוח, גם להקטין את הסיכון של endophthalmitis (קרי, זיהום חיידקי בעיניים). ראה גם איור 2B למשרות הנקז.
    4. לשים עדשות מגע שטוח שימוש אחד על הקרנית להמחיש הרשתית, עם דמעות סינתטיים כמו ג'ל ליצירת קשר בין העין של עדשות מגע (איור 1 א').
    5. צייר µL 500 של NaIO3 לתוך מזרק 1 מ"ל מחובר צינור סיומת (המופעלים על-ידי המסייע) בצינורית polytip של 38 גרם (מופעל על ידי המנתח).
    6. הכנס את המכשיר endoillumination דרך הנקז השמאלי העליון את הצינורית הזרקה דרך הנקז נכון העליון ולקדם את הצינורית דרך החלל בזגוגית לכיוון הרשתית, מכוון האזור מתחת ראש עצב הראייה.
    7. לאפשר את קצה הצינורית לאט לגעת הרשתית עד מסגיר מוחלט מוקד יהיה גלוי. הזריקה עצמה יחדור הרשתית, המאפשר משלוח subretinal. אל תתנו את הצינורית לחדור הרשתית, שכן הדבר עלול לגרום דימום.
    8. מזריקים µL 50 NaIO3 subretinally על פני תקופה s 5. מאז יש מטוס המחשוף טבעי בין הרשתית דמית הבסיסית, bleb שקוף למחצה נראה בבירור יוצרות בהדרגה במהלך ההזרקה.
    9. במהלך ההזרקה לאט. משכי את המחט, אך לוודא שהטיפ נשמר בתוך bleb למזער ריפלוקס.
    10. לאחר הסרת הצינורית endoillumation, הזרקת, להסיר את trocars באמצעות מלקחיים שנחטף ייזרק ולהחיל לחץ קל ב-30 s sclerotomies עצמית איטום התפר-פחות משתמש הקצה או הצד הקהה של המלקחיים.
  4. Post-surgically לתת 10 מ"ל של תמיסת מלח subcutaneously כדי למנוע התייבשות. לא נותנים סטרואידים אקטואלי לאחר ניתוח או אנטיביוטיקה. משככי כאבים לתת 0.5 מ של הבופרנורפין 0.3 מ"ג/מ"ל subcutaneously אחרי הניתוח, כמו גם היום לאחר הניתוח.
  5. לאחר השימוש, לשטוף את כל הכלים במועט אותם לכמה שניות ראשית ב-70% אתנול, שנית ב- 45% אתנול, ואת לבסוף ב מים מזוקקים. יבש אותם כראוי עם מגבת נייר.
  6. להשתתף חיות עד להכרה מספקת למקם אותם כל אחד encaged. אם יש צורך (למשל, למטרות אימונוהיסטוכימיה), המתת חסד בבעלי חיים על ידי ורידיות פנטוברביטל 100 מ"ג/ק"ג (ראה טבלה של חומרים).
  7. לחכות 7 ימים כדי להמשיך השתלת תאי hESC-RPE.

2. subretinal השתלת תאי hESC-RPE אצל מטופלים בעלי חיים

  1. ניהול 2 מ ג (100 µL) של intravitreal triamcinolone בבעלי חיים ומורדמת באמצעות מחט ההזרקה 30 g להוסיף 1-2 מ מ לימבוס ברביע התחתון באונה 1 שבוע לפני השתלת של hESC-RPE ולאחר מחדש לנהל אותו כל 3 חודשים. ודא כי נקודת הקצה לכיוון הקוטב האחורי של העין כדי למנוע מגע עדשה.
  2. תרבות של טפט hESC-RPE כפי שתואר לעיל1.
  3. להסיר תא בידול מדיה (ראה טבלה של חומרים) של טפט hESC confluent 24-ובכן-RPE ולשטוף כל טוב עם µL 500 ל- PBS ללא Ca2 + ו- Mg2 +. חזור על פעולה זו פעם נוספת, עבור סכום כולל של 2 שוטף.
  4. למחוק את תגובת שיקוע, להוסיף 500 µL של טריפסין לכל טוב ולאחר תקופת דגירה של 12 דקות ב 37 º C.
  5. להטות את הצלחת, הסר בזהירות טריפסין (תאים צריכים להישאר מחובר לצלחת). לאסוף תאים µL 800 אמצעי בידול prewarmed טריים-37 מעלות צלזיוס על ידי עדינה pipetting, או אפילו גירוד בעת הצורך, כדי לקבל השעיה תא בודד.
    הערה: השתמש מסננת תא 40 µm אם התא גושים שנצפו.
  6. ספירת תאים בתוך תא hemocytometer באמצעות 0.2% Trypan כחול, על פי הוראות היצרן.
  7. הוסף 5 מ של התמיינות תאים מדיה וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר, 300 גרם x במשך 5 דקות.
  8. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend צנפה ב טרי לעקר מסנן PBS (עברו דרך מסנן מזרק 25 מ מ) כדי ריכוז סופי של תאים 1000/µL.
  9. Aliquot התליה תא הקודם לתוך 600 µL aliquots ולשמור בקירור עד, במהלך הניתוח.
  10. עזים ומתנגד בעלי חיים על ידי ניהול שרירית בירך בתערובת של 35 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 5 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים מלוחים באמצעות מזרק 30 גרם. אני תלמידים עם טיפות העיניים אקטואלי באמצעות amix של 0.75% cyclopentolate ו- 2.5% phenylephrine... ההרדמה המתאים הוא אישר אם החיה לא מגיבים קמצוץ קשה ברגל האחורית שלה.
  11. הצב את הארנב עם הראש מול המנתח. השתמש מפסק המכסה להסרת קרום העפעפיים, nictitans עם מטלית סטרילי כדי למזער את הסיכון של זיהום. השתמש BSS למניעת יובש תחת הרדמה בשתי העיניים.
  12. למיקרו, להשתמש 2-יציאה (או 3 אופציונלי-port) 25 גרם transvitreal pars plana טכניקה עם trocars להציב באותן משרות כפי שמתואר בשלב 1.3 ובאיור 2. אם sclerotomies הקודם גלויים, לבצע הנקז הכניסה רק בסמוך, ולא דרך אלה, כדי למזער את הסיכון של זליגת לאחר הניתוח.
    1. לשים עדשות מגע שטוח שימוש אחד על הקרנית להמחיש הרשתית, עם דמעות סינתטיים כמו הג'ל הקשר בין העין של עדשות מגע (איור 1 א').
    2. לאחר עצה נכונה מיצוב (ראה שלבים 1.3.5 ו 1.3.6), להזריק subretinally µL 50 של השעיה לערבב בעדינות hESC-RPE (50,000 תאים). המטרה של המרכז של אזור3 pretreated NaIO מאופיינת רפלקס אופייני "מתכתי" אנדו-תאורה. הרשתית neurosensory צריך להפריד בקלות ליצור bleb בבירור. סומק שהמחט סטרילית H2O בין ארנבים/לאחר השימוש כדי למנוע המחט סתימת עקב תא קיבוץ. שינוי המחט בעת סתימת הוא הבחין.
    3. במהלך ההזרקה לאט. משכי את המחט אבל לוודא שהטיפ נשמר בתוך bleb למזער ריפלוקס.
    4. לאחר הסרת הצינורית endoillumation, הזרקת, להסיר את trocars באמצעות מלקחיים שנחטף ייזרק ולהחיל לחץ קל ב-30 s sclerotomies עצמית איטום התפר-פחות משתמש הקצה או הצד הקהה של המלקחיים.
  13. Post-surgically לתת 10 מ"ל של תמיסת מלח subcutaneously כדי למנוע התייבשות. לא נותנים סטרואידים אקטואלי לאחר ניתוח או אנטיביוטיקה. משככי כאבים לתת 0.5 מ של הבופרנורפין 0.3 מ"ג/מ"ל subcutaneously אחרי הניתוח, כמו גם היום לאחר הניתוח.
  14. לאחר השימוש, לשטוף את כל הכלים במועט אותם לכמה שניות, ראשית ב-70% אתנול, שנית ב- 45% אתנול, ואת לבסוף ב מים מזוקקים. יבש אותם כראוי עם מגבת נייר.
  15. להשתתף חיות עד להכרה מספקת למקם אותם כל אחד encaged. אם יש צורך (למשל למטרות אימונוהיסטוכימיה), המתת חסד בבעלי חיים על ידי ורידיות פנטוברביטל 100 מ"ג/ק"ג.

3. in Vivo רשתית והדמיה Subretinal

  1. השתמש בהתקן טומוגרפיה (SD-אוקטובר) בתחום ספקטרלי אופטית קוהרנטית עם התוכנה הנלווית (ראה טבלה של חומרים) כדי להשיג את חתך הרוחב b סריקות של מטופלים בעלי החיים, על פי הוראות היצרן. כדי למנוע טשטוש תמונה, הקפד לשמור על לחות הקרנית על ידי שטיפה בתמיסת אקטואלי כל s 30-60.
    1. מקום החיות ומורדמת ומורחבים תלמידו (ראה שלבים 1.1 ו- 2.10) הר מתכווננת להשיג נתיב פתוח של מקור האור כלי ברשתית ארנב.
    2. להשיג לפחות 3 סריקות OCT עם בו זמנית ophthalmoscopy לייזר אינפרא אדום-קונפוקלי סריקה (IR-cSLO) השתקפות הפניה תמונות המייצגות את החלק, מרכזי, העליונים והתחתונים של האזור מוזרק.
    3. להשיג en-פרצוף הפונדוס בתמונות עם cSLO כחול, ירוק, אינפרא אדום ו ססגוניות לייזר השתקפות (קרי, מספר צבעים לייזר בו זמנית), בהתאמה.
    4. לכידת תמונות autofluorescence אור כחול (BAF) באמצעות היכולת לייזר אור כחול של המכשיר SD-אוקטובר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

נציג ויוו תמונות של BAF, IR-cSLO ו- SD-אוקטובר של הרשתית ארנב רגיל לבקן מוצגים באיור2. שימו לב לשכבות הרשתית השונות עם רמות ייחודי של השתקפות אור שנתפסו על ידי המכשיר SD-אוקטובר.

דמויות 1A , איור 1B, מודגם ההתקנה כדי ליצור תת ברשתית מגדלים פורחים: מפסק המכסה ממוקם, העמדת בעפעפיים כדי לאפשר החדרת 3 trocars (איור 1B) 1-2 מ מ רחוק לימבוס, כדי להימנע עדשה לגעת, ואת בזווית 30-45 ˚ לימבוס מקבילים. Trocars יאפשר המבוא של בצינורית אינפוזיה אופציונלי, בנוסף אור, ואת המחט הזרקה דרך sclera. תלמיד מורחבים יחד עם עדשות מגע שטוח יקל תצוגה של הפונדוס את העין ואת הרווח תת ברשתית בזמן הליך כירורגי זה מבוצע.

לאחר הזריקה של 50 µL של 1 מ מ NaIO3 פתרון bleb נוצרת בחלל subretinal זה יהיה לפתור בהדרגה להידרדר הרשתית החיצונית, כפי שמוצג בתמונה SD-אוקטובר ב- 3A איור 3 חודשים לאחר ההזרקה. מעריך את דילול של הרבדים neuroretinal החיצוני ביותר ב SD-OCT ואזורי היפו-BAF, המתאים לירידה RPE ובכך ליצור מחדש הפנוטיפ כמו GA. בעת זיהוי של האזור של נזק, 50,000 hESC-RPE באמצעי אחסון µL 50 הינם מחדש הזריק עבור ההשתלה, יצירת bleb השני הפותר כמוצג את BAF ותמונות צבע רב (MC) איור 3B. מזהה קל עד מתון hyper-BAF אזורים עם מוקד מוגברת hyper-BAF נלסון על הגבול של האזור של נזק, מעידה על מתח כרוני של RPE יליד שמוצג את הסריקות SD-אוקטובר יחד עם העדר של פיגמנט אזורים בתמונה MC. Bleb המתאים ההזרקה של 50 µL של hESC-RPE (50,000 תאים) בעיניים pretreated מראה כתמים של תאי פיגמנט (MC) התמונה ואת המבנים ברשתית שהשתמרה היטב הסריקה SD-אוקטובר מוצג להשוואה (איור 3C).

באופן קולקטיבי, זה הליך ומתודולוגיה לאפשר המחקר של השילוב של הבולם subretinal השתלות של hESC-RPE במודל הרלוונטיים עבור GA.

Figure 1
איור 1: הזרקת להגדיר האם (א) תמונות המתארות את הסידור כירורגי לזריקות תת ברשתית. החיה מושם תחת מיקרוסקופ כירורגי (משמאל) המנתח מחזיקה את המכשיר endoillumination מוכנס דרך הנקז השמאלית ביד שמאל ואת כלי כירורגי intravitreal (כגון הזרקת subretinal בצינורית) מוכנס דרך הנקז שמאל ביד ימין (באמצע). עדשות מגע שטוח על הקרנית מאפשר תצוגה מוגדלת של הפונדוס במהלך הליך כירורגי (מימין). (B) קרוב הצג סכימתי של העין ארנב לבקן עם המדחק המכסה במקום ואת הפטמה מן trocars להוסיף 1-2 מ מ עמוק מ של לימבוס, בזווית של 30-45 מעלות במקביל, יחד עם trocars המאפשרים המבוא של אפשרי נוסף אינפוזיה בצינורית, אור ו המחט להזרקה. עדשות מגע שטוח ממוקם על פסגת התלמיד יעזור כדי לקבל תצפית טובה יותר הפונדוס עין במהלך הליך כירורגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הלבקן נורמלי ארנב רשתית ויוו הדמיה- אין ויוו BAF, IR-cSLO ו- SD-אוקטובר תמונות המייצג הרשתית ארנב רגיל לבקן. מכה. של ה-SD-OCT עם התואם תיוג של שכבות הרשתית נתפסת בתמונה SD-אוקטובר: שזכתה (שכבה תא גנגליון), IPL (השכבה הפנימית plexiform), להיכנס (שכבה הגרעין הפנימי), OPL (השכבה החיצונית plexiform), גרת (השכבה החיצונית הגרעין), OLM (הצד החיצוני הגבלת קרום), EZ (אזור אליפסואיד), OS (מקטעי החיצוני), RPE (אפיתל הפיגמנט ברשתית) ו מוניטור (הממברנה של ברוך). גודל ברים = 1 מ"מ (תמונות BAF ו- IR-cSLO), 200 מיקרומטר (תמונות SD-אוקטובר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: השעיה Subretinal זריקות במודל ארנב גדול-עיניים. (א) BAF MC, SD-אוקטובר תמונות של הזרקת subretinal של 1 מ מ NaIO3 3 חודשים לאחר נזק אינדוקציה. הערה של היפו-BAF מוקף באזורים hyper-BAF התואם את bleb ולא את neuroretina מנוונת ב SD-אוקטובר (B) BAF, MC, ו- SD-אוקטובר תמונות של העיניים pretreated עם 1 מ NaIO3 לשבוע 1 ואחריו השתלת subretinal של 50,000 hESC-RPE ההשעיה, שנותחה 3 חודשים לאחר ההשתלה. שימו לב באזורים hyper-BAF בתמונה BAF, העדר של תאי פיגמנט משולב המטאלקאמפ, את neuroretina מנוונת של תמונות MC SD-אוקטובר (ג) ו- SD-אוקטובר התואם לעיניים תמים שאינו pretreated 3 חודשים לאחר ההשתלה subretinal של hESC-RPE ההשעיה. הערה את אזורי פיגמנט על התמונה MC ואת המבנה השתמר neuroretinal על SD-אוקטובר SD-OCT לסרוק מטוסים מסומנים (חץ ירוק). ראשי חץ לבן סימון הגבול של מגדלים פורחים en-פנים, תמונות SD-אוקטובר. גודל ברים = 1 מ"מ (תמונות BAF ו- MC), 200 מיקרומטר (תמונות SD-אוקטובר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ב פרוטוקול זה, מתואר הדור של מודל גדול-עיניים של GA ושימוש בו פרה להערכת hESC-RPE אינטגרציה ויוו .

לתרגום של טיפולים משובי עבור GA ומחלות קשורות לתוך המרפאה7, חשוב לפתח, לייעל שיטות בנאמנות ללכוד שיטות קליניות השתלת והדמיה. הארנב הוא בהיבט הזה אטרקטיבי: יש לו עין גדולה יחסית המאפשר ניתוח תוך עיני ושימוש הדמיה רגיל, בקלות שוכנו וזול לעומת חיות גדולות-עיניים אחרות.

אנו מתארים את השימוש transvitreal תקן 25-מד pars plana vitrectomy טכניקה להקמת מגדלים פורחים תת ברשתית או לגרום נזק תת ברשתית או להשתיל hESC-RPE. בתחילה, השתמשנו מלכודת 3-port, כמופיע ב איור 1B, מתוך כוונה באמצעות יציאת אינפוזיה (הנקז), במקרה vitrectomy בוצעה במהלך ההליך. עם זאת, מאז לא מצאנו vitrectomy שזה הכרחי להחלת זריקות תת ברשתית, הנמל אינפוזיה הושמט. ובכל זאת, האפשרות השלישית של יציאת צריכים להישאר אם ההליך עוד יותר מותאמת ומתבצעת vitrectomy.

הארנב הגדול-עיניים הוא מודל עינית ומבוססת עם נתונים שהצטברו על אנטומיה ופיזיולוגיה האחרונות מאות8. יתר על כן, ארנבים קל ידית גזע, מושכת מבחינה כלכלית (למשל, רכישה, דיור, ושמירה) הינם זמינים לעומת דגמים יונקים גדולים-עיניים אחרים. היתרון העיקרי של עיניים-דגם גדול הוא שהם מאפשרים שימוש ברזולוציה גבוהה טכניקות הדמיה קלינית, אשר בתורו לאפשר מעקב של התאים המושתלים hESC-RPE בחלל subretinal לאורך זמן. עם זאת, למרות היונקים להיות phylogenetically קרוב יותר בני אדם מאשר מכרסמים, זה יש לציין שיש ברשותם הרשתית merangiotic ואת רצף חזותי, לעומת הרשתית holangiotic ו- fovea נוכח פרימטים9. כלומר רשתית Merangiotic אספקת רוב הדם של הרשתית הפנימי נגזרת של choriocapillaris, הבדל אחד צריך לשקול מאז זה יכול להגביר את הסיכון של הנגע, דימום. אחד היתרונות ניסיוני הוא שהוא מאפשר מידול בשלבים מוקדמים של GA בעקבות מגדלים פורחים subretinal הפתרונות הפיזיולוגיות לבד, כפי שהיה בעבר והפגינו1,3. מחקרים אלה הציע כי bleb subretinal גורם זמני היפוקסיה ברשתית חצרו merangiotic עשוי להיות מספיק כדי לגרום למוות קולט אור; עם זאת, בהקשר זה, הוכח אובדן RPE סביר להיות שנוצר על ידי הזרם תת רשתית הנגרמת באמצעות מזרק 1 מ"ל של אמצעי אחסון bleb 50 µL, תופעה אקראית בתורו potentiates ניוון עצבי-רשתית. לכן, האחסון bleb יכולה להיות השפעה ישירה על הרשתית מתיחה הנזק שנגרם, כלומר גדול יותר אמצעי האחסון בשימוש (לדוגמה, µL 100, כאשר נעשה שימוש ב- מחקרים10), מזיקה יותר זה יכול להיות.

שלב קריטי כדי להבטיח שילוב של התאים מוזרק היא למנוע ריפלוקס של תאים לתוך הזגוגיות תוך הזרקת את מיקום המחט במרחב subretinal. אם ממוקם עמוק מדי, להיות שחדר החיצוני ברשתית המכשול/דמית, תאים חיסוניים עלול לפלוש המרחב התת ברשתית, גורם דחיית החיסון למרות השימוש של החיסוני. היבט חשוב נוסף להצלחה השתלת היא מדינת הזגוגיות. במודל הנוכחי, vitrectomy אינה מבוצעת על מנת לצמצם ריפלוקס וטראומה כירורגי. עם זאת, כבר הבחין כי בעיניים קצת קשה לקבל משרה עצה נכונה על הרשתית כמו הטיפ נתקע את לאטמוספרה בזגוגית מראש ברשתית שמוביל להיווצרות קטן או אפילו לא מגדלים פורחים. למרות שזה אירוע נדיר יחסית, אותו מציינים כי השתנות של הארנב בזגוגית צריך לקחת בחשבון במהלך ניתוח וניתוח לאחר ניתוח.

בנוסף, הזרקה נכונה של triamcinolon הוא חיוני כדי למנוע פגיעה ביעילות את הפונדוס על ידי גבישים לבנים סטרואידים, אשר לאחר מכן ה"בלתי כירורגיה והדמיה הפונדוס לאחר ניתוח מאת SD-אוקטובר. כדי למזער את הבעיה, ההזרקה של triamcinolon צריך להיעשות ברביע התחתון טמפורלית. באופן דומה, trocars צריך להיות ממוקם 1-2 מ מ לימבוס כדי למנוע דימום בזגוגית מן העדשה ארנב גדול unproportionally לגוף ריסי ונוגע עם המחט. עדשות מגע יגרום קטרקט הפוגעים בתורו להדמיה נכונה של החלל התת ברשתית במהלך דימות לאחר הניתוח.

סטרואידים, כולל triamcinolone, עצמם עלולים לגרום קטרקט לאורך זמן. לא הבחנו זה בעקבות ניהול triamcinolone עד 8 חודשים. עם זאת, סביר כי סטרואידים-induced קטרקט יפתחו אם מנהל triamcinolone על פני תקופות זמן רב.

השיטות שתואר יכול לשמש עבור תרגולי והן לצורך ניתוח של התא-שילוב ותפקוד כפי שמתואר כאן, בפרסומים קודמים שלנו. השיטה יש גם רלוונטיות גבוהה עבור ניהול של וקטורים ויראלי תת ברשתית עכשיו ניסוי קליני עבור מספר dystrophies רשתית תורשתיות. שינויים עתידיים עשויים לכלול השתלת מחומרים מורכבים יותר, כגון גיליון ספקיות שירות ו- biogels. כמו שיטות הדמיה קליניים חדשים מופיעים, הם יהיו מותאם בקלות לעין ארנב, אולי בלי שינויים.

. In conclusion, דגם ארנב גדול-עיניים הוכח להיות דוגמנית קליניים רלוונטי כי יש מספר יתרונות בהשוואה למודלים מכרסמים i) recapitulating בשלבים שונים של GA, ii) החלת ניתוח החולה רלוונטיות ושיטות הדמיה, ו- iii ) הערכת אינטגרציה של התורם תאים כדי לשמש כטיפול חלופי תא עבור GA והפרעות הקשורות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אף אחד מחברי יש אינטרסים מתחרים או האינטרסים המתנגשים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים ממכון קרולינסקה הרישמי של Margareta נסיכת הכתר לקויי ראייה, הקרן ירדן אדווין מחקר Ophthalmological, קרן עין שוודית, קרן המלך גוסטב החמישי, את ARMEC Lindeberg קרן, קרן cronqvist ב.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb Biological Industries 06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 12563-011
PBS without Ca2+ and Mg2+ Gibco, ThermoFisher Scientific Corp 14190-094
Cell strainer 40 μm Nylon VWR 732-2757
Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm BD Microlance 304827
Acrodisc 25 mm Syringe Filter Acrodisc PN4612
0.4% trypan blue ThermoFisher Scientific Corp 15250061 Use at 0.2%
NaIO3 Sigma-Aldrich Corp S4007
BSS Alcon Nordic A/S 65079550
70% Ethanol Solveco AB 1047
Ketaminol, 100 mg/mL Intervet, Boxmeer 511519 Use 35 mg/kg ketamine
Rompun vet, 20 mg/mL Bayer Animal Health 22545 Use 5 mg/kg xylazine
Triescence, 40 mg/mL Alcon Nordic A/S 412915 2 mg intraviterial
Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% APL 321968 Use 1 drop in each eye
Viscotears Laboratoires Théa 597562
Topical saline Apotea AB 7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL Omnidea 77168 Use 100 mg/mL pentobarbital
Extension tube (Hammer) MedOne Surgical Inc 3223
25 G/38 G polytip subretinal cannula MedOne Surgical Inc 3219 25 G/38 G
Single Use Flat Lens Volk #VWFD10
Barraquer Colibri lid retractor AgnTho's AB 42-020-030
Non-valved trocars Alcon Nordic A/S 8065751448
Clawed forceps Bausch & Lomb Nordic AB ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine Alcon Nordic A/S 8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak Alcon Nordic A/S 8065751493
SD-OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA+OCT Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0
24 well plates Sarstedt 83.3922
Neubauer hemocytometer VWR 631-0925
New Zealand albino rabbits Lidköpings Rabbit Farm, Sweden
hESC-RPE cells See reference number 1
Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml Dechra 660500 Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6, (1), 9-17 (2016).
  2. Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (4), 2423-2430 (2015).
  3. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58, (2), 1314-1322 (2017).
  4. Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (8), 5431-5444 (2014).
  5. Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8, (3), 189-199 (2006).
  6. Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214, (2), 347-361 (2008).
  7. Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, (9817), 713-720 (2012).
  8. Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12, (1), 123-138 (1972).
  9. Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, (6), 2913-2920 (2012).
  10. Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130, (1), 65-75 (2012).
השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).More

Petrus-Reurer, S., Bartuma, H., Aronsson, M., Westman, S., Lanner, F., Kvanta, A. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. J. Vis. Exp. (131), e56702, doi:10.3791/56702 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter