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Environment

真菌 DNA 分析用职业空气标本的收集与提取

doi: 10.3791/56730 Published: May 2, 2018

Summary

确定环境中的真菌多样性是在职业健康研究中用来确定健康危害的一种方法。该协议描述了从职业空气样本中提取的 DNA, 用于对真菌的区域进行扩增和测序。这种方法可以检测到许多真菌物种, 这种方法可被传统的评估方式忽视。

Abstract

在职业环境中识别真菌暴露的传统方法, 如以文化和显微镜为基础的方法, 有若干限制, 导致许多物种被排除在外。过去两年来, 该领域的进展促使职业健康研究人员转向以分子为基础的方法来识别真菌危害。这些方法导致了在室内和职业环境中发现的许多物种没有使用传统方法检测到。本议定书详细介绍了通过基因组 DNA 提取、扩增、测序以及真菌内转录间隔 (其) 区域的分类学鉴定来确定空气样品中真菌多样性的方法。它的测序结果是检测到许多真菌物种, 它们要么没有被发现, 要么难以用文化或显微镜识别到物种水平。虽然这些方法不提供真菌负担的定量措施, 但它们提供了一种新的危险识别方法, 可用于确定一个职业环境中的总体物种丰富度和多样性。

Introduction

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室内和职业环境中的真菌暴露可能导致呼吸道疾病, 包括过敏性敏感和哮喘1。真菌危害的鉴定对于评估风险和防止工人暴露是很重要的。这些真菌危害可能是室内污染、室外空气侵入或环境干扰造成的, 导致将真菌材料输送到工人所在的地区2。评价真菌暴露的方法包括可行的培养基取样和真菌孢子的显微鉴定。这些方法有几个局限性, 往往忽略了许多真菌物种, 可能导致整个真菌负担3。以文化为基础的方法只能区分那些可以在营养培养基上培养的可行的真菌有机体。通过显微镜识别真菌孢子到物种水平可以混淆的孢子分享相似的形态。这两种方法都高度依赖于 mycologists 来分析和鉴定真菌种类, 其中许多残留不明。

为了改进现有的职业危害识别和暴露评估方法, 许多研究人员转而采用分子技术。以测序为基础的评估室内和职业环境中微生物多样性的方法表明, 与显微学和可行文化等方法相比, 所遇到的真菌种类更广泛3,4 ,5。本文介绍了职业环境的空气取样和基因组 DNA 的提取, 以确定潜在的真菌危害。危险识别是通过序列化核核糖体内部转录间隔或其在真菌中高度可变的区域来完成的, 并且通常用于区分真菌种类6,7, 8,9。在职业环境中发现的许多物种, 例如属于 Basidiomycota 的一些物种, 在可行的文化中是无法辨认的, 很难在显微镜下加以区分。这些真菌已被观察到在室内和职业环境中的高相对丰度评估的排序真菌其区域3,4,10。它的测序为在室内和职业环境中遇到的真菌多样性提供了更多的知识。

此处描述的协议详细介绍了用于收集、提取和放大真菌的区域从 bioaerosols 进行序列分析的方法。该方法利用国家职业安全与健康研究所 (NIOSH) 两级旋风气溶胶取样器收集空气中的微粒。该取样器是为了收集 bioaerosols 和分离可吸入 (≤4µm 空气动力学直径) 和不可吸入 (> 4 µm 空气动力学直径) 粒子, 它允许在室内环境中识别真菌有机体最可能由工作人员11吸入。其他空气取样器, 包括旋风取样机, 可在市场上提供, 可以在可吸入范围内 (< 4 µm) 中收集粒子, 方法是使用滤镜12,13。相比之下, NIOSH 两级旋风气溶胶取样器将基于其空气动力学直径的真菌分离成可一次性的聚丙烯管, 可以在下游应用中立即处理14

本议定书详细介绍了提取基因组 DNA 和放大真菌的过程。所提出的提取方法专门用于从真菌和细菌中提取基因组 DNA, 因为许多商业试剂盒靶向哺乳动物细胞、细菌或特定的酵母15。本研究中使用的引物根据其1及其2区域45的总体覆盖率选择。这些区域的排序可以比较许多已存入的序列, 包括序列其1区域、2区域或其1及其2区域的顺序。用这些方法在室内环境中收集的空气样品的真菌多样性, 揭示了大量的序列放置在门 Ascomycota 和 Basidiomycota 以及其他序列属于较不占优势的真菌门, 如Zygomycota。使用这种方法确定的真菌序列的广泛多样性不会使用传统的危险识别方法, 如种植或显微镜来捕获。真菌的测序其区域提供了一种增强的方法来识别真菌的危害, 并允许更好地了解室内和职业真菌暴露。

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Protocol

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1. 制备 NIOSH 气溶胶取样器

注: NIOSH 气溶胶取样器是一个两级旋风气溶胶取样机, 收集 bioaerosols 使用两个取样管和聚四氟乙烯 (PTFE) 过滤。

  1. 装配前, 仔细检查取样器。检查取样器, 确保它没有损坏, 所有螺钉都到位, 舒适, 并在两个部分形成的接缝周围的密封胶带完好无损。检查取样器 O 形环, 以确保它没有任何刻痕, 裂缝或眼泪, 它有一个非常轻涂硅脂。
    注: 该取样器包括37毫米3µm 聚四氟乙烯过滤器在聚苯乙烯或聚丙烯三片滤盒。
    1. 通过在基片的网格化表面放置纤维素或塑料过滤器支撑垫 (包括在过滤器中) 来组装过滤盒 (请参见图 1)。使用过滤钳将过滤器放在过滤器支撑垫的顶部, 并朝上收集端。
    2. 使用手动或气压印刷机密封过滤盒。手动关闭将允许空气在过滤器周围泄漏, 并降低收集效率。插入环形件 (延伸罩), 并使用按下紧密和均匀地向下推。按下扩展罩到过滤器足够紧密, 以确保空气不泄漏周围的过滤器。
      注: 取样时不使用盒顶部, 但在取样完成后应保存在过滤器上。
    3. 将组装的卡带装到取样器的顶部, 尽量将其推下。将19毫米 (3/4 英寸) 胶带绕在过滤盒和取样器的外部, 将过滤盒装在原处, 并作为备用密封来防止泄漏。
    4. 拧紧每管, 并充分进入取样器, 直到它的底部和包装密封胶带周围的每管作为一个次要的密封, 以防止泄漏。
      注: 第一管, 15 毫升聚丙烯管, 收集非吸入颗粒的空气动力学直径 > 4 µm。第二管, 1.5 毫升聚丙烯离心管, 收集在1和4µm 之间的可吸入颗粒。剩余的较小粒子 < 1 µm 在 PTFE 过滤器上收集 (请参见图 2)。
  2. 在每次使用前用校准罐校准气流通过 NIOSH 取样器, 以区别滤波器和取样装置会导致气流变化。
    1. 要使用校准罐, 请将 jar 的鲁尔管接头插入过滤盒的顶部, 将取样器放在罐子中, 然后密封罐子。
    2. 将校准罐连接到校准流量计和取样泵。打开流量计, 让它预热几分钟。请注意, 流量计必须始终有一个过滤器连接到其入口, 以避免污染流量计和取样。
    3. 打开取样泵, 并允许它运行几分钟, 以热身和稳定。
    4. 调整泵以在3.5 升/分钟内设置正确的流量。
      注: NIOSH 气溶胶取样器的流速通常设置为3.5 升/分。在此流速下, 取样器符合可吸入粒子取样的 ACGIH/ISO 标准16。如果需要不同的截止尺寸或降低噪音水平, 则可以使用其他流量, 但要知道, 如果使用不同的流速, 取样器将不再符合可吸入的取样标准。
    5. 校准完成后, 关闭泵和流量计。

2. 静态和个人气溶胶取样

  1. 为个人或静态区域取样设置 NIOSH 气溶胶取样器。
    注: 静态取样是指当取样器和泵安装在正在研究的人员上时, 使用气溶胶取样机, 而将其连接到三脚架或其他持有装置 (请参见图 3), 与个人抽样相比 (请参阅图 4)。
    1. 对于静态区域取样, 请将取样器尽可能靠近所研究的特定区域。保持取样器远离空气入口, 房间入口和可能在气流路径的地方。
      注: 气溶胶浓度即使在短距离内也会有很大的变化, 特别是当气溶胶源在房间17中时。
    2. 对于个人抽样, 在人的呼吸区域内设置取样器。将取样器连接到翻领、肩部或胸部, 并将取样泵放在腰部或背包中。
      注: 呼吸区通常被认为是一个30厘米半球围绕一个人的鼻子, 其中大部分空气是在吸入17
  2. 确保取样器管的取样口很清楚, 没有任何东西阻碍进水口或干扰气流进入取样。取样管不能夹紧或纠结。任何堵塞都会导致泵停止。
  3. 打开水泵。一两分钟后, 检查泵是否仍在运行。
    注意: 根据环境101819, 对时间段进行采样, 范围从10分钟到完全8小时的工作班次不等。图 6中显示的结果在室内环境中具有60分钟采样周期的代表性。
  4. 空气取样完成后, 采集取样管和过滤器。取下密封胶带, 拧开管子, 盖上盖子。将过滤盒的第三片放在过滤器上。将样品存放在4摄氏度, 直到准备好进行加工。

3. 从空气样品中提取基因组 DNA

  1. 从 NIOSH BC251 取样器的每个阶段提取基因组 DNA (gDNA)。分别处理空气取样收集管和过滤器, 以便测定样品中可吸入和不可吸入的微生物气溶胶。
    注: 或者, 如果样品接种太小, 可以组合和提取三个阶段。
    1. 在第二类生物安全柜或层流清洁工作台, 灌装移除过滤器。用70% 乙醇擦拭取样盒, 用盒式打开工具撬开取样盒。使用过滤器升降机向上推过滤器和支撑垫。用过滤钳抓住过滤器, 把它放在无菌培养皿中。将过滤器切成6块, 放在2毫升加筋管中, 含300毫克玻璃珠 (0.2-0.5 毫米)。
    2. 三十年代将含有过滤器的管子放置在液氮中, 并立即将其放置在4.5 米/秒的珠磨机上。
    3. 重复步骤3.1.2 一次或两次, 直到过滤器被粉碎。小块完整的过滤器可能仍然存在。添加0.5 毫升的裂解缓冲液 (4 米尿素, 200 毫米三, 20 毫米氯化钠, 200 毫米乙二胺乙酸 (EDTA), pH 7.4)。
    4. 在15毫升和1.5 毫升空气取样器管中加入0.3 毫升的裂解缓冲液。涡流管为 10-十五年代, 而直立, 然后另 10-十五年代倒置。将每管的内容转移到含有300毫克玻璃珠的2毫升增强管中。
      注: 在每个取样管收集的大部分材料将积聚在管顶部附近。
    5. 处理所有管在珠轧机均质机在4.5 米/秒三十年代和离心他们在 2万 x g 1 分钟在22°c。转移上清液到无菌的1.5 毫升离心管和离心管在 2万 x g 再次1分钟在22°c。重复此步骤。
  2. 添加30µL 裂解试剂 (见材料表) 到每管和孵化的管在37°c 15 分钟。
  3. 添加0.2 毫升的捆绑缓冲 (10 米尿素, 6 米胍盐酸, 10 毫米三盐酸, 20% 海卫 X-100, pH 4.4) 和蛋白酶 K (100 µg/毫升) 到每管和孵化管在70°c 为10分钟. 将异丙醇的100µL 添加到每管。
  4. 将萃取液转移到玻璃纤维过滤管 (700 µL 容量) 放置在2毫升收集管和离心机收集管在 2万 x g 三十年代在22°c。丢弃收集管并将过滤管放入新的2毫升收集管中。
  5. 添加0.5 毫升抑制剂去除缓冲 (5 米胍盐酸, 20 毫米三 hcl, pH 值 6.6, 38% 乙醇) 到每管和离心机收集管在 2万 x g 三十年代在22°c。丢弃收集管并将过滤管放入新的2毫升收集管中。
  6. 增加0.5 毫升洗涤缓冲 (20 毫米氯化钠, 2 毫米三 HCl, pH 值 7.5, 80% 乙醇) 对每管和离心机收集管在 2万 x g 三十年代在22°c。丢弃收集管并将过滤管放入新的2毫升收集管中。重复此过程。
  7. 离心机收集管在 2万 x g 为一个额外的1分钟22°c, 以消除任何残留洗涤缓冲。丢弃收集管并将过滤管放入新的收集管中。
  8. 添加100µL 温 (≥70°c) 洗脱缓冲 (10 毫米三 HCl, pH 8.5) 到每管和孵化他们在室温下为 1-2 分钟. 离心机收集管在 2万 x g 三十年代在22°c。将空滤管转移到无菌的1.5 毫升离心管, 并从步骤3.8 中重新应用 eluates。在室温下孵育 1-2 分钟离心机在 2万 x g 三十年代在22摄氏度。
    注: Eluates 可以立即用于步骤4或存储在-20 °c, 直到准备使用。基因组 DNA 可以储存长达一年的摄氏-20 摄氏度。如果需要长期贮存, 则建议将 DNA 储存在-80 摄氏度。

4. 真菌核糖体 DNA 的扩增

  1. 使用普遍的真菌底漆放大其区域1和2从提取的 gDNA。
    注意: 对于本协议, 底漆对 Fun18Sf (5 '-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3 ')/ITS4R (5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ') 用于提供其区域的最大覆盖率4,5。其他底漆集, 例如那些放大 ITS1 或 ITS2 区域单独, 可以使用。
    1. 建立聚合酶链反应 (PCR) 为每一个样品在无菌0.5 毫升 pcr 管或96井 pcr 板50µL 反应: 5 µL 提取的模板 DNA (从步骤 3), 33.3 µL pcr 级水, 5 µL 10x pcr 缓冲器, 1.5 µL 50 毫米氯化镁2, 1 µL 10 毫米 2 '-deoxynucleoside 5 '-triphosphates, 0.5 µL 20 µM Fun18Sf 向前底漆, 0.5 µL 20 µM ITS4R 反向底漆, 0.2 µL 的Taq DNA 聚合酶。
    2. 在热循环仪中进行反应:95 °c 变性3分钟;6周期变性 (96 °c, 三十年代) 退火 (50 °c, 四十五年代) 和底漆引伸 (72 °c, 3 分钟);20周期变性 (96 °c, 三十年代), 退火 (50 °c, 四十五年代) 和底漆引伸 (72 °c, 1 分钟);和底漆延伸在72°c 10 分钟保持反应混合物在4°c, 直到下一步。
  2. 用硅胶膜纯化试剂盒将三项 PCR 反应提纯。
    注: 本程序允许去除 PCR 成分 (底漆, dNTPs, 酶, 盐,) 和其他污染物的扩增 DNA 制剂。
    1. 将每个样品的三反应 (150 µL 总) 结合在无菌1.5 毫升离心管中。在5x 体积 (750 µL) 上添加捆绑缓冲 (5 米胍-HCl, 30% 异丙醇), 并用吹打上下十次混合溶液。
    2. 添加450µL 的混合物, 旋转柱放置在收集管和离心管在 17900 x g 三十年代. 丢弃滤液。将余下的450µL 添加到列和离心机在 17900 x g 三十年代在22摄氏度。
      注: 自旋柱含有硅膜, 允许将 DNA 吸附到柱上。
    3. 丢弃滤液并将750µL 洗涤缓冲器 (10 毫米三盐酸, pH 7.5, 80% 乙醇) 添加到自旋柱上。离心机列在 17900 x g 三十年代在22°c。
      注: 此过程去除上述 PCR 反应中的污染物。
    4. 丢弃滤液并离心 17900 x g 的空柱, 在22摄氏度处1分钟。
      注意: 此步骤是删除任何可能干扰下游应用程序的残余洗涤缓冲区。
    5. 将旋转柱转移到无菌1.5 毫升离心管。添加45µL 洗脱缓冲器 (10 毫米三氯, pH 8.5), 并在室温下孵化管5分钟. 离心机的旋转柱在 17900 x g 1 摄氏度。
    6. 立即使用洗脱 DNA 的步骤4和5或存储在-20 °c, 直到准备使用。
      注: amplicons 可以存储长达一年的-20 摄氏度。如果需要长期贮存, 则建议将 DNA 储存在-80 摄氏度。

5. 琼脂糖凝胶电泳法验证真菌的扩增

  1. 铸造1% 琼脂糖凝胶含有1µg/毫升溴溴化物。在沸腾的1x 三乙酸乙酯-EDTA (泰) 缓冲液中溶解琼脂糖。一旦溶液冷却到约50摄氏度, 加入溴溴化, 倒入凝胶浇铸。
  2. 琼脂糖凝胶固化后, 将凝胶浸泡在1x 泰中, 并准备在凝胶上装 amplicons。对8µL 的扩增 DNA, 添加2µL 5x 加载缓冲器。
    注意: 这些卷可以根据所需的加载缓冲区的浓度进行调整。
  3. 载入样品, 所有10µL, 到凝胶和 DNA 梯子为大小参考。在 75 v (6 伏/厘米) 处运行凝胶, 大约90分钟, 可视化带, 通常见于750和1000基对之间, 使用紫外线 (请参见图 5)。

6. 真菌的区域排序和分析

  1. 序列提取的 gDNA 或扩增真菌的区域和分析序列使用当前和适当的方法。

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Representative Results

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通过确定空气样品中确定的每个 OTU 的克隆数, 可以利用相对丰度评估环境中的物种分布。图 6是一个克朗图, 代表了在60分钟的空气取样后, 室内环境中分类放置的物种。可以观察到, 在两种主要的真菌门、Ascomycota 和 Basidiomycota 中, 以及属于 Zygomycota (根霉 microsporus) 的物种中, 环境中含有多种物种。传统的评估方法偏向于 Ascomycota 物种, 因为许多 Basidiomycota 不是可培养的, 也不能用显微镜的方法加以区分。真菌的排序它的区域允许发现许多真菌种类, 特别是一些 Basidiomycota, 经常去未被发现。对这一环境的分析显示, 68% 的真菌序列被认定属于 Basidiomycota, 其中大部分被放置在顺序 Polyporales。

使用基于排序的方法获得的分类数据可用于确定环境中的分类多样性。诸如表1所列的多样性指数决定了环境的丰富程度, 描述了每个样本中确定的物种数量, 以及环境的多样性, 考虑到物种的数量和丰富的每个。表 1显示了两个室内环境的潮1丰富度指数和香农多样性指数。这些指数表明, 与蒸发冷却器环境相比, 空调环境的丰富度和多样性更高。还包括了布雷-柯蒂斯不同系数。这些描述了环境中不同的样本对每个样本中所标识的物种的看法。表1所述的两种环境中的样品分别为空调和蒸发冷却器环境的98% 和97% 高度不同。

Figure 1
图 1: 三件滤盒组件的示意图表示形式.过滤盒由三件组成: 顶部或盖片 (入口), 延伸罩和基片 (插座)。支撑垫和过滤器放置在基片的网格化表面。使用手动或气压压力机将延伸罩密封到底座上。为了与 NIOSH 气溶胶旋风取样器一起使用, 在取样过程中, 顶部的部分被留下, 然后被替换为存储和运输。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: NIOSH 气溶胶旋风取样器的示意图表示形式.NIOSH 旋风气溶胶取样器收集空气中的微粒通过进入取样通过进口, 并产生一个旋风, 将颗粒沉积在样品管壁上。空气首先被拉入一个15毫升聚丙烯管, 其中大颗粒 (> 4 µm) 收集在管壁上。空气然后流出的第一个管和被拉入一个1.5 毫升离心管, 更小的微粒 (1 到4µm) 收集。剩余的粒子 (< 1 µm) 收集在聚四氟乙烯过滤器, 因为空气是从取样机抽出。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 静态取样器设置的示例.该图像演示了用于静态区域取样的取样器。NIOSH 取样器设置为从地面收集40英寸 (102 厘米) 和60英寸 (152 厘米), 分别代表一个坐着和站立的成年人的高度。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 个人取样器组件的示例.该图像说明了一个由个人在背包上佩戴的 NIOSH 取样器。采样器和电源开关位于包的带上, 而取样泵位于背包本身内。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 琼脂糖凝胶的示例可视化从空气样本中扩增其 DNA.图像显示750和1000基对之间的 DNA 带。这些带代表放大的真菌它的区域从提取的空气样品。它的区域大小根据种类的起源不同。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 显示分类放置在室内环境中标识的真菌种类的克朗图示例.克朗图描述了在60分钟的空气取样期后, NIOSH 气溶胶旋风取样器收集的4份样品中发现的真菌种类的相对丰度。所鉴定的物种中有68% 属于 Basidiomycota, 其余属于 Ascomycota (33%) 和 Zygomycota (1%)。此环境中最丰富的序列属于订单 Polyporales, 并被标识为Phanerodontia 毛平Gelatoporia 常山请单击此处查看此图的较大版本.

Chao-1 丰富 香农多样性 布雷-柯蒂斯距离
平均值 (最小, 最大值) 平均值 (最小, 最大值) 平均值 (最小, 最大值)
空调 (n = 9) 33.86 (15.0, 102.0) 1.39 (0.68, 2.51) 0.9778 (0.8313, 1.00)
蒸发冷却器 (n = 10) 25.46 (12.5, 49.5) 1.10 (0.50, 1.72) 0.9624 (0.3804, 1.00)

表 1: 用于比较室内环境的多样性和物种丰富度指数的示例数据.该表显示了潮1的丰富指数 (每个样本的物种数量), 香农多样性指数 (每个物种的数量和丰度), 以及布雷-柯蒂斯不同系数 (物种分布在 0-1 的比例上的差异如何)。这些数据表明, 在空调环境中, 在两种环境中, 样品之间的丰富度和多样性都较高。此表已从柠檬et al中修改。10获得皇家化学学会的许可。

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Discussion

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使用基于排序的方法确定职业环境中的真菌多样性, 改善了真菌危害识别和暴露评估。使用这种方法, 可以检测到许多额外的真菌物种, 通常没有使用文化或显微镜的评估方法检测到。本文介绍了一种从职业和室内环境中取样 bioaerosols 的方法, 并从空气样本中提取基因组 DNA 进行扩增和测序。用这些方法测定真菌的多样性是高度依赖于: (1) 成功和完全提取的基因组 DNA 从空气样本, (2) 扩增的 gDNA 与引物, 允许比较放大其序列到存入库在数据库中的序列和限制放大偏差, 和 (3) 正确的分类识别数据库中的序列。

成功的基因组 DNA 提取依赖于研究中所使用的萃取方法和试剂。如《议定书》所述, 在 NIOSH 两级旋风取样器的管相中收集的大量 bioaerosols 和其他生物和非生物微粒收集在管的顶部。这是非常重要的是, 在加入裂解缓冲时小心地打开管子, 不要失去任何微粒, 并且它们被 vortexed, 允许所有微粒落入溶解缓冲 (右侧向上和倒置)。同样重要的是, 使用无菌方法小心处理过滤器, 以免干扰在提取或引入污染 DNA 之前在表面收集的任何 bioaerosols。已经证明, 许多商业上可用的基因组 DNA 提取套件中有很大的差异15。某些提取程序偏向于特定的真菌种类, 并导致不同的 DNA 生成20。如果提取后的 DNA 产量较低, 则可以进行更高的 PCR 反应复制。不仅提取出产量有变化, 而且许多试剂盒还造成大量的微生物 DNA 污染。因此, 重要的是要在整个过程中包括适当的控制, 以识别和消除潜在的试剂污染物的分析。

它的放大是该议定书的另一个关键步骤。所使用的提取方法可能因其从环境样品中去除 PCR 抑制剂的能力而异。这特别与环境粉尘样品21有关。采用该方法提取的 pcr 扩增样品, 在添加10毫克粉尘15后, 表现出一定的 pcr 抑制。虽然 PCR 抑制是环境粉尘样品中最令人关注的问题, 但在从空气样品中提取 DNA 以确定真菌多样性时, 仍应考虑。该方法使用的 PCR 底漆集提供了它的1和它的2区域的覆盖面。这允许与序列数据库中放置的许多序列进行比较。与提取过程一样, 许多放大和底漆偏差以前被描述为22。真菌基因组大小和基因复制数也可能影响其放大23。在解释结果序列数据时, 应考虑这些偏差。其序列的分类识别可能是该方法最关键的组成部分。保持标识标准一致是很重要的。识别序列的能力取决于数据库中存入的序列。许多序列不能被辨认到种类水平。在根据库序列 (如百分比标识下限) 进行分类标识时, 具有特定的标准对于保持数据集与研究的一致性是至关重要的。

与传统的评估方法相比, 从职业空气样本中提取和测序真菌 DNA 可以更完整地反映环境中的真菌多样性。除了上面讨论的限制外, 必须指出, 这些类型分析的结果是半定量的, 不同于培养、孢子计数或定量 PCR24 , 可以产生定量数据。测序数据可用于确定每样样品的相对丰度以及计算真菌多样性指标。这些方法可以与其他方法 (如 qPCR) 一起使用, 以获得更多可量化的数据。使用这些方法创建的数据集可用于职业健康研究, 以便更好地了解特定职业环境中的真菌危害。为了更好地表征和比较基于排序的真菌多样性研究, 需要制定更标准化的提取和底漆选择方法。

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Disclosures

本报告的结论和结论是作者的意见, 不一定代表国家职业安全与健康研究所、疾病控制和预防中心的官方立场。

Acknowledgments

这项工作部分是由 NIOSH 与 NIEHS (AES12007001-1-0-6) 之间的机构间协议支持的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler NIOSH BC251 The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps Fisher Scientific 02-681-373 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352096 15 mL polypropylene tubes for air sampling
Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width McMaster-Carr 76505A1 sealing tape
Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm SKC Inc. 225-3LF 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs
PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm EMD Millipore FSLW03700 Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads
Fisherbrand filter forceps Fisher Scientific 09-753-50 filter forceps
Model 502 Precision PanaPress PanaVise 502 pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press
Scotch Super 33+ vinyl electrical tape McMaster-Carr 76455A21 19 mm tape
Multi-purpose Calibration Jar, Large SKC Inc. 225-112 calibration jar
Universal PCXR4 Sample Pump SKC Inc. 224-PCXR4 sampling pump
Mass Flowmeter 4140 TSI Inc. 4140 flow meter
Roche High Pure PCR Template Kit Roche Diagnostics 11796828001 Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes
Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps Fisher Scientific 15340162 2 mL reinforced tubes for bead homogenization
Glass beads, acid washed, 212-300 µm Sigma-Aldrich G1277 glass beads
Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer Fisher Scientific 15-340-163 bead homogenizer
CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X Sigma-Aldrich C8740 lysis reagent
Platinum Taq polymerase Invitrogen 10966-018 Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender
dNTP Mix Invitrogen 18427-088 10 mM dNTP mix
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye
Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System Thermo Fisher B1 or B2
TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder Thermo Fisher 10488-085 DNA ladder

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References

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真菌 DNA 分析用职业空气标本的收集与提取
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Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).More

Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).

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