تحديد التنوع الفطرية داخل بيئة طريقة تستخدم في الدراسات الصحية المهنية لتحديد المخاطر الصحية. ويصف هذا البروتوكول استخراج الحمض النووي من عينات الهواء المهنية للتضخيم وتسلسل الفطرية للبحث عن المناطق. هذا النهج يكشف العديد من الأنواع الفطرية التي يمكن التغاضي عنها بأساليب التقييم التقليدية.
الأساليب التقليدية لتحديد التعرض الفطرية في البيئات المهنية، مثل الثقافة والنهج القائم على الفحص المجهري، لديها العديد من القيود التي أدت إلى استبعاد العديد من الأنواع. وقد أدت التطورات في هذا المجال على مدى العقدين الماضيين الباحثين في مجال الصحة المهنية إلى التحول إلى النهج المستندة إلى الجزيئية لتحديد المخاطر الفطرية. وأدت هذه الأساليب في الكشف عن العديد من الأنواع داخل البيئات الداخلية والمهنية التي لم يتم اكتشاف باستخدام الأساليب التقليدية. تفاصيل البروتوكول هذا نهج لتحديد التنوع الفطرية داخل الهواء عينات عن طريق استخراج الحمض النووي الجينومي والتضخيم وتسلسلها والتعريف التصنيفي للفطريات الداخلية نسخها مناطق فاصلة (البحث عن). نتائجه التسلسل في الكشف عن العديد من الأنواع الفطرية التي غير المكتشفة أو صعوبة في التعرف على مستوى الأنواع باستخدام الثقافة أو مجهرية. في حين أن هذه الأساليب لا توفر التدابير الكمية من عبء الفطرية، أنها توفر نهجاً جديداً لتحديد المخاطر ويمكن استخدامها لتحديد ثراء الأنواع العامة والتنوع داخل بيئة مهنية.
يمكن أن يؤدي التعرض الفطرية في البيئات الداخلية والمهنية المراضات الجهاز التنفسي، بما في ذلك التوعية بالحساسية والربو1. من المهم تحديد المخاطر الفطرية لتقييم المخاطر ومنع تعرض العمال. قد تكون هذه المخاطر الفطرية نتيجة لتلوث داخلي، تسرب الهواء الخارجي، أو الاضطرابات البيئية تؤدي إلى نقل المواد الفطرية في المناطق التي تكون فيها العمال الحالي2. وشملت الأساليب لتقييم التعرض الفطرية العينات الثقافة قابلة للاستمرار، فضلا عن تحديد مجهرية من الجراثيم الفطرية. هذه النهج العديد من القيود وغالباً ما تتجاهل العديد من الأنواع الفطرية التي يمكن أن تسهم في عبء الفطرية عموما3. يمكن تمييز النهج المستندة إلى الثقافة فقط تلك الكائنات الفطرية قابلة للتطبيق التي يمكن زراعتها في وسائل الإعلام المغذيات. يمكن مرتبك تحديد الجراثيم الفطرية على مستوى الأنواع عن طريق الفحص المجهري بجراثيم تقاسم مورفولوجيس مماثلة. كلتا الطريقتين تعتمد اعتماداً كبيرا على ميكولوجيستس لتحليل وتحديد الأنواع الفطرية، مع العديد من تبقى مجهولة.
ولتحسين المنهجيات الحالية المستخدمة في تحديد المخاطر المهنية وتقييم التعرض، تحولت العديد من الباحثين للتقنيات الجزيئية. وقد كشفت عن النهج القائم على التسلسل لتقييم التنوع الميكروبي داخل البيئات الداخلية والمهنية نطاقا أوسع من الأنواع الفطرية التي واجهت مقارنة بأساليب مثل الفحص المجهري والثقافة قابلة للتطبيق3،4 ،5. ويصف الطريقة المعروضة هنا عينات الهواء من البيئات المهنية واستخراج الحمض النووي للتعرف على الإخطار المحتملة الفطرية. ويتم إنجاز تحديد المخاطر بالتسلسل النووي ريبوسومال مباعدة يدون الداخلية، أو للبحث عن، المناطق اختلافاً كبيرا بين الفطريات واستخدمت عادة للتمييز بين الأنواع الفطرية6،7، 8،9. العديد من الأنواع الموجودة في إعدادات المهنية، مثل بعض الأنواع المنتمية للأسرة في اللغات باسيديوميكوتا، لا يمكن تبينه في الثقافة قابلة للحياة ومن الصعب التفريق بين مجهريا. لوحظت هذه الفطريات في الوفرة النسبية عالية داخل البيئات الداخلية والمهنية المقررة حسب تسلسلها الفطرية للبحث عن مناطق3،،من410. وقدمت لها تسلسل معرفة أكبر إلى تنوع الفطريات مصادفة داخل البيئات الداخلية والمهنية.
ووصف البروتوكول هنا تفاصيل الطرق المستخدمة لجمع واستخراج، وتضخيم الفطرية للبحث عن مناطق من بيوايروسولس لتحليل تسلسل. وهذا النهج يستخدم المعهد الوطني “السلامة المهنية” والصحة (هي) الإعصار مرحلتين الأيروسول العينات لجمع الجسيمات في الهواء. ووضعت هذه العينات لجمع بيوايروسولس ومنفصلة للاستنشاق (دي فور القطر الأيرودينامية ميكرومتر) وغير للاستنشاق (> 4 ميكرومتر الأيرودينامية القطر) الجسيمات، التي تسمح بتحديد هوية الكائنات الفطرية داخل البيئات المغلقة التي أكثر يحتمل أن يكون استنشاقه بعامل11. تتوفر العينات الجوية الأخرى، بما في ذلك أخذ العينات من الإعصار، في الأسواق التي لديها القدرة على جمع الجسيمات داخل النطاق للاستنشاق (< 4 ميكرومتر) باستخدام عوامل تصفية12،13. وفي المقابل، يفصل عينات الأيروسول إعصار مرحلتين هي الأنواع الفطرية استناداً إلى طول القطر الأيرودينامية في أنابيب المتاح، والبولي بروبيلين الذي يمكن معالجته فورا لطلبات المتلقين للمعلومات14.
ترد تفاصيل عمليات استخراج الحمض النووي وتضخيم للبحث عن المناطق الفطرية في هذا البروتوكول. وضعت منهجيات الاستخراج المقدمة خصيصا لاستخراج الحمض النووي من الفطريات والبكتيريا، كما العديد من مجموعات تجارية تستهدف خلايا الثدييات، والبكتيريا، أو على وجه التحديد الخمائر15. يتم اختيار أجهزة الإشعال المستخدمة في هذه الدراسة تستند على التغطية الشاملة لكل 1، الفطرية والمناطق 2،4،5. يسمح وضع تسلسل لهذه المناطق للمقارنة بين العديد من تسلسل للبحث عن راهن، بما في ذلك التسلسل المنطقة 1، أو 2 في منطقة أو مناطق كل من 1، و 2،. تنوع الفطرية لعينات من الهواء جمعت في استخدام الإعداد داخلي تظهر هذه الأساليب، الكشف عن عدد كبير من تسلسلات وضعها في يعج أسكوميكوتا وباسيديوميكوتا، فضلا عن تسلسلات أخرى تنتمي إلى أقل المهيمنة يعج الفطرية، مثل زيجوميكوتا. أن لم يتم التقاط التنوع الكبير في تسلسل الفطرية المحددة باستخدام هذا النهج باستخدام منهجيات تحديد المخاطر التقليدية مثل الزراعة أو الفحص المجهري. تسلسل الفطرية للبحث عن مناطق توفر طريقة محسنة تحديد المخاطر الفطرية وتسمح بفهم أفضل للتعرض الفطرية داخلي والمهنية.
تحديد التنوع الفطرية داخل بيئة مهنية باستخدام النهج القائم على التسلسل تحسن تقييم المخاطر الفطرية بتحديد الهوية والتعرض. وقد يسمح باستخدام هذا النهج للكشف عن العديد من الأنواع الفطرية الإضافية التي غالباً ما لا يتم الكشف عن استخدام الثقافة أو أساليب التقييم القائم على الفحص المجهري. طري…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل جزئيا اتفاق مشترك بين الوكالات هي بين نيس (AES12007001-1-0-6).
NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |