Summary
Bestämma svamp mångfalden inom en miljö är en metod som används i företagshälsovård studier för att identifiera hälsorisker. Det här protokollet beskriver DNA-extraktion från yrkesmässig luftprover för förstärkning och sekvensering av svamp ITS regioner. Denna metod upptäcker många svamp arter som kan förbises av traditionella bedömningsmetoder.
Abstract
Traditionella metoder för att identifiera svamp exponeringar i yrkesmässiga miljöer, såsom kultur och mikroskopi-baserade metoder, har flera begränsningar som har resulterat i uteslutandet av många arter. Framsteg i fältet under de senaste två årtiondena har lett företagshälsovård forskare att vända sig till molekylär-baserade metoder för att identifiera svamp faror. Dessa metoder har resulterat i att upptäcka många arter inom inomhus och yrkesmässiga miljöer som inte har upptäckts med traditionella metoder. Detta protokolldetaljer ett tillvägagångssätt för att bestämma svamp mångfald inom luft prover genom genomisk DNA-extraktion, förstärkning, sekvensering och taxonomisk identifiering av svamp inre transkriberas spacer (ITS) regioner. DESS sekvensering resultat för detektion av många svamp arter som inte är identifierade eller svårt att identifiera till artnivå med kultur eller mikroskopi. Även om dessa metoder inte ger kvantitativa mått svamp börda, de erbjuder en ny strategi för faroidentifiering och kan användas för att fastställa övergripande artrikedom och mångfald inom en arbetsmiljö.
Introduction
Svamp exponeringar i miljöer inomhus och tjänstepensioner kan leda till respiratorisk komorbiditeter, inklusive allergisk sensibilisering och astma1. Identifiering av svamp faror är viktigt för att bedöma risker och förebygga arbetstagarens exponering. Dessa svamp faror kan vara ett resultat av inomhus kontaminering, uteluft intrång eller miljöstörningar som leder till transport av svamp material in i områden där arbetstagare blir närvarande2. Metoder för att bedöma svamp exponering har inkluderat livskraftig kultur provtagning samt mikroskopisk identifiering av svampsporer. Dessa metoder har flera begränsningar och ofta förbiser många svamp arter som kan bidra till den övergripande svamp börda3. Kultur-baserade metoder kan endast skilja dessa livskraftiga svamp organismer som kan odlas på näringssubstrat. Att identifiera svampsporer till artnivå via mikroskopi kan förväxlas av sporer som delar liknande morfologier. Båda metoderna är starkt beroende av mykologer att analysera och identifiera de svamp arterna, med många återstående oidentifierade.
För att förbättra befintliga metoder används i Yrkesrisk identifiering och exponering bedömningar, har många forskare vänt sig till molekylär-baserade tekniker. Sekvensering-baserade metoder för att bedöma mikrobiell mångfald inom miljöer inomhus och tjänstepensioner har avslöjat ett bredare spektrum av svamp arter påträffades jämfört metoder såsom mikroskopi och livskraftig kultur3,4 ,5. Metoden presenteras här beskriver luft provtagning av yrkesmässiga miljöer och utvinning av genomisk DNA för identifiering av potentiella svamp faror. Faroidentifiering åstadkoms genom att sekvensera de nukleära ribosomal inre transkriberas spacer eller ITS, regioner som är mycket varierande bland svampar och har varit vanligt förekommande att skilja svamp arter6,7, 8,9. Många arter Funna i arbetsmiljöer, såsom vissa arter som tillhör fylum basidiesvampar, inte är identifierbara i livskraftig kultur och är svåra att skilja mikroskopiskt. Dessa svampar har observerats i höga relativa överflöd inom inomhus och yrkesmässiga miljöer bedömas av sekvensering svamp ITS regioner3,4,10. DESS sekvensering har gett ökad kunskap i mångfalden av svampar som påträffades inom miljöer inomhus och tjänstepensioner.
Protokollet beskrivs här Detaljer metoderna för att samla, extrahera och förstärka svamp ITS regioner från bioaerosoler för sekvensanalys. Denna strategi använder tredjeparts National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) två-stegs cyklon aerosol sampler att samla in partiklar i luften. Denna sampler utvecklades för att samla bioaerosoler och separat respirabelt (≤4 µm Aerodynamisk diameter) och icke-respirabla (> 4 µm Aerodynamisk diameter) partiklar, som möjliggör identifiering av svamp organismer inom inomhusmiljöer som är mest sannolikt att inhaleras av en arbetare11. Andra luft samplers, inklusive cyklon samplers, finns tillgängliga på marknaden som har förmågan att samla in partiklar inom intervallet respirabelt (< 4 µm) använder filter12,13. Däremot skiljer NIOSH tvåstegs cyklon aerosol sampler svamp arter utifrån deras aerodynamiska diameter i disponibel, polypropylen rör som kan bearbetas omedelbart nedströms tillämpningar14.
Processerna för utdrager genomiskt DNA och förstärka de svamp ITS regionerna beskrivs i detta protokoll. De utvinning metoder som presenteras har utvecklats speciellt för utvinning av genomisk DNA från svampar och bakterier, som många kommersiella kit rikta däggdjursceller, bakterier eller specifikt jäst15. Primers används i denna studie är utvalda baserat på deras övergripande täckning av både svamp dess 1 och dess 2 regioner4,5. Sekvensering av dessa regioner tillåter jämförelse av många bankas ITS sekvenser, inklusive de som sekvens regionen dess 1, dess 2 region eller både dess 1 och dess 2 regioner. Svamp mångfalden av luftprover insamlade i en inomhus inställningen med hjälp av dessa metoder visas, avslöjar ett betydande antal sekvenser som placeras i phyla Ascomycota och basidiesvampar samt andra sekvenser som tillhör mindre dominerande svamp phyla, såsom Zygomycota. Den breda mångfalden av svamp sekvenserna identifieras med hjälp av denna metod skulle inte fångas med hjälp av traditionella hazard identifiering metoder som odling och mikroskopi. Sekvensering av svamp ITS regioner ger en förbättrad metod för att identifiera svamp faror och möjliggöra en bättre förståelse för inomhus- och tjänstepensionsmyndigheten svamp exponeringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förbereda NIOSH aerosol sampler
Obs: NIOSH aerosol sampler är en två-stegs cyklon aerosol sampler som samlar bioaerosoler med två rör och ett filter för polytetrafluoreten (PTFE).
- Före montering, inspektera noggrant sampler. Kontrollera provtagaren så att den inte är skadad, alla skruvarna är på plats och sitter fast ordentligt och förseglingstejpen runt sömmen bildas av de två halvorna är intakt. Inspektera sampler O-ring så det inte har någon nicks, sprickor eller tårar och att den har en mycket ljus beläggning av silikonfett.
Obs: Sampler inkluderar en 37 mm 3 µm PTFE filter med stegvisa anvisningar i polystyren eller polypropylen tredelad filter kassetten.- Montera filter kassetten genom att placera en cellulosa eller plast filter stöd pad (medföljer filtren) på inrutade ytan av basen lappa (se figur 1). Använda filtret pincett för att sätta filtret ovanpå filtret stöd pad med den samling sidan uppåt.
- Försegla de filterkassetter som använder en manuell eller pneumatiskt tryck. Hand nedläggningen kommer att luften kan läcka runt filtret och minska samlingseffektivitet. Infoga den ringformade bit (förlängning kåpa), och Använd pressen för att pressa tätt och jämnt. Tryck ner förlängning kåpa på filtret tätt nog att se till att luft inte läcker runt filtret.
Obs: I ovandelen av kassett används inte medan provtagning men ska sparas för att täcka filtret när provtagningen är klar. - Passar monterade kassetten på toppen av provtagaren och skjut så långt som möjligt. Vira en bit 19 mm (3/4 tum) tejp runt utsidan av filtret kassett och sampler att hålla filter kassetten på plats och att agera som en backup tätning för att förhindra läckage.
- Skruva fast varje rör tätt och fullt till sampler tills den bottnar och wrap tätningsband runt varje tub för att fungera som en sekundär tätning mot läckor.
Obs: Det första röret, en 15 mL polypropylen rör, samlar in icke-respirabla partiklar med en Aerodynamisk diameter av > 4 µm. Det andra röret, ett 1,5 mL polypropylen mikrocentrifug rör, samlar respirabla partiklar mellan 1 och 4 µm. De återstående mindre partiklarna, < 1 µm, samlas på Polytetrafluoreten (se figur 2).
- Kalibrera luftflödet genom NIOSH sampler med en kalibrering burk före varje användning som skillnaderna i filtren och provtagare kommer att orsaka luftflödet att variera.
- Att använda en kalibrering burk, infoga burkens Luer montering i toppen av filter kassetten, placera provtagaren i burken och försegla burken.
- Anslut kalibrering burken till en kalibrering flödesmätare och provtagningspumpen. Aktivera flödesmätaren och gör det möjligt att värma upp för några minuter. Observera att flödesmätaren alltid måste ha ett filter som bifogas dess inloppet till undvika kontaminering av flödesmätaren och sampler.
- Aktivera provtagningspumpen och låt den gå i några minuter för att värma upp och stabilisera.
- Justera pumpen för att ställa in det rätta flödet vid 3,5 L/min.
Obs: Flödet för NIOSH aerosol sampler är vanligtvis inställd på 3,5 L/min. Vid denna flödeshastighet uppfyller sampler ACGIH/ISO kriterierna för respirabel partikel provtagning16. Andra flöden kan användas om olika cut-off storlekar önskas eller för att sänka ljudnivån, men vara medveten om att om en olika flödeshastighet används, sedan sampler kommer inte längre överensstämmer med kriterierna respirabel provtagning. - När kalibreringen är klar, Stäng av pumpen och flödesmätare.
2. statiska och personliga aerosol provtagning
- Ställa in NIOSH aerosol provtagaren för antingen personliga eller statiska området provtagning.
Anm: Statisk provtagning avser använda aerosol sampler medan den är ansluten till ett stativ eller annan anläggning enhet (se figur 3), vilket är som kontra personlig provtagning när de sampler och pumpen är monterade på den person som studeras (se figur 4).- För statiska området provtagning, hålla Provtagarna så nära som möjligt till det specifika området som studeras. Hålla Provtagarna från luftintag, rum entréer och platser som kan vara i vägen för luftflödet.
Obs: Aerosol koncentrationer kan variera avsevärt även över korta avstånd, speciellt om aerosol källan är i rum17. - För personliga provtagning, ställa in sampler inom personens andningszonen. Fästa sampler kavajslag, skuldra eller bröstet, och placera provtagningspumpen i midjan eller i en ryggsäck.
Obs: Andningszonen antas vanligen vara en 30 cm halvklotet kring en persons näsa som majoriteten av luft dras under inandning17.
- För statiska området provtagning, hålla Provtagarna så nära som möjligt till det specifika området som studeras. Hålla Provtagarna från luftintag, rum entréer och platser som kan vara i vägen för luftflödet.
- Kontrollera att provtagaren slangar är väl klart av sampler öppningarna och att inget hindrar vikar eller stör luftflödet in i Exempelspelaren. Sampler slangar får inte klämmas eller snodda. Någon blockering kommer att orsaka pumpen för att stoppa.
- Slå på pumpar. Efter en minut eller två, kolla om pumparna körs fortfarande.
Obs: Beteende luft provtagning för tidsperioder som sträcker sig från så lite som 10 min till en full 8 h Skift, beroende på den miljö10,18,19. De resultat som presenteras i figur 6 är representativa för en 60 min provtagningsperiod i en inomhusmiljö. - Efter luft provtagning är klar, samla provrör och filter. Ta bort förseglingstejpen, skruva loss rören och cap dem. Placera den tredje stycke filter kassetten över filtret. Lagra prover vid 4 ° C tills den för bearbetning.
3. utvinning av genomisk DNA från luftprover
- Extrahera genomiskt DNA (gDNA) från varje etapp av NIOSH BC251 sampler. Bearbeta luften provtagning samling rör och filtrera separat för att möjliggöra bestämning av respirabel och icke-respirabla mikrobiella aerosoler i provet.
Obs: Alternativt tre faser kan kombineras och extraherade om provet inokulum är för liten.- I klass II biologiska säkerhetsskåp eller laminärt flöde ren bänk, aseptiskt bort filtret. Torka provtagning kassett med 70% etanol och bända provtagning kassetten öppna verktyget en kassett-öppning. Använd ett filter lyftare för att driva filter och stöd pad uppåt. Förstå det filter använder filtret pincett och placera den i en steril petriskål. Skär filtret i 6 lika stora bitar och Lägg dem i en 2 mL förstärkt tub innehållande 300 mg glaspärlor (0,2 - 0,5 mm).
- Placera röret som innehåller filtret i flytande kväve för 30 s och placera det omedelbart i en pärla kvarn Homogenisatorer vid 4,5 m/s för 30 s.
- Upprepa steg 3.1.2 gånger tills filtret är strimlad. Små bitar av intakt filter kan finnas kvar. Tillsätt 0,5 mL lyseringsbuffert (4 M urea, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 200 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA), pH 7,4).
- Lägga till 0,3 mL lyseringsbuffert i 15 mL och 1,5 mL air sampler tubes. Vortex röret för 10-15 s medan upprätt och sedan ytterligare 10-15 s inverterad. Över innehållet i varje rör till 2 mL förstärkta rör innehållande 300 mg glaspärlor.
Obs: De flesta av det material som samlas in i varje sampler rör ackumulerar nära toppen av röret. - Bearbeta alla rören i den pärla kvarn homogenisatorn vid 4,5 m/s under 30 s och centrifugera dem vid 20 000 x g för 1 min på 22 ° C. Överföra supernatanterna till sterila 1,5 mL mikrocentrifugrör och centrifugera rören vid 20 000 x g igen för 1 min på 22 ° C. Upprepa detta steg.
- Tillsätt 30 µL lysis reagens (se Tabell för material) till varje rör och inkubera rören vid 37 ° C i 15 min.
- Tillsätt 0,2 mL av bindande buffert (10 M urea, 6 M guanidin-HCl, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton x-100, pH 4.4) och proteinas K (100 µg/mL) till varje rör och inkubera rören vid 70 ° C i 10 min. Tillsätt 100 µL av isopropanol till varje rör.
- Överför extraktlösningar till fiber filter glasrör (700 µL kapacitet) placeras i 2 mL samling rör och centrifugera samling rören vid 20 000 x g i 30 s vid 22 ° C. Kassera de samling tuberna och placera filtret rören in nya 2 mL samling rören.
- Tillsätt 0,5 mL av hämmare borttagning buffert (5 M guanidin-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6,6, 38% etanol) i varje rör och centrifugera samling rören vid 20 000 x g i 30 s vid 22 ° C. Kassera de samling tuberna och placera filtret rören in nya 2 mL samling rören.
- Tillsätt 0,5 mL av tvättbuffert (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80% etanol) i varje rör och centrifugera samling rören vid 20 000 x g i 30 s vid 22 ° C. Kassera de samling tuberna och placera filtret rören in nya 2 mL samling rören. Upprepa denna process.
- Centrifugera samling rören vid 20 000 x g för en ytterligare 1 min vid 22 ° C att ta bort eventuella resterande tvättbuffert. Kassera de samling tuberna och placera filtret rören in nya samling rören.
- Tillsätt 100 µL varma (≥ 70 ° C) eluering buffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) till varje rör och odla dem i rumstemperatur för 1-2 min. Centrifugera samling rören vid 20 000 x g i 30 s vid 22 ° C. Överföra tomma filter rören till en steril 1,5 mL mikrocentrifug rör och återapplicerar eluat från steg 3,8. Odla i rumstemperatur i 1-2 min. Centrifugera vid 20 000 x g i 30 s vid 22 ° C.
Obs: Eluat kan användas omedelbart för steg 4 eller lagras vid-20 ° C tills de ska använda. Genomiskt DNA kan förvaras i upp till ett år vid-20 ° C. Det rekommenderas att DNA lagras vid-80 ° C om långsiktig lagring krävs.
4. förstärkning av svamp ribosomal DNA
- Använd universella svamp primers för att förstärka dess regionerna 1 och 2 från den extraherade gDNA.
Obs: För detta protokoll, primern para ihop Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') används för att ge den största täckningen av ITS regioner4,5. Andra primer uppsättningar, såsom de som förstärker ITS1 eller ITS2 regioner ensam, kan användas.- Ställa in polymeras kedjereaktioner (PCR) för varje prov i tre exemplar 50 µL reaktioner i sterila 0,5 mL PCR-rör eller 96 brunnar PCR-plattor som följer: 5 µL av extraherad DNA (från steg 3), 33,3 µL av PCR-grade vatten, 5 µL 10 x PCR buffert , 1,5 µL av 50 mM MgCl2, 1 µL 10 mM 2'-deoxynucleoside 5'-trifosfater, 0,5 µL 20 µM Fun18Sf framåt primer, 0,5 µL 20 µM ITS4R reverse primer och 0.2 µL av Taq -DNA-polymeras.
- Utföra reaktioner i en termocykel: denaturering vid 95 ° C i 3 min. 6 cykler av denaturering (96 ° C, 30 s) glödgning (50 ° C, 45 s) och primer filändelsen (72 ° C, 3 min); 20 cykler av denaturering (96 ° C, 30 s), glödgning (50 ° C, 45 s), och primer filändelsen (72 ° C, 1 min); och primer filändelsen vid 72 ° C i 10 min. Håll reaktion blandningar vid 4 ° C tills nästa steg.
- Kombinera de tre exemplar PCR-reaktionerna rena med en kvarts membranbaserad rening kit.
Obs: Detta förfarande möjliggör för avlägsnande av PCR-komponenter (primers, dNTP, enzymer, salter, etc.) och andra föroreningar från de amplifierade DNA-preparat.- Kombinera de tre reaktionerna för varje prov (150 µL totalt) i steril 1,5 mL mikrocentrifugrör. Lägg till bindande buffert (5 M guanidin-HCl, 30% isopropanol) på en 5 x volym (750 µL) och blanda lösningen genom pipettering upp och ner tio gånger.
- Tillsätt 450 µL av blandningen till spin kolumner placerad i collection rör och centrifugera rören vid 17,900 x g i 30 s. kasta filtraten. Tillsätt de resterande 450 µL till kolumner och centrifugera 17,900 x g för 30 s vid 22 ° C.
Obs: Spin kolumnerna innehåller ett kvarts membran som möjliggör adsorption av DNA till kolumner. - Kassera filtraten och lägga till 750 µL tvätt buffert (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 80% etanol) i kolumnerna spin. Centrifugera kolumnerna vid 17,900 x g i 30 s vid 22 ° C.
Obs: Denna process tar bort föroreningar från PCR-reaktionen ovan. - Kassera filtratet och centrifugera de tomma kolumnerna vid 17,900 x g för 1 min på 22 ° C.
Obs: Detta steg är att ta bort eventuella kvarvarande tvätt buffert som kan störa efterföljande program. - Överföra spin kolumnerna till sterila 1,5 mL mikrocentrifugrör. Tillsätt 45 µL eluering buffert (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) och inkubera rören i rumstemperatur i 5 min. centrifug spinn kolumnerna vid 17,900 x g för 1 min på 22 ° C.
- Använda de eluerade DNA omedelbart för steg 4 och 5 eller förvaras vid-20 ° C tills klar för användning.
Obs: Amplikoner kan förvaras i upp till ett år vid-20 ° C. Det rekommenderas att DNA lagras vid-80 ° C om långsiktig lagring krävs.
5. kontroll av svamp ITS förstärkning använda agaros gel-elektrofores
- Cast en 1% agaros gel innehållande 1 µg/mL etidiumbromid. Lös upp agaros i kokande 1 x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert. När lösningen har svalnat till ca 50 ° C, Lägg etidiumbromid och häll i gel rösterna.
- Efter agarosgel stelnat, fördjupa gelen i 1 x TAE och förbereda den amplikoner som skall lastas på gelen. Till 8 µL av amplifierade DNA, tillsätt 2 µL av 5 x laddar buffert.
Obs: Dessa volymer kan justeras beroende på koncentrationen av önskad lastning bufferten. - Ladda proverna, alla 10 µL, på gelen tillsammans med en DNA-stege för storleksreferens. Kör gelen vid 75 V (6 V/cm) för ungefär 90 min och visualisera band, typiskt sett mellan 750 och 1 000 baspar, med hjälp av ultraviolett ljus (se figur 5).
6. sekvensering och analys av svamp ITS regioner
- Sekvensera de extraherade gDNA eller förstärkta svamp ITS regioner och analysera de sekvenser med aktuella och lämpliga metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arter distribution inom en miljö kan bedömas med relativa överflöd genom att fastställa antalet kloner av varje OTU som identifierats i luftprover. Figur 6 är en Krona diagram som representerar taxonomiskt placerade arten inom en inomhusmiljö som efter 60 min luft provtagning. Det kan noteras att miljön innehåller en mängd arter inom två stora svamp phyla, Ascomycota och basidiesvampar, samt arter som tillhör stammen Zygomycota (Rhizopus microsporus). Traditionella metoder för bedömning är partisk mot Ascomycota arter, som många basidiesvampar inte är odlingsbara eller inte kan differentieras med mikroskopi-baserade metoder. Sekvensering av svamp ITS regioner tillåter för detektion av många svamp arter, särskilt vissa basidiesvampar, som ofta går oupptäckt. Analys av denna miljö visar 68% av svamp sekvenserna identifieras tillhörde basidiesvampar med de flesta av dem i ordningen Polyporales.
Taxonomiska data som erhållits med hjälp av sekvensering-baserade metoder kan användas för att bestämma den taxonomiska mångfalden inom en miljö. Mångfald-index, såsom de presenteras i tabell 1, avgöra hur rika miljön är, som beskriver antalet arter som identifieras i varje prov, samt hur mångfaldig miljön är, som tar hänsyn till antalet arter och överflödet av varje. Tabell 1 visar Chao 1 rikedom index och Shannon mångfald index för två inomhusmiljöer. Indexen indikerar högre rikedom och mångfald i luftkonditionerade miljöer jämfört med evaporativ kylare miljöer. Dessutom ingår Bray-Curtis olikhet koefficienter. Dessa beskriver hur olika prover inom miljön är om de arter som identifierats inom varje prov. Proverna inom båda miljöerna beskrivs i tabell 1 är mycket olik på 98% och 97% för air conditioner och evaporativ kylare miljöer, respektive.
Figur 1: Schematisk bild av en tredelad kassett filterenhet. Filter kassetten består av tre delar: en övre eller cap bit (inlopp), en förlängning kåpa och en bas bit (utlopp). En stöd pad och filter placeras på den inrutade ytan av basen lappa. Förlängning kåpa sedan försluts på basen med en manuell eller pneumatiskt tryck. För användning med NIOSH bioaerosol cyklon sampler, ovandelen är slutade under provtagning och sedan ersätts för lagring och transport. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk framställning av NIOSH bioaerosol cyklon sampler. NIOSH cyklon aerosol sampler samlar in luftburna partiklar genom ritning luft in sampler genom inloppet, och producera en cyklon som deponerar partiklar på väggen i provrör. Luft sugs först in en 15 mL polypropylen rör, där stora partiklar (> 4 µm) samla på väggarna i röret. Luften sedan strömmar ur första röret och dras in i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, där mindre partiklar (1 – 4 µm) samlar. De återstående partiklarna (< 1 µm) samla på ett PTFE-filter som luften dras ur sampler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: exempel på en statisk sampler set-up. Bilden visar provtagare för statiska området provtagning. De NIOSH Provtagarna ställs upp till samla 40 inches (102 cm) och 60 tum (152 cm) från golvet, som representerar en sittande och stående vuxen, höjder respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: exempel på en personlig sampler församling. Bilden illustrerar en NIOSH sampler bärs på en ryggsäck av en individ. Växeln sampler och makt ligger på remmarna på förpackningen medan provtagningspumpen ligger i ryggsäcken själv. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: exempel på en agaros gel visualisera förstärks dess DNA från luftprover. Bilden visar DNA band mellan 750 och 1 000 baspar. Dessa band representerar förstärkta svamp ITS områden från extraherad luftprover. DESS regioner varierar i storlek beroende arter ursprung. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: exempel kronan diagram presenterar taxonomiskt placeras svamp arter identifierats inom en inomhusmiljö. Kronan diagrammet avbildar det relativa överflödet av svamp som finns i 4 prover som tagits från hem efter en 60 min luft provtagningsperiod med NIOSH bioaerosol cyklon sampler. 68% av de arter som identifierats tillhör fylum basidiesvampar med de återstående tillhörighet till Ascomycota (33%) och Zygomycota (1%). De vanligast förekommande ITS sekvenserna i denna miljö tillhörde ordningen Polyporales och identifierades som Phanerodontia chrysosporium och Gelatoporia dichroa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Chao-1 rikedom | Shannon mångfald | Bray-Curtis avstånd | |
| medelvärdet (min, max) | medelvärdet (min, max) | medelvärdet (min, max) | |
| Luftkonditionering (n = 9) | 33,86 (15,0, 102,0) | 1,39 (0,68, 2,51) | 0.9778 (0.8313, 1,00) |
| Evaporativ kylare (n = 10) | 25,46 (12,5, 49,5) | 1.10 (0,50, 1,72) | 0.9624 (0.3804, 1,00) |
Tabell 1: exempeldata presentera mångfald och arter rikedom index jämför inomhusmiljön. Tabellen visar Chao 1 rikedom index (antal arter per prov), Shannon mångfald index (antal arter) och överflöd av varje och Bray-Curtis olikhet koefficienter (hur olika arter fördelningen är mellan prover på en skala från 0 - 1). Dessa data visar högre rikedom och mångfald i luftkonditionerade miljöer och höga olikhet bland proverna i båda miljöerna. Den här tabellen har ändrats från citroner et al. 10 med tillstånd från den Royal Society of Chemistry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att bestämma den svamp mångfalden inom en arbetsmiljö med sekvensering-baserade metoder har förbättrat svamp farobedömningen identifiering och exponering. Har tillåtet att använda denna metod för detektion av många ytterligare svamp arter som ofta inte upptäcks med hjälp av kultur eller mikroskopi-baserade metoder för bedömning av. En metod för provtagning bioaerosoler från yrkes- och inomhus miljöer och utvinning av genomisk DNA från luftprover för dess amplifiering och sekvensering presenteras här. Bestämningar av svamp mångfald med dessa metoder är mycket beroende: (1) framgångsrik och komplett utvinning av genomisk DNA från luften prover, (2) förstärkning av gDNA med primers som möjliggör en jämförelse av den förstärkta dess sekvenser till bankas sekvenser i de databasen och begränsa förstärkning fördomar, och (3) rätt taxonomisk identifiering av sekvenser inom databaser.
Framgångsrika genomisk DNA-extraktion är beroende av utvinning metoder och reagenser som används i en studie. Som nämns i protokollet, samla en massa bioaerosoler och andra biologiska och icke-biologiska partiklar som samlas in i röret faser av NIOSH tvåstegs cyklon sampler längst upp i röret. Det är mycket viktigt att rören öppnas försiktigt när du lägger till den lyseringsbuffert att inte förlora någon partiklar och att vortexed på ett sätt som gör det möjligt för alla de partiklar att falla i lyseringsbuffert (högra upp och upp och ner). Det är också viktigt att filtret noggrant hanteras med aseptiska metoder för att inte störa någon bioaerosoler som har samlat på ytan före extraktion eller införa kontaminerande DNA. Det har visats att det finns en stor mängd variation mellan många av de kommersiellt tillgängliga genomisk DNA extraktion kit15. Vissa utvinning förfaranden bias mot specifika svamp arter och resultera i varierande DNA ger20. Om DNA avkastningen efter extraktion är låg, kan högre PCR-reaktion replikat utföras. Inte bara göra utvinning avkastningen varierar, men många av dessa kit bidra en betydande mängd mikrobiell DNA kontamination. Därför är det viktigt att inkludera lämpliga kontroller i hela förfarandet för att identifiera och ta bort potentiella reagens föroreningar från analysen.
DESS förstärkning är ett kritiskt steg i protokollet. De utvinning metoder som används kan variera i sin förmåga att ta bort PCR-hämmare från miljöprover. Detta är särskilt oroande med miljömässiga damm prover21. PCR-amplifiering av prover som utvinns med hjälp av metoden som presenteras här uppvisade vissa PCR hämning efter tillsats av 10 mg av damm15. Även om PCR-hämning är störst betydelse i miljömässiga damm prover, bör det fortfarande vara ett vederlag när förstärkande DNA extraheras från luftprover för att fastställa svamp mångfald. PCR-primer som används i denna metod ger täckning för både dess 1 och dess 2 regioner. Detta möjliggör jämförelse med många av de sekvenser som placeras i sekvens databaser. Som med extraktionsförfarande, har många förstärkning och primer fördomar tidigare beskrivna22. Svamp genomet storlek och gen kopienumret kan också påverka dess förstärkning23. Dessa fördomar bör beaktas vid tolkningen av den resulterande sekvensdata. Taxonomisk identifiering av dess sekvenser är kanske den viktigaste komponenten av denna metod. Det är viktigt att hålla identifiering kriterier konsekvent. Förmåga att identifiera dess sekvenser är beroende av de sekvenser som bankas i databaser. Många sekvenser kan inte identifieras till artnivå. Att ha specifika kriterier när du gör taxonomisk identifiering baserat på bankas sekvenser, som procentandel identitet cutoffs, är kritiska för att hålla datamängder konsekvent från studie till studie.
Jämfört med traditionell bedömning tillvägagångssätt, ger extrahera och sekvensering svamp DNA från yrkesmässig luftprover en mer fullständig representation av svamp mångfald inom en miljö. Förutom de begränsningar som diskuteras ovan, måste det noteras att resultaten av dessa typer av analyser är semikvantitativt till skillnad från kultur, spore räknas eller kvantitativ PCR-24 som kan ge kvantitativa data. Sekvensering data kan användas för att bestämma relativa överflöd per prov samt beräkna svamp mångfald mätvärden. Dessa metoder kan användas tillsammans med andra metoder, som qPCR, att få mer kvantifierbara data. De datamängder som skapats med hjälp av dessa metoder kan användas i företagshälsovård studier för att få en bättre förståelse av svamp faror i specifika yrkesmässiga miljöer. Utveckla mer standardiserade metoder för extraktion och primer urval är nödvändiga för att bättre karaktärisera och jämföra sekvensering-baserade studier av svamp mångfald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Resultat och slutsatser i denna rapport är författarnas och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkt av det nationella institutet för arbetarskydd och hälsa, Centers for Disease Control och Prevention.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av en institutionsöverskridande avtal mellan NIOSH och NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
References
- Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
- Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
- Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
- Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
- Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
- Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629 (2014).
- Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863 (2012).
- Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
- Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
- Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
- Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308 (2015).
- Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
- Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
- ACGIH. Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).
- Rodes, C. E., Thornburg, J. W. Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. Ruzer, L. S., Harley, N. H. , CRC Press. (2005).
- Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
- Couch, J., et al. Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).
- Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
- Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
- Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
- Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
- Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).
