Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

En Microcontroller drives enhed for Generation af flydende ekstrakter fra konventionelle cigaret røg og elektronisk cigaret Aerosol

doi: 10.3791/56709 Published: January 18, 2018

Summary

Her, beskriver vi en programmerbar laboratorium enhed, der kan bruges til at oprette ekstrakter af konventionelle cigaret røg og elektronisk cigaret aerosol. Denne metode giver et nyttigt værktøj til at foretage direkte sammenligninger mellem konventionelle cigaretter og elektronisk cigaretter, og er en tilgængelig indgang til elektronisk cigaret forskning.

Abstract

Elektroniske cigaretter er det mest populære tobak produkt blandt midten og høj skoleelever og er den mest populære alternative tobaksvare blandt voksne. Høj kvalitet, reproducerbare forskning i følgerne af elektroniske cigaret brug er afgørende for forståelse emerging hensynet til folkesundheden og crafting beviser baseret lovgivningspolitik. Mens et stigende antal papirer diskutere elektroniske cigaretter, er der lidt sammenhæng i metoder på tværs af grupper og meget lidt konsensus om resultaterne. Her, beskriver vi en programmerbar laboratorium enhed, der kan bruges til at oprette ekstrakter af konventionelle cigaret røg og elektronisk cigaret aerosol. Denne protokol detaljer instruktioner til forsamling og drift af nævnte enhed og demonstrerer brugen af den genererede ekstrakt i to prøve applikationer: en in vitro- celle levedygtighed assay og gaskromatografi massespektrometri. Denne metode giver et værktøj til at foretage direkte sammenligninger mellem konventionelle cigaretter og elektronisk cigaretter, og er en tilgængelig indgang til elektronisk cigaret forskning.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trods en koncentreret indsats af sundhedsorganisationer forbliver brug af tobak produkt den førende årsag til forebyggelige dødsfald på verdensplan, med fleste af disse dødsfald tilskrives cigaret rygning1. Siden ind på markedet i 2003, har elektroniske cigaretter været stigende i popularitet blandt tobak produkt brugere. Elektroniske cigaretter er i øjeblikket den mest populære alternativ til konventionelle cigaretter blandt amerikanske voksne (~ 5%)2 og den mest populære nikotin delivery system blandt midten (~ 5,3%) og høj skoleelever (~ 16%)3. Hvis den nuværende udvikling fortsætter, kan elektroniske cigaretter forventes at erstatte konventionelle cigaretter for fremtidige generationer. Men de sundhedsmæssige konsekvenser af elektronisk cigaret brug stadig uklart.

Forskning i elektroniske cigaretter startede ikke for alvor, indtil elektronisk cigaret popularitet hurtigt steg i 20133,4. Siden dengang, har været ansat et antal forskellige modeller til at behandle spørgsmålet om deres toksicitet. Men resultaterne af mange undersøgelser er modstridende, og mens elektroniske cigaretter er generelt mindre giftige end konventionelle cigaretter er der tilsyneladende ingen nuværende konsensus om de sundhedsmæssige konsekvenser af elektronisk cigaret bruger5, 6 , 7. vores tidligere forskning viser, at elektroniske cigaretter er betydeligt mindre giftige for den vaskulære endotel end konventionelle cigaretter, trods deres evne til at forårsage DNA-skader og induktion af oxidativt stress og celle død8 . Men mere forskning er nødvendig før vi kan drage faste konklusioner om de sundhedsmæssige konsekvenser af elektronisk cigaret brug.

Som konventionelle cigaretter er en førende årsag til forebyggelige karsygdom9, der er en voksende interesse for vaskulær sundhedsrisikoen for elektroniske cigaret bruge10,11,12. For at studere virkningerne af elektroniske cigaretter på det vaskulære system, udviklet vores lab en microcontroller drives rygning/vaping enhed (figur 1)8. Denne enhed er i stand til at generere Flydende ekstrakter af enten konventionel cigaret røg eller elektronisk cigaret aerosol i enten vandige eller organiske opløsningsmidler. Som airflow styres af kombinationen af en justerbar air flow regulator og en PBASIC timing program, kan enheden bruges til at generere uddrag efter et vilkårligt antal brugerdefinerede protokoller. Her vi detalje forsamling og drift af denne enhed samt to potentielle anvendelser: i vitro celle levedygtighed vurdering og gaskromatografi massespektrometri.

Figure 1
Figur 1: rygning/Vaping enhed. Skematisk til fysisk samling af rygning/vaping enheden i både cigaret/cigaret som elektroniske cigaretter (e-cig) konfiguration (A) og tank elektroniske cigaret konfiguration (B). Komponent nøgle: 1) indånding port; 2) primære samling impinger; 3) overløb impinger; 4) Buchner kolbe vakuum fælde; 5) normalt åbne magnetventil; 6) BS1 microcontroller; 7) air flow regulator; 8) 510 gevind elektronisk cigaret tank base. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. montering af enheden

  1. Sikre en 100 mL Buchner kolbe (figur 1, #4) til en stålring stå og skabe et vakuum fælde ved at udfylde det med 50 g af calcium chlorid kan fungere som et tørremiddel. Forsegle kolben med en gummiprop gennem hullet, wrap prop krydset med paraffin film, og køre en pipette gennem hullet.
  2. Brug vinyl slangen, Tilslut pipette strækker sig fra proppen til et t-kryds slange stik.
  3. Brug vinyl slangen, forbinde de to impinger (figur 1, #2 og #3) til hinanden og Forbind udgangen af den anden impinger at t-krydset slange stik.
  4. Brug vinyl slangen, Tilslut den inddata havneby af den første impinger at tjene som en indånding port (figur 1, #1).
  5. Ved hjælp af vinyl slangen, forbinde side arm Buchner kolbens input-Port en luftstrøm regulator (figur 1, #7) og exit port af luftstrømmen regulator til en vakuumpumpe.
  6. Samle kredsløb ifølge skematisk i figur 2A.
  7. Uploade PBASIC program SVL.bs1 (figur 2B, også tilgængelig på https://github.com/ChastainAnderson/SVL) til BS1 microcontroller (figur 1, #6) med en seriel adapter og producentens software.
  8. Sted 510 gevind base (figur 1 #8) i en ring stå klemme.
  9. Brug vinyl slangen, Tilslut magnetventil (figur 1, #5) til den frie ende af t-krydset slange stik.
    Bemærk: Enheden skal være komplet og klar til drift, kontrollere alle leddene for at sikre, at de er air tight og anvender spændebånd og vakuum fedt efter behov.

Figure 2
Figur 2: elektrisk skematisk og PBASIC kode. Figur 2A viser den elektriske skematiske til samling af det elektriske kredsløb nødvendigt at aktivere begge de normalt åbne magnetventil og varmespiral af knappen aktiveret elektroniske cigaretter (gennem 510 gevind elektronisk cigaret tank base). De elektriske parametre af varmespiral (P: magt; R: modstand; og I: nuværende) forventes og empirisk bør kontrolleres med et multimeter post forsamling. Figur 2B viser PBASIC timing program nødvendige for at kontrollere kredsløbet i figur 2A (findes også på https://github.com/ChastainAnderson/SVL). Timing konstanter SVT & IPT (#5 & #6) er i enheder af ms og er indstillet til at give en aktivisering gang på 2 sekunder og en nedetid af 28 s. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

2. prøve opbevaring og forberedelse

  1. Gemme alle uåbnede konventionelle og elektronisk cigaret prøver i mørke i lufttætte plastposer ved stuetemperatur.
  2. Når åbnet, opbevare prøver i lufttætte plastposer på 4 ºC, med et stykke køkkenrulle til at absorbere overskydende fugt.
  3. Pre reagensglasset alle prøver i en stuetemperatur humidor på ~ 60% fugtighed i mindst 30 minutter før anvendelsen.

3. generel drift af cigaret røg/elektroniske cigaret Aerosol udvinding enhed

  1. Bestemme massen af hver e-cigaret cartomizer/tank pre-vaping ved hjælp af en Analysevægt. Forskellen i pre/post post vaping vægt vil blive brugt til at fastlægge passende dosering.
    Bemærk: 3R4F reference cigaretter antages for at indeholde 0,7 mg nikotin og nikotinindhold af kommercielle cigaretmærker kan bestemmes ved konventionelle analysemetoder13.
  2. Eksempelprogrammet 1, fylde reservoir af den primære impinger med 4,3 mL i endothelial cellekulturmedium. Eksempelprogrammet 2, fylde beholderen med 5 mL acetone.
  3. Prep elektronisk cigaret eller konventionelle cigaret for udvinding:
    1. Hvis bruger en konventionel cigaret, anvende et stykke klart tape rundt om filteret og sætte et klart synligt mærke hvor cigaretpapir slutter sig til filteret.
    2. Hvis du bruger en cigaret som e-cigaret, Sørg for at batteriet er godt opladet og cartomizeren skruet stramt til batteriet.
    3. Hvis bruger en elektronisk cigaret tank, Sørg for, at en passende mængde af elektroniske cigaret flydende er indlæst i tanken og skrue tank på 510 gevind soklen.
  4. Indsæt spidsen af den konventionelle eller elektronisk cigaret i havnens indånding (figur 1, #1) og fastgør med en spændebånd.
  5. Tænd vakuumpumpen.
  6. Justere flowmåler til at trække 1,65 L/minut for at sikre en 55 mL puff mere end 2 sekunder.
  7. Drej på mikrokontroller. Hvis bruger en konventionel cigaret, lys cigaretter på det første pust.
  8. Kør indtil projiceret ønskede koncentration (i dele per million eller % vægt/volumen) er opnået.
  9. Bestemme massen af hver e-cigaret cartomizer/tank efter fordampning ved hjælp af en Analysevægt. Sammenligne denne måling til måling tages i trin 3.1 til at bestemme den samlede masse forbruges. Beregne koncentrationen af den forbrugte masse/volumen af opløsningsmiddel. Brug den molære koncentration af forbrugt nikotin til at normalisere mellem produkter.
    1. Hvis en utilstrækkelig masse blev indtaget, returnere den elektroniske cigaret til enheden og forbruge yderligere.
    2. Hvis en tilstrækkelig eller overskydende masse blev indtaget, fortsætte.

4. filtrering og opbevaring

  1. Hvis ekstraktet er skal bruges til cellekultur, filtreres gennem et 0,22 µm PES sprøjte filter.
  2. Bruge ekstrakter straks eller gemme på-80 ºC. Som led i forberedelsen af Anderson, et al. 8, elektronisk cigaret aerosol blev vist sig for at være stabil i mindst to uger, og stabiliteten af cigaretrøg i op til to år er blevet etableret af svindlere, et al. 13.

5. rengøring enheden

  1. Efter hver udvinding, skyl slangen og reservoirer for enheden med 70% ethanol og deioniseret vand for at undgå bære over mellem prøver.
  2. Efter skylning, kort køre tomme enheden til at tillade luftstrøm til tørring af linjerne.

6. eksempelprogrammet 1: Neutral rød optagelse celle levedygtighed Assay

  1. Udføre ekstrakt som ovenfor i 4,3 mL i endothelial celle vækstmediet.
  2. En dag tidligere, seed menneskelige umbilical vene endotelceller i 96 godt plader med en tæthed på 1 x 104 celler/wellin 100 µL i endothelial celle vækstmediet.
  3. Behandle cellerne ved at erstatte den gamle endotel cellekulturmedium med enten 100 µL af frisk endotel cellekulturmedium til at tjene som en kontrol eller 75 µL i endothelial celle vækstmediet blandet med 25 µL af en 2 mM forbrugt nikotin koncentration ekstrakt (1,4 mg forbrugt nikotin i 4,3 mL endotel celle vækstmedium) til en slutkoncentration på 500 µM til at tjene som behandling.
  4. Som mange af komponenterne i både cigaret røg og elektronisk cigaret aerosol er flygtige, bruge en folie sæl for at holde brøndene lufttæt.
  5. Inkuber plade 18 – 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
  6. Forberede neutral red farvning løsning:
    1. Oprette en 100 x neutral rød stamopløsning ved at opløse 33 mg af neutrale røde farvestof i 10 mL af bufferopløsning salt.
    2. Kort før brug, fortyndes 100 x stamopløsning 1: 100 i cellekulturmedium oprette 1 x neutral red farvning løsning.
    3. Inkuber neutral red farvning løsning ved 37 ° C i mindst 30 min før brug og brug straks.
      Bemærk: Det er normalt for nogle krystaller at udfælde under inkubation. Pleje bør tages til at undgå at anvende disse krystaller celle kultur brønde. Hvis det er nødvendigt, kan en.22 µm filter bruges til at filtrere neutral rød lager og farvning løsninger.
  7. Fjern ekstrakt og tilsæt 100 µL neutral red farvning løsning pr. godt, brug overskud at skabe mindst tre blanke brønde for ordentlig kvantificering.
  8. Inkuber plade på 2-4 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
  9. Fjerne neutral red farvning løsning og vask 3 x ved neddykning i PBS.
  10. Anvende neutral red de plette løsning (50% deioniseret vand, 49% ethanol, 1% eddikesyre).
  11. Inkuber mindst 10 min. ved stuetemperatur under omrystning.
  12. Læse absorbans ved 540 nm.
  13. Analysere data ved at trække ud den gennemsnitlige værdi af de blanke brønde normalisere til gennemsnittet af værdien justeret blindkontroller godt.

7. eksempelprogrammet 2: gaskromatografi-massespektrometri

  1. Udføre udvinding som ovenfor i 5 mL af acetone.
  2. Køre enheden for at opnå en endelig koncentration på ~ 100 dele per million (vægten af e-væske forbruges/volumen af acetone) af din prøve.
  3. Bruger en præcision glas sprøjte, injiceres 1 µL i injektoren af GC-MS udstyr. Indsprøjtes ved 250 ° C med en 1:20 delt forholdet i et koblet gaskromatograf/Quadrupol spektrometer udstyret med en ZB-5 kolonne med følgende ovn protokol: 1 min på 50 ° C; rampe 10 ° C/min. til 140 ° C; rampe 20 ° C/min. til 300 ° C og holde i 10 min.
  4. Matche fremkomne massespektre at indskyde bibliotek til at identificere aerosol komponenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Senest 24 timer efter eksponering af menneskelige umbilical vene endotelceller til enten konventionel cigaretrøg ekstrakt (CSE) eller elektronisk cigaret aerosol ekstrakt (EAE), der er en betydelig (kontrol vs. CSE P < 0,001; kontrol vs. EAE Pedersen < 0,01; n = 6) reduktion i cellernes levedygtighed (figur 3A). Uddrag blev genereret med en stønnen profil af 2, 2 sekunder, 55 mL puffs pr minut og normaliserede baseret på molære koncentration af nikotin forbrugt af enheden. Udsættelse for 500 µM forbrugt nikotin ækvivalenter af CSE reducerer dramatisk levedygtige celler til 11.06 ± 0,28% af kontrol, og eksponering for 500 µM forbrugt nikotin ækvivalenter af EAE reducerer levedygtige celler til 86.65 ± 4,60% af kontrol.

Figur 3B demonstrerer volatilitet baseret adskillelse af elektroniske cigaret komponenter fra en kommerciel elektronisk cigaret ved gaskromatografi. Komponenterne blev derefter identificeret via Quadrupol massespektrometri. Identificeret komponenter, i rækkefølge efter volatilitet, omfatter: propylenglycol, acetyl propionyl, chlorobutanol, glycerol, nikotin, og 3-nitropthalic syre. Af disse kun propylenglycol, glycerol og nikotin blev oplyst på produktets etiket1.

Figure 3
Figur 3: prøve applikationer: celle levedygtighed og GC-MS. Figur 3A viser resultaterne af en neutral rød optagelse analysen udføres på menneskelige umbilical vene endotelceller udsat for 500 µM forbrugt nikotin ækvivalenter af enten konventionel cigaretrøg fra en 3R4F forskning reference cigaret (CSE) eller elektronisk cigaret aerosol fra en kommercielt tilgængelig elektronisk cigaret (EAE). Barer er betyde +/-standardafvigelse. Betydning bestemmes af to tailed, uparrede, t-test- og resultaterne er angivet med en Asterisk: ** P < 0,01; P < 0,001; n = 6. Figur 3B viser resultaterne af en gaskromatograf af elektroniske cigaret aerosol oploeses i acetone. Toppe repræsenterer enkelte forbindelser sorteret efter retentionstiden (volatiliteten) og blev identificeret af Quadrupol massespektrometri. 1) propylenglycol; 2) acetyl propionyl; 3) chlorobutanol; 4) glycerol; 5) nikotin; 6) 3-nitropthalic syre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De mest kritiske elementer i denne protokol er at sikre, at enheden er rene i starten og slut af hvert udvinding, og at sikre, at alle sæler bevares så at luft flow forbliver konsistent. Hvis enheden ikke er ordentligt rengjort, er der en risiko for bære mellem prøver. Desuden, hvis enheden er venstre urene i en længere periode af tid kondenseret aerosol og tørret kan opløsningsmiddel blokere systemet. Bemærk at det er normalt for der for at være et trykfald ved puffing en konventionel cigaret og luftstrømmen meter bør være justeret for at give den ønskede luftstrøm under puff, ikke mens enheden trækker rumluft. Et centralt element i denne metode er muligheden for at være tilpasset til at holde med udvikling af elektroniske cigaret teknologi. For eksempel, kræver mange elektroniske cigaretter knap presse aktivering af varmespiral. Indeværende indretning indlemmer direkte varmespiral i styringskredsløbet (figur 2A) efterligne en knaptryk bruger programmeret mellemrum. De primære begrænsninger af denne metode skyldes manglen på godt karakteriseret standardprocedurer for elektroniske cigaret brug. Mens vi kan bruge en forskning reference cigaret14 og internationale protokoller15,16 for konventionelle cigaretter, vi tilpasning blot af metoderne til elektroniske cigaretter og kan ikke garantere at det passende modeller elektroniske cigaret brugeradfærd. Derudover producerer denne protokol ekstrakt i en lage. Mens dette er hensigtsmæssigt kan for visse celletyper såsom endotelceller, andre celletyper såsom luftveje celler, bedre studeres gennem direkte eksponering for elektroniske cigaret aerosol.

Arten af denne enhed tillader det at blive opdateret som nye standardforskrifter, som er udviklet. Flere punkter om ændring af præsentere sig selv, der kan gøre det muligt for enheden at være skræddersyet til specifikke spørgsmål. Nyere elektroniske cigaretter omfatte en højere række watt end tidligere modeller af elektroniske cigaretter17. I den skematiske præsenteret i figur 2A, kunne begge modstanden støder op til varmespiral og varmespiral, sig byttes for komponenter med forskellige modstand værdier (eller endda variabel modstand) til at modulere den endelige elforbruget til aerosolize elektronisk cigaret flydende. Endelige teoretiske magt i forstøver kan beregnes med konventionelle magt ligninger:

Equation 1ellerEquation 2
hvor P: magt; V: spænding; R: modstand; og I: strøm.

Så der er ingen bredt accepterede internationale standard operating procedure til elektronisk cigaret brug, og forskellige grupper kan ønske at ansætte forskellige parametre og stønnende profiler. En fælles elektronisk cigaret standard er CORESTA CRM8118, selv om nogle grupper fortsat at anvende modificerede versioner af konventionelle cigaret rygning protokoller såsom ISO 3088:201215 og der TobLabNet SOP 116. Derudover fortsætte mange laboratorier med at bruge laboratorium og/eller institutionen specifikke regimer. I dette tilfælde ansat vi en firkantet bølge puff profil består af 2, 2 sekunder, 55 mL puffs pr minut. men den modulære, programmerbare karakter af enheden tillader det tilpasses til andre stønnende profiler efter behov. Puff lydstyrke kan ændres direkte ved at justere air flowmeter. Puff tid og opvarmning spole aktivering tid kan ændres ved at ændre konstanterne SVT og IPT i programmet SVL.bs1 (figur 2B, #5 & #6). Hvis man ønsker at de-synkronisere stønnende tiden og aktivering tid, kunne dette gøres ved at opdele SVT og IPT konstanterne, fx SVT1 repræsenterer tiden mellem aktivering af varmekredsen og ventil kredsløb, SVT2 der repræsenterer tiden mellem aktivering af ventil kredsløb og inaktivering af varmekredsen og SVT3 repræsenterer tiden mellem inaktivering af varmekredsen og inaktivering af ventil kredsløb, og ligeledes for IPT. Mens den 510 gevind base er almindelig i mange tank elektroniske cigaretter, er det ikke universel. En anderledes gevind base kan erstattes, hvis brugeren kræver. Hvis en firkantet bølge profil ikke ønskes, udskifte enten air flowmeter eller magnetventil med en kontinuerlig programmerbar komponent til at omforme den bølge profil.

Som elektronisk cigaret forskning skrider frem, udbuddet og tilgængeligheden af elektroniske cigaret forbliver rygning enheder en hurdle. Cigaret rygning maskiner har været en integreret del af tobak Produktforskning så tidligt som 1843 og i dag er der en bred vifte af kommercielt tilgængelige rygning maskiner til konventionelle cigaretter19,20. Der er flere etableret standardprocedurer for konventionelle cigaret rygning21. Men mange konventionelle cigaret rygning enheder viste sig ikke i stand til præcist rygning elektronisk cigaretter på grund af design forskelle mellem traditionelle og elektroniske cigaretter og forskelle inden for elektroniske cigaretmærker og modeller, såsom: diameter, PSI krav og behovet for sensor eller knappen baseret aktivering17. I øjeblikket er der en heterogene kommercielle område af elektronisk cigaret rygning maskiner, der omfatter enheder, herunder enheder beregnet til direkte aerosol udvinding samt luft flydende interface eksponering (f.eks. Borgwalt22 og Vitrocell 22,23). På trods af tilgængeligheden af kommercielle muligheder fortsætte mange grupper, med at bruge enheder fremstillet inden for deres eget laboratorium for aerosol udvinding 10,11,12,24, 25 , 26. motivationer for dette er varierede. I nogle tilfælde søger forskere at bedre model menneskelig adfærd10. Andre forsøger at bevare kontinuiteten med tidligere offentliggjorte undersøgelser af cigaretrøg12. Stadig cite andre direkte utilgængelighed af kommercielle alternativer som en motivation for i laboratoriet fabrikation24. Disse enheder tage mange former, og i mange tilfælde bruger laboratorium særlige protokoller. Desværre, mekanismer, effekten og mulighederne i disse enheder og protokoller er ofte under-rapporteret.

Først af de to eksempelprogrammer præsenteret ovenfor (figur 3A) viser virkningerne af konventionelle cigaret røg og elektronisk cigaret aerosol på endotel cellernes levedygtighed. Som traditionelle cigaretrøg har vist sig for at forårsage endotel celle død og dysfunktion9, det er rimeligt, for at hypotesen, at elektroniske cigaret aerosol ville have en lignende effekt. For at teste dette, udsættes vi menneskers umbilical vene endotelceller nikotin tilsvarende niveauer af enten konventionel cigaretrøg ekstrakt eller elektronisk cigaret aerosol uddrag i 24 timer. Mens både konventionelle cigaret røg og elektronisk cigaret aerosol forårsage statistisk signifikante reduktioner i cellernes levedygtighed, elektronisk cigaret aerosol induceret reduktion effekt størrelse er ~ 13%, mens nedsættelse efter konventionelle cigaretrøg eksponering nærmer sig 90%. Mens dette støtter tanken om, at elektroniske cigaretter er mindre skadelige for det vaskulære system end traditionelle cigaretter, er de stadig ikke sikker. Andet af de to eksempelprogrammer præsenteret ovenfor (figur 3B) viser, at elektronisk cigaret aerosol ekstraheres i organisk opløsningsmiddel kan adskilles i sine bestanddele og analyseret via massespektrometri. Oversigten over komponenter genereret indeholder oplysninger om nøjagtigheden af mærkning i elektronisk cigaretprodukter, og fremhæver visse potentielt skadelige komponenter såsom acetyl propionyl (2,3-pentanedione)27. Mens de komponenter, der er identificeret i dette eksperiment ikke var kvantificeres, kan kvantificering udføres ved hjælp af konventionelle analytiske teknikker som de præsenteres i CORESTA CRM8428.

Her har vi præsenteret en programmerbar laboratorium enhed i stand til at generere flydende ekstrakt fra konventionelle cigaret røg eller elektronisk cigaret aerosol. Denne enhed kan rumme en bred vifte af produkt design (som de førende kommercielle mærker af elektroniske cigaret) og udpakningen kan tilpasses til brugeren specifikationer. I dette specifikke tilfælde, har vi vist brug af genererede ekstrakt i en endotel celle levedygtighed analyse; ekstrakterne genereret af denne enhed kunne dog anvendes til enhver type af enkelt celle befolkning samt fælles kultur, eksplantat eller andre in vitro- model. Disse ekstrakter er kompatibel med en lang række hyppigt anvendte biologiske assays herunder reaktive ilt arter påvisning, celle spredning assays og konventionelle immuno-farvning. Desuden er evnen til at nedbryde sammensætningen af elektroniske cigaret ekstrakt via gaskromatografi massespektrometri et udgangspunkt for grundige undersøgelser af enkelte aerosol komponenter. Samlet set giver denne enhed et tilgængeligt adgangspunkt til elektronisk cigaret forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tobak produkt regulerende Science Research Fellowship program administreres af Tulane University er finansieret af Altria Client Services Regulatory Affairs.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender assistance fra Dr. Robert Dotson Tulane University afdeling for celle og molekylærbiologi for hans hjælp i redigering håndskriftet og Dr. James Bollinger af Tulane Universitet Institut for kemi for sin assistance med massespektrometri protokol design. Forfatterne yderligere anerkender Tulane University afdeling for celle og Molekylærbiologi og Tulane Universitet Institut for kemi for deres støtte og brug af plads og udstyr. Dette arbejde blev støttet af en tobak produkt regulerende Science Research Fellowship til C. Anderson fra Tulane University School of Science og teknik.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 V AC/DC Wall Mount Adaptor Digi-Key T1099-P5P-ND
2.2 Ohm Resistors Digi-Key A105635-ND Used in tandem to generate the 4.4 Ohm resistance in Figure 2A
330 Ohm Resistors Digi-Key 330QBK-ND
510 Threaded Base NJoy N/A Recovered by dismantalling a second generation NJoy electronic cigarette
Acetic Acid, Glacial Sigma-Aldritch A6283
Acetone (Chromatography Grade) Sigma-Aldritch 34850
Basic Stamp Project Board Digi-Key 27112-ND This board contains the BS1 Microcontroller, serial adaptor, power switch, and a barrel pin connector for the AC/DC Wall Mount Adaptor
Basic Stamp USB to Serial Adapter Digi-Key 28030-ND An optional component to allow the BS1 serial adaptor to communicate through USB
Buchner Flask (Vacuum Flask) 250 mL VWR 10545-854
Clear Tape 3M S-9783
Clear Vinyl Tubing, 3/8" ID Watts 443064
EGM-2 Endothelial Cell Culture Medium Lonza CC-3162
Ethanol Pharmco-Aaper 111000200
Flow Regulator Dwyer VFA-23-BV
Gas Chromatograph Varian 450-GC
Glass Syringe, 10 mL Sigma-Aldritch Z314552
Glass Syringe, 10 µL Hamilton 80300
High Vacuum Silicon Grease Dow Corning 146355D
Hose Clamp Precision Brand 35125
Human Umbilical Vein Endothelial Cells ATCC PCS-100-013 
Mass Spectrometer Varian 300-MS
Midget Impinger Chemglass CG-1820-01
Neutral Red Sigma-Aldritch N4638
Paraffin Film 3M PM-992
Plate Seal Roller BioRad MSR0001
Plate Seal; Foil Thermo 276014
Ring Stand 20" American Educational Products 7-G15-A
Solenoid Valve (normally open) US Solid USS2-00081
Solid State Relay Digi-Key CLA279-ND
Stand Clamp Eisco CH0688
Syringe Filter, PES, 0.22 um Millipore SLGP033RS
Syringe, 10 mL BD Syringe 309604
Through Hole Stopper, Size 6 VWR 59581-287
Vacuum Pump KNF Neuberger N86KTP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. WHO Report on the Global Tobacco Epidemic, 2011. Italy. (2011).
  2. Weaver, S. R., Majeed, B. A., Pechacek, T. F., Nyman, A. L., Gregory, K. R., Eriksen, M. P. Use of electronic nicotine delivery systems and other tobacco products among USA adults, 2014: results from a national survey. Int. J. Public Health. 61, (2), 177-188 (2016).
  3. Singh, T., et al. Tobacco Use Among Middle and High School Students - United States, 2011–2015. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 65, (14), 361-367 (2016).
  4. Corey, C. G., Ambrose, B. K., Apelberg, B. J., King, B. A. Flavored Tobacco Product Use Among Middle and High School Students--United States, 2014. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 64, (38), 1066-1070 (2015).
  5. Pisinger, C., Døssing, M. A systematic review of health effects of electronic cigarettes. Prev. Med. 69, 248-260 (2014).
  6. Callahan-Lyon, P. Electronic cigarettes: human health effects. Tob. Control. 23, (Suppl 2), ii36-ii40 (2014).
  7. Dinakar, C., O'Connor, G. T. The Health Effects of Electronic Cigarettes. N. Engl. J. Med. 375, (14), 1372-1381 (2016).
  8. Anderson, C., Majeste, A., Hanus, J., Wang, S. E-cigarette aerosol exposure induces reactive oxygen species, DNA damage, and cell death in vascular endothelial cells. Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. (2016).
  9. U.S. Department of Health and Human Services. The Health Consequences of Smoking: 50 Years of Progress. A Report of the Surgeon General. Atlanta, GA. U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Chronic Disease Prevention and Health Promotion, Office on Smoking and Health (2014).
  10. Farsalinos, K., et al. Comparison of the Cytotoxic Potential of Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Vapour Extract on Cultured Myocardial Cells. Int. J. Environ. Res. Public. Health. 10, (10), 5146-5162 (2013).
  11. Schweitzer, K. S., et al. Endothelial disruptive proinflammatory effects of nicotine and e-cigarette vapor exposures. Am. J. Physiol. - Lung Cell. Mol. Physiol. 309, (2), L175-L187 (2015).
  12. Putzhammer, R., et al. Vapours of US and EU Market Leader Electronic Cigarette Brands and Liquids Are Cytotoxic for Human Vascular Endothelial Cells. PLOS ONE. 11, (6), e0157337 (2016).
  13. Crooks, I., Dillon, D. M., Scott, J. K., Ballantyne, M., Meredith, C. The effect of long term storage on tobacco smoke particulate matter in in vitro genotoxicity and cytotoxicity assays. Regul. Toxicol. Pharmacol. 65, (2), 196-200 (2013).
  14. Roemer, E., et al. Mainstream Smoke Chemistry and in Vitro and In Vivo Toxicity of the Reference Cigarettes 3R4F and 2R4F. Beitr. Zur Tab. Contrib. Tob. Res. 25, (1), (2014).
  15. International Organization for Standards. ISO 3088:2012 Routine analytical cigarette smoking machine – Definitions and standard conditions. (2012).
  16. World Health Organization. Standard Operating Procedure for Intense Smoking of Cigarettes. (2012).
  17. Brown, C. J., Cheng, J. M. Electronic cigarettes: product characterisation and design considerations. Tob. Control. 23, (Suppl 2), ii4-ii10 (2014).
  18. Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco. CRM No. 81 - Routine Analytical Machine for E-Cigarette Aerosol Generation and Collection - Definitions and Standard Conditions. (2015).
  19. Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Exp. Toxicol. Pathol. 65, (7-8), 1183-1193 (2013).
  20. Klus, H., Boenke-Nimphius, B., Müller, L. Cigarette Mainstream Smoke: The Evolution of Methods and Devices for Generation, Exposure and Collection. Beitr. Zur Tab. Contrib. Tob. Res. 27, (4), (2016).
  21. Baker, R. The Development and Significance of Standards for Smoking-Machine Methodology. Beitr. Zur Tab. Contrib. Tob. Res. 20, (1), (2014).
  22. Thorne, D., Crooks, I., Hollings, M., Seymour, A., Meredith, C., Gaca, M. The mutagenic assessment of an electronic-cigarette and reference cigarette smoke using the Ames assay in strains TA98 and TA100. Mutat. Res. Toxicol. Environ. Mutagen. 812, 29-38 (2016).
  23. Thorne, D., Larard, S., Baxter, A., Meredith, C., Gaҫa, M. The comparative in vitro assessment of e-cigarette and cigarette smoke aerosols using the γH2AX assay and applied dose measurements. Toxicol. Lett. 265, 170-178 (2017).
  24. Herrington, J. S., Myers, C. Electronic cigarette solutions and resultant aerosol profiles. J. Chromatogr. A. 1418, 192-199 (2015).
  25. Yu, V., et al. Electronic cigarettes induce DNA strand breaks and cell death independently of nicotine in cell lines. Oral Oncol. 52, 58-65 (2016).
  26. Ji, E. H., et al. Characterization of Electronic Cigarette Aerosol and Its Induction of Oxidative Stress Response in Oral Keratinocytes. PLOS ONE. 11, (5), e0154447 (2016).
  27. Morgan, D. L., et al. Chemical Reactivity and Respiratory Toxicity of the -Diketone Flavoring Agents: 2,3-Butanedione, 2,3-Pentanedione, and 2,3-Hexanedione. Toxicol. Pathol. 44, (5), 763-783 (2016).
  28. Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco. CRM No. 84 - Determination of Glycerin, Propylene Glycol, Water, and Nicotine in the Aerosol of E-Cigarettes by Gas Chromatographic Analysis. (2017).
En Microcontroller drives enhed for Generation af flydende ekstrakter fra konventionelle cigaret røg og elektronisk cigaret Aerosol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, C. A., Bokota, R. E., Majeste, A. E., Murfee, W. L., Wang, S. A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol. J. Vis. Exp. (131), e56709, doi:10.3791/56709 (2018).More

Anderson, C. A., Bokota, R. E., Majeste, A. E., Murfee, W. L., Wang, S. A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol. J. Vis. Exp. (131), e56709, doi:10.3791/56709 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter