Summary
تحديد التنوع الفطرية داخل بيئة طريقة تستخدم في الدراسات الصحية المهنية لتحديد المخاطر الصحية. ويصف هذا البروتوكول استخراج الحمض النووي من عينات الهواء المهنية للتضخيم وتسلسل الفطرية للبحث عن المناطق. هذا النهج يكشف العديد من الأنواع الفطرية التي يمكن التغاضي عنها بأساليب التقييم التقليدية.
Abstract
الأساليب التقليدية لتحديد التعرض الفطرية في البيئات المهنية، مثل الثقافة والنهج القائم على الفحص المجهري، لديها العديد من القيود التي أدت إلى استبعاد العديد من الأنواع. وقد أدت التطورات في هذا المجال على مدى العقدين الماضيين الباحثين في مجال الصحة المهنية إلى التحول إلى النهج المستندة إلى الجزيئية لتحديد المخاطر الفطرية. وأدت هذه الأساليب في الكشف عن العديد من الأنواع داخل البيئات الداخلية والمهنية التي لم يتم اكتشاف باستخدام الأساليب التقليدية. تفاصيل البروتوكول هذا نهج لتحديد التنوع الفطرية داخل الهواء عينات عن طريق استخراج الحمض النووي الجينومي والتضخيم وتسلسلها والتعريف التصنيفي للفطريات الداخلية نسخها مناطق فاصلة (البحث عن). نتائجه التسلسل في الكشف عن العديد من الأنواع الفطرية التي غير المكتشفة أو صعوبة في التعرف على مستوى الأنواع باستخدام الثقافة أو مجهرية. في حين أن هذه الأساليب لا توفر التدابير الكمية من عبء الفطرية، أنها توفر نهجاً جديداً لتحديد المخاطر ويمكن استخدامها لتحديد ثراء الأنواع العامة والتنوع داخل بيئة مهنية.
Introduction
يمكن أن يؤدي التعرض الفطرية في البيئات الداخلية والمهنية المراضات الجهاز التنفسي، بما في ذلك التوعية بالحساسية والربو1. من المهم تحديد المخاطر الفطرية لتقييم المخاطر ومنع تعرض العمال. قد تكون هذه المخاطر الفطرية نتيجة لتلوث داخلي، تسرب الهواء الخارجي، أو الاضطرابات البيئية تؤدي إلى نقل المواد الفطرية في المناطق التي تكون فيها العمال الحالي2. وشملت الأساليب لتقييم التعرض الفطرية العينات الثقافة قابلة للاستمرار، فضلا عن تحديد مجهرية من الجراثيم الفطرية. هذه النهج العديد من القيود وغالباً ما تتجاهل العديد من الأنواع الفطرية التي يمكن أن تسهم في عبء الفطرية عموما3. يمكن تمييز النهج المستندة إلى الثقافة فقط تلك الكائنات الفطرية قابلة للتطبيق التي يمكن زراعتها في وسائل الإعلام المغذيات. يمكن مرتبك تحديد الجراثيم الفطرية على مستوى الأنواع عن طريق الفحص المجهري بجراثيم تقاسم مورفولوجيس مماثلة. كلتا الطريقتين تعتمد اعتماداً كبيرا على ميكولوجيستس لتحليل وتحديد الأنواع الفطرية، مع العديد من تبقى مجهولة.
ولتحسين المنهجيات الحالية المستخدمة في تحديد المخاطر المهنية وتقييم التعرض، تحولت العديد من الباحثين للتقنيات الجزيئية. وقد كشفت عن النهج القائم على التسلسل لتقييم التنوع الميكروبي داخل البيئات الداخلية والمهنية نطاقا أوسع من الأنواع الفطرية التي واجهت مقارنة بأساليب مثل الفحص المجهري والثقافة قابلة للتطبيق3،4 ،5. ويصف الطريقة المعروضة هنا عينات الهواء من البيئات المهنية واستخراج الحمض النووي للتعرف على الإخطار المحتملة الفطرية. ويتم إنجاز تحديد المخاطر بالتسلسل النووي ريبوسومال مباعدة يدون الداخلية، أو للبحث عن، المناطق اختلافاً كبيرا بين الفطريات واستخدمت عادة للتمييز بين الأنواع الفطرية6،7، 8،9. العديد من الأنواع الموجودة في إعدادات المهنية، مثل بعض الأنواع المنتمية للأسرة في اللغات باسيديوميكوتا، لا يمكن تبينه في الثقافة قابلة للحياة ومن الصعب التفريق بين مجهريا. لوحظت هذه الفطريات في الوفرة النسبية عالية داخل البيئات الداخلية والمهنية المقررة حسب تسلسلها الفطرية للبحث عن مناطق3،،من410. وقدمت لها تسلسل معرفة أكبر إلى تنوع الفطريات مصادفة داخل البيئات الداخلية والمهنية.
ووصف البروتوكول هنا تفاصيل الطرق المستخدمة لجمع واستخراج، وتضخيم الفطرية للبحث عن مناطق من بيوايروسولس لتحليل تسلسل. وهذا النهج يستخدم المعهد الوطني "السلامة المهنية" والصحة (هي) الإعصار مرحلتين الأيروسول العينات لجمع الجسيمات في الهواء. ووضعت هذه العينات لجمع بيوايروسولس ومنفصلة للاستنشاق (دي فور القطر الأيرودينامية ميكرومتر) وغير للاستنشاق (> 4 ميكرومتر الأيرودينامية القطر) الجسيمات، التي تسمح بتحديد هوية الكائنات الفطرية داخل البيئات المغلقة التي أكثر يحتمل أن يكون استنشاقه بعامل11. تتوفر العينات الجوية الأخرى، بما في ذلك أخذ العينات من الإعصار، في الأسواق التي لديها القدرة على جمع الجسيمات داخل النطاق للاستنشاق (< 4 ميكرومتر) باستخدام عوامل تصفية12،13. وفي المقابل، يفصل عينات الأيروسول إعصار مرحلتين هي الأنواع الفطرية استناداً إلى طول القطر الأيرودينامية في أنابيب المتاح، والبولي بروبيلين الذي يمكن معالجته فورا لطلبات المتلقين للمعلومات14.
ترد تفاصيل عمليات استخراج الحمض النووي وتضخيم للبحث عن المناطق الفطرية في هذا البروتوكول. وضعت منهجيات الاستخراج المقدمة خصيصا لاستخراج الحمض النووي من الفطريات والبكتيريا، كما العديد من مجموعات تجارية تستهدف خلايا الثدييات، والبكتيريا، أو على وجه التحديد الخمائر15. يتم اختيار أجهزة الإشعال المستخدمة في هذه الدراسة تستند على التغطية الشاملة لكل 1، الفطرية والمناطق 2،4،5. يسمح وضع تسلسل لهذه المناطق للمقارنة بين العديد من تسلسل للبحث عن راهن، بما في ذلك التسلسل المنطقة 1، أو 2 في منطقة أو مناطق كل من 1، و 2،. تنوع الفطرية لعينات من الهواء جمعت في استخدام الإعداد داخلي تظهر هذه الأساليب، الكشف عن عدد كبير من تسلسلات وضعها في يعج أسكوميكوتا وباسيديوميكوتا، فضلا عن تسلسلات أخرى تنتمي إلى أقل المهيمنة يعج الفطرية، مثل زيجوميكوتا. أن لم يتم التقاط التنوع الكبير في تسلسل الفطرية المحددة باستخدام هذا النهج باستخدام منهجيات تحديد المخاطر التقليدية مثل الزراعة أو الفحص المجهري. تسلسل الفطرية للبحث عن مناطق توفر طريقة محسنة تحديد المخاطر الفطرية وتسمح بفهم أفضل للتعرض الفطرية داخلي والمهنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد العينات الهباء الجوي هي
ملاحظة: هو أخذ العينات الهباء الجوي هي عينة أيروسول مرحلتين إعصار الذي يجمع بيوايروسولس باستخدام أنابيب أخذ العينات اثنين وعامل تصفية تترافلوروايثيلين (PTFE).
- أمام الجمعية العامة، تفتيش دقيق العينات. فحص العينات للتأكد من أنه غير معطوب، مسامير كل في مكان ودافئ، وختم الشريط حول التماس يتكون من اثنين نصفين غير سليمة. فحص العينات الدائري التأكد من أنه ليس لديه أي النكات، الشقوق أو الدموع وأن لديها طلاء خفيف جداً للشحوم سيليكون.
ملاحظة: يتضمن أخذ العينات تصفية PTFE 3 ميكرومتر 37 ملم في البوليسترين أو تصفية ثلاث قطع البولي بروبلين كاسيت.- تجميع كاسيت عامل تصفية حسب وضع السليلوز أو لوحة دعم مرشح البلاستيك (المضمنة مع عوامل التصفية) على سطح الشبكية قطعة قاعدة (انظر الشكل 1). استخدام الملقط تصفية لوضع عامل التصفية على رأس لوحة دعم مرشح مع الجانب جمع مواجها لأعلى.
- ختم شرائط عامل التصفية استخدام صحفي اليدوي أو هوائي. إغلاق اليد سوف تسمح للهواء تسرب حول المرشح وتقليل كفاءة جمع. إدراج قطعة على شكل حلقة (قلنسوة التمديد)، واستخدام الصحافة لدفعها إلى أسفل محكم وبشكل متساو. اضغط لأسفل قلنسوة التمديد على عامل التصفية محكم ما يكفي لضمان عدم تسرب الهواء حول عامل التصفية.
ملاحظة: لا يستخدم أثناء أخذ العينات قطعة أكبر من الكاسيت لكن يجب حفظه لتغطية التصفية مجرد الانتهاء من أخذ العينات. - تناسب كاسيت المجتمعون على الجزء العلوي من أخذ العينات، ودفعها إلى أسفل قدر الإمكان. لف قطعة من الشريط 19 مم (3/4 بوصة) حول الجزء الخارجي من كاسيت تصفية وأخذ العينات لعقد تصفية الكاسيت في مكان والعمل كختم النسخ احتياطي لمنع تسرب.
- برغي كل أنبوب محكم وتام في العينات حتى أنها قيعان والتفاف ختم الشريط حول كل أنبوبة بمثابة ختم ثانوية ضد تسرب.
ملاحظة: الأنبوب الأول، أنبوب البولي بروبلين 15 مل، تجمع جزيئات غير للاستنشاق مع قطر الأيرودينامية > 4 ميكرومتر. الأنبوب الثاني، أنبوب ميكروسينتريفوجي البولي بروبلين 1.5 مل، تجمع جزيئات للاستنشاق بين 1 و 4 ميكرومتر. الجسيمات الصغيرة المتبقية، < 1 ميكرومتر، تجمع على PTFE تصفية (انظر الشكل 2).
- معايرة تدفق الهواء من خلال أخذ العينات هي مع جرة معايرة قبل كل استخدام الاختلافات في عوامل التصفية والعينات سوف تتسبب في تدفق الهواء تختلف.
- لاستخدام جرة معايرة، إدراج تركيب نظام للجرة إلى الجزء العلوي من كاسيت تصفية ومكان أخذ العينات في الجرة، وختم الجرة.
- قم بتوصيل جرة معايرة مقياس تدفق معايرة ومضخة أخذ العينات. تحويل مقياس تدفق والسماح لها بالاحماء لبضع دقائق. علما بأن مقياس تدفق دائماً يجب أن يكون لديك عامل تصفية تعلق على مدخل لها لتجنب تلويث مقياس تدفق وأخذ العينات.
- تشغيل المضخة أخذ العينات، والسماح ليتم تشغيله لبضع دقائق للاحماء، وتحقيق الاستقرار.
- ضبط المضخة لتعيين معدل التدفق الصحيح في 3.5 لتر في الدقيقة.
ملاحظة: يتم تعيين معدل التدفق لعينات الأيروسول هي عادة إلى 3.5 لتر في الدقيقة. هذا معدل التدفق، وأخذ العينات يتطابق مع معايير إيزو ACGIH/الجسيمات للاستنشاق أخذ العينات16. يمكن استخدام معدلات التدفق الأخرى إذا قطع مختلفة الأحجام المرجوة أو تقليل مستوى الضوضاء، إلا أن تدرك أن إذا كان يتم استخدام معدل تدفق مختلفة، ثم أخذ العينات سوف لم تعد مطابقة للمعايير للاستنشاق أخذ العينات. - عند الانتهاء من المعايرة، وإيقاف تشغيل المضخة ومقياس تدفق.
2. أخذ العينات الهباء الجوي ثابتة وشخصية
- إعداد العينات الهباء الجوي هي أما العينات المجال الشخصي أو ثابتة.
ملاحظة: أخذ العينات ثابت يشير إلى استخدام العينات الهباء الجوي في حين أنها موصولة إلى ترايبود أو أي جهاز آخر عقد (انظر الشكل 3)، كما مقابل الشخصي أخذ العينات عند أخذ العينات ومضخة هي التي شنت على الشخص قيد الدراسة (انظر الشكل 4).- لأخذ العينات من منطقة ثابتة، تبقى تجري دراسة العينات أقرب وقت ممكن إلى منطقة محددة. الاحتفاظ العينات بعيداً عن مداخل الهواء ومداخل الغرف والأماكن التي قد تكون في مسار تدفق الهواء.
ملاحظة: تركيزات الهباء الجوي يمكن أن تختلف اختلافاً كبيرا حتى عبر مسافات قصيرة، لا سيما إذا كان مصدر الهباء الجوي في الغرفة17. - لأخذ العينات الشخصية، إعداد العينات داخل منطقة التنفس للشخص. إرفاق العينات بطيه صدر السترة أو الكتف أو الصدر، ووضع مضخة أخذ العينات في وسطه أو في حقيبة تحمل على ظهر.
ملاحظة: منطقة التنفس عادة يفترض أن يكون نصف الكرة 30 سم المحيطة بانف الشخص التي استقيت منها غالبية الهواء خلال استنشاق17.
- لأخذ العينات من منطقة ثابتة، تبقى تجري دراسة العينات أقرب وقت ممكن إلى منطقة محددة. الاحتفاظ العينات بعيداً عن مداخل الهواء ومداخل الغرف والأماكن التي قد تكون في مسار تدفق الهواء.
- تأكد من أن العينات الأنابيب من الواضح جيدا من مداخل العينات وأن لا شيء هو إعاقة المداخل أو تتداخل مع تدفق الهواء إلى العينات. لا يجب أخذ العينات أنابيب مقروص أو متلوي. سوف يتسبب أي انسداد المضخة لإيقاف.
- قم بتشغيل المضخات. بعد دقيقة أو دقيقتين، تحقق إذا ما زالت تشغل المضخات.
ملاحظة: الجوية إجراء أخذ العينات لفترات زمنية تتراوح بين أقل من 10 دقيقة لنوبة عمل كامل ح 8، تبعاً للبيئة10،،من1819. النتائج المعروضة في الشكل 6 هي الممثل لمدة 60 دقيقة أخذ العينات في بيئة داخلية. - بعد الانتهاء من أخذ عينات الهواء، جمع عينة أنابيب والتصفية. إزالة الشريط الختم وفك الأنابيب، وكاب لهم. مكان قطعة ثالثة من كاسيت تصفية أكثر من عامل التصفية. تخزين العينات في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للمعالجة.
3-استخراج الحمض النووي من عينات من الهواء
- استخراج الحمض النووي (جدنا) من كل مرحلة من العينات هي BC251. معالجة الهواء أخذ عينات من أنابيب جمع وتصفية كل على حدة للسماح بتحديد الهباء الميكروبية للاستنشاق وغير للاستنشاق في العينة.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، ثلاث مراحل يمكن جنبا إلى جنب واستخراج إذا كانت العدوى عينة صغيرة جداً.- في الفئة الثانية السلامة البيولوجية مجلس الوزراء أو الاندفاق الصفحي نظيف مقاعد البدلاء، أسيبتيكالي إزالة عامل التصفية. مسح كاسيت أخذ العينات أسفل استخدام الإيثانول 70% ونقب فتح كاسيت أخذ العينات باستخدام أداة فتح كاسيت. استخدام رافعة عامل تصفية لدفع لوحة تصفية ودعم صعودا. فهم عامل التصفية باستخدام الملقط التصفية ووضعه في طبق بتري معقم. قطع عامل التصفية إلى 6 قطع متساوية ووضعها في أنبوب 2 مل المعززة التي تحتوي على 300 ملغ الزجاج الخرز (0.2-0.5 مم).
- ضع الأنبوب الذي يحتوي على عامل التصفية في النتروجين السائل لمدة 30 ق ثم ضعه مباشرة في الخالطون طاحونة حبة مبلغ 4.5 m/s لمدة 30 ثانية.
- كرر الخطوة 3.1.2 مرة أو مرتين حتى يتم تمزيقه عامل التصفية. قد تظل القطع الصغيرة من تصفية سليمة. إضافة 0.5 مل من تحلل المخزن المؤقت (م 4 اليوريا، 200 ملم تريس، 20 مم كلوريد الصوديوم، حمض الإيثيلين 200 ملم (يدتا)، الرقم الهيدروجيني 7.4).
- أضف 0.3 مل من تحلل المخزن المؤقت إلى 15 مل وأنابيب عينات الهواء 1.5 مل. دوامة الأنبوب ل 10-15 ثانية بينما تستقيم وثم آخر 10-15 ثانية مقلوب. نقل محتويات كل أنبوبة لأنابيب 2 مل المعززة التي تحتوي على 300 ملغ الزجاج الخرز.
ملاحظة: معظم المواد التي تم جمعها في كل أنبوب أخذ العينات سوف تتراكم قرب الجزء العلوي من الأنبوب. - معالجة جميع الأنابيب في الخالطون طاحونة حبة في 4.5 m/s s والطرد المركزي 30 منهم في 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة عند 22 درجة مئوية. نقل سوبيرناتانتس إلى أنابيب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل والطرد المركزي هذه الأنابيب في 20,000 ز x مرة أخرى لمدة 1 دقيقة عند 22 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة.
- إضافة 30 ميليلتر من تحلل كاشف (انظر الجدول للمواد) لكل أنبوب واحتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 0.2 مل من المخزن المؤقت ملزم (اليوريا 10 م، م 6 جوانيداين-HCl، 10 مم تريس-HCl، 20% X-100 تريتون، pH 4.4) والبروتيناز ك (100 ميكروغرام/مل) كل أنبوب واحتضان هذه الأنابيب في 70 درجة مئوية للحد الأدنى 10 إضافة 100 ميليلتر من الايزوبروبانول لكل أنبوبة.
- نقل الحلول استخراج إلى أنابيب تصفية ألياف زجاجية (700 قدرة ميليلتر) توضع في أنابيب جمع 2 مل والطرد المركزي أنابيب جمع في 20,000 x ز لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية. تجاهل هذه الأنابيب جمع ووضع أنابيب التصفية في أنابيب جمع 2 مل جديدة.
- إضافة 0.5 مل من مثبطات إزالة المخزن المؤقت (م 5 جوانيداين-HCl، 20 مم تريس-HCl، الرقم الهيدروجيني 6-6، 38% إيثانول) لكل أنبوبة والطرد المركزي أنابيب جمع في 20,000 x ز لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية. تجاهل هذه الأنابيب جمع ووضع أنابيب التصفية في أنابيب جمع 2 مل جديدة.
- إضافة 0.5 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (20 ملم كلوريد الصوديوم، 2 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، الإيثانول 80%) لكل أنبوبة والطرد المركزي أنابيب جمع في 20,000 x ز لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية. تجاهل هذه الأنابيب جمع ووضع أنابيب التصفية في أنابيب جمع 2 مل جديدة. كرر هذه العملية.
- الطرد المركزي أنابيب جمع في 20,000 x ز مين 1 إضافية عند 22 درجة مئوية لإزالة أي المخزن المؤقت غسيل المتبقية. تجاهل هذه الأنابيب جمع ووضع أنابيب التصفية في أنابيب مجموعة جديدة.
- إضافة 100 ميليلتر الحارة (إيه سيفن زيرو درجة مئوية) شطف المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 8.5) لكل أنبوبة واحتضانها لهم في درجة حرارة الغرفة لأجهزة الطرد المركزي كحد أدنى 1-2 أنابيب جمع في العاشر 20,000 ز لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية. نقل أنابيب التصفية فارغة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل وإعادة تطبيق الواتس من الخطوة 3.8. احتضان في درجة حرارة الغرفة لدقيقة 1-2 أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن استخدام الواتيس فورا للخطوة 4 أو المخزنة في-20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. ويمكن تخزين الحمض النووي لتصل إلى سنة في-20 درجة مئوية. من المستحسن أن تخزين الحمض النووي في-80 درجة مئوية إذا كان مطلوباً التخزين على المدى الطويل.
4-تضخيم الحمض النووي ريبوسومال الفطرية
- استخدام كبسولة تفجير الفطرية العالمي لتضخيم في المناطق 1 و 2 من جدنا المستخرجة.
ملاحظة: لهذا البروتوكول، زوج التمهيدي Fun18Sf (-تجكتكتكاكجاجات 5 '-3')/ITS4R (-تككتككجكتاتجاتاتجك 5 '-3') تستخدم لتوفير تغطية أكبر من4،5مناطق للبحث عن. يمكن استخدام مجموعات التمهيدي الأخرى، مثل تلك التي تضخيم المناطق ITS1 أو ITS2 وحدها.- إعداد بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR) لكل عينة في ثلاث ردود ميليلتر 50 في أنابيب PCR معقم 0.5 مل أو لوحات بكر 96-جيدا كما يلي: 5 ميليلتر من قالب استخراج الحمض النووي (من الخطوة 3)، ميليلتر 33.3 بكر الصف المياه، 5 ميليلتر من المخزن المؤقت x PCR 10 ، 1.5 ميليلتر من 50 مم مجكل2، 1 ميليلتر من 10 مم 2 '--ديوكسينوكليوسيدي 5-تريفوسفاتيس، 0.5 ميليلتر من 20 ميكرومتر Fun18Sf التمهيدي إلى الأمام، 0.5 ميليلتر من 20 ميكرومتر ITS4R عكس التمهيدي وميليلتر 0.2 من بوليميراز الدنا بوليميراز.
- القيام بردود فعل في cycler حرارية: تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ 6 دورات تمسخ (96 درجة مئوية، 30 s) الصلب (50 درجة مئوية، 45 ثانية) وتمديد التمهيدي (72 درجة مئوية، 3 دقيقة)؛ دورات 20 من تمسخ (96 درجة مئوية، 30 s)، انلينغ (50 درجة مئوية، 45 ثانية)، وتمديد التمهيدي (72 درجة مئوية، 1 دقيقة)؛ وإبقاء تمديد التمهيدي في 72 درجة مئوية للحد الأدنى 10 الخلائط رد الفعل عند 4 درجة مئوية حتى الخطوة التالية.
- الجمع بين ردود فعل بكر ثلاث نق باستخدام مجموعة أدوات تنقية غشاء مطاطي والسليكا.
ملاحظة: يسمح هذا الإجراء لإزالة مكونات بكر (كبسولة تفجير، دنتبس، إنزيمات، أملاح، إلخ.) والملوثات الأخرى من الأعمال التحضيرية تضخيم الحمض النووي.- الجمع بين ثلاثة ردود فعل لكل عينة (إجمالي 150 ميليلتر) في أنابيب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل. إضافة ربط المخزن المؤقت (م 5 جوانيداين-HCl، الايزوبروبانول 30 ٪) في وحدة تخزين 5 x (750 ميليلتر) ومزيج الحل قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً عشر مرات.
- إضافة 450 ميليلتر من خليط تدور الأعمدة التي توضع في أنابيب جمع والطرد المركزي هذه الأنابيب في س 17,900 ز لتجاهل س. 30 في فيلتراتيس. إضافة ميليلتر 450 المتبقية على الأعمدة والطرد المركزي في س 17,900 ز لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية.
ملاحظة: تحتوي الأعمدة تدور على غشاء السليكا التي تسمح الامتزاز من الحمض النووي للأعمدة. - تجاهل في فيلتراتيس وإضافة 750 المخزن المؤقت للغسيل ميليلتر (مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، الإيثانول 80% من 10) إلى أعمدة الدوران. الطرد المركزي الأعمدة في 17,900 س ز لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه العملية إزالة الملوثات من تفاعل PCR المذكورة أعلاه. - تجاهل filtrate والطرد المركزي الأعمدة الفارغة في 17,900 س ز لمدة 1 دقيقة عند 22 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه الخطوة هي لإزالة أي بقايا الغسيل المخزن المؤقت التي قد تتداخل مع تطبيقات المتلقين للمعلومات. - نقل أعمدة الدوران لأنابيب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل. إضافة ميليلتر 45 شطف المخزن المؤقت (10 ملم تريس Cl، الأس الهيدروجيني 8.5) واحتضان هذه الأنابيب في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 أجهزة الطرد المركزي الأعمدة تدور في 17,900 س ز لمدة 1 دقيقة عند 22 درجة مئوية.
- استخدام الحمض النووي التيد فورا للخطوات 4 و 5 أو تخزينها في-20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
ملاحظة: يمكن تخزين في أمبليكونس لتصل إلى سنة في-20 درجة مئوية. من المستحسن أن تخزين الحمض النووي في-80 درجة مئوية إذا كان مطلوباً التخزين على المدى الطويل.
5-التحقق من الفطرية التضخيم للبحث عن استخدام التفريد [اغروس] هلام
- المدلى بها 1% [اغروس] هلام يحتوي على 1 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد. يحل [اغروس] في الغليان 1 × العازلة تريس-خلات-يدتا (تاي). مرة واحدة وقد بردت الحل إلى حوالي 50 درجة مئوية، إضافة بروميد اثيديوم وتصب جل المدلى بها.
- بعد وقد وطدت [اغروس] هلام، تزج الهلام في 1 x TAE وإعداد أمبليكونس يتم تحميله على الهلام. إلى 8 ميليلتر من تضخيم الحمض النووي، إضافة 2 ميليلتر من 5 × تحميل المخزن المؤقت.
ملاحظة: يمكن تعديلها تبعاً لتركيز المخزن المؤقت المطلوب تحميل وحدات التخزين هذه. - تحميل العينات، كل ميليلتر 10، على جل جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي للرجوع إليها في الحجم. تشغيل الهلام في 75 الخامس (6 V/سم) لما يقرب من 90 دقيقة وتصور العصابات، ينظر إليه عادة ما بين 750 والضوء 000 1 قاعدة زوج، باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (انظر الشكل 5).
6-تسلسل وتحليل الفطرية للبحث عن المناطق
- تسلسل جدنا المستخرج أو تضخيم المناطق عن الفطرية وتحليل تسلسل استخدام الأساليب الحالية والمناسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن تقييم توزيع الأنواع داخل بيئة استخدام الوفرة النسبية عن طريق تحديد عدد الحيوانات المستنسخة أسامة كل تحديد في عينات الهواء. الرقم 6 مخطط كرونا تمثل الأنواع وه موضوعة داخل بيئة داخلية بعد 60 دقيقة لأخذ العينات من الهواء. ويمكن ملاحظة أن البيئة يحتوي على مجموعة متنوعة من الأنواع داخل يعج الفطرية الرئيسية اثنين، وأسكوميكوتا، وباسيديوميكوتا، فضلا عن الأنواع المنتمية للأسرة في اللغات زيجوميكوتا (ميكروسبوروس رهيزوبوس). الأساليب التقليدية لتقييم متحيزة تجاه الأنواع أسكوميكوتا، كما أن العديد من باسيديوميكوتا لا كولتورابل أو لا يمكن أن تكون متباينة في استخدام الأساليب المستندة إلى الفحص المجهري. يسمح تسلسل الفطرية للبحث عن مناطق للكشف عن العديد من الأنواع الفطرية، على وجه التحديد بعض باسيديوميكوتا، التي غالباً ما تكتشف. ويبين تحليل هذه البيئة 68% تسلسل الفطرية التي حددت تنتمي إلى باسيديوميكوتا مع معظمهم من وضعها في ترتيب بوليبوراليس.
يمكن استخدام البيانات التصنيفية التي تم الحصول عليها باستخدام النهج القائم على التسلسل لتحديد التنوع التقسيمي داخل بيئة. تحديد مؤشرات التنوع، مثل تلك الواردة في الجدول 1، البيئة كيف الغنية، التي توضح عدد الأنواع المحددة في كل عينة، فضلا عن البيئة كيف المتنوعة، التي تأخذ في الاعتبار عدد الأنواع ووفرة كل. ويبين الجدول 1 مؤشرات الثراء 1 تشاو وشانون مؤشرات التنوع بالنسبة لاثنين من بيئات داخلي. أن المؤشرات تشير إلى أعلى من ثراء وتنوع في البيئات مكيفة الهواء مقارنة بالبيئات الأكثر برودة التبخر. يتم أيضا تضمين معاملات الاختلاف براي-كورتيس. تصف هذه العينات مدى تشابه داخل البيئة هي فيما يتعلق بالأنواع المحددة داخل كل عينة. العينات داخل كل من البيئات الموصوفة في الجدول 1 تختلف درجة عالية في 98% و 97% لأجهزة تكييف الهواء والتبخر البيئات الأكثر برودة، على التوالي.
رقم 1: التمثيل التخطيطي جمعية كاسيت تصفية ثلاث قطع- كاسيت تصفية يتكون من ثلاث قطع: قطعة أعلى أو كاب (مدخل) وقلنسوة تمديد وقطعة قاعدة (منفذ). وتوضع لوحة الدعم وتصفية على سطح الشبكية قطعة قاعدة. ثم مختومة قلنسوة التمديد على قاعدة استخدام صحفي اليدوي أو هوائي. للاستخدام مع العينات إعصار بيوايروسول هي، قطعة أعلى هو توقفت أثناء أخذ العينات ويتم استبدال ثم للتخزين والنقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التمثيل التخطيطي للعينات إعصار بيوايروسول هي- جمع عينات الأيروسول الإعصار هي الجسيمات المحمولة جوا بالرسم الجوية في أخذ العينات من خلال المدخل وإنتاج إعصار تودع الجسيمات على جدار أنابيب العينة. أولاً يوجه الهواء في أنبوب البولي بروبلين 15 مل، حيث كبيرة الجسيمات (> 4 ميكرومتر) جمع على جدران الأنبوب. الهواء ثم يتدفق من الأنبوب الأول ويتم رسمها في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، حيث جمع جزيئات صغيرة (1 إلى 4 ميكرومتر). الجزيئات المتبقية (< 1 ميكرومتر) جمع في عامل تصفية PTFE كما يسحب الهواء بالخروج من العينات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: مثال لهيكل العينات ثابت- الصورة توضح العينات التي تم إعدادها لأخذ العينات من منطقة ثابتة. يتم تعيين العينات هي حتى جمع 40 بوصة (102 سم) و 60 بوصة (152 سم) من الكلمة، تمثل مرتفعات الجلوس والكبار الدائمة، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مثال جمعية العينات الشخصية- الصورة توضح عينة هي التي يرتديها فرد على ظهره. تبديل العينات والطاقة الموجودة على الأشرطة حزمة بينما المضخة أخذ العينات يقع داخل الحقيبة نفسها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: مثال [اغروس] هلام تصور تضخيم "الحمض النووي،" من عينات الهواء. الصورة تظهر أشرطة الحمض النووي بين 750 و 1000 زوج قاعدي. تمثل هذه العصابات تضخيم المناطق عن الفطرية من العينات المستخرجة. أن المناطق تختلف في الحجم تبعاً لأصل الأنواع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: عرض المخطط الكرونا المثال وه وضع الأنواع الفطرية المحددة ضمن بيئة داخلية- ويصور المخطط الكرونا الوفرة النسبية للأنواع الفطرية الموجودة في 4 عينات جمعت من منازلهم بعد فترة أخذ عينات جوية 60 دقيقة مع أخذ العينات إعصار بيوايروسول هي. 68% الأنواع المحددة تنتمي إلى الأسرة في اللغات باسيديوميكوتا مع الانتماء المتبقية إلى أسكوميكوتا (33 في المائة) وزيجوميكوتا (1%). تسلسل للبحث عن الأكثر وفرة في هذه البيئة اعتبرت تشريسوسبوريوم فانيرودونتيا و ديتشروا جيلاتوبورياوتنتمي إلى النظام بوليبوراليس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| ثراء شاو-1 | التنوع شانون | المسافة براي-كورتيس | |
| يعني (دقيقة, ماكس) | يعني (دقيقة, ماكس) | يعني (دقيقة, ماكس) | |
| مكيف الهواء (n = 9) | 33.86 (15.0، 102.0) | 1.39 (0.68، 2.51) | 0.9778 (0.8313، 1.00) |
| برودة التبخر (n = 10) | 25.46 (12.5، 49.5) | 1.10 (0.50، 1.72) | 0.9624 (0.3804، 1.00) |
الجدول 1: بيانات المثال عرض الأنواع والتنوع ثراء مؤشرات مقارنة البيئات المغلقة- ويبين الجدول 1 تشاو ثراء الأرقام القياسية (عدد الأنواع كل عينة)، ومؤشرات التنوع شانون (عدد الأنواع) ووفرة من كل، ومعاملات الاختلاف براي-كورتيس (تختلف عن كيفية توزيع الأنواع بين العينات على مقياس 0-1). تظهر هذه البيانات أعلى من ثراء وتنوع في البيئات مكيفة الهواء وارتفاع الاختلاف بين العينات في كلتا البيئتين. وقد تم تعديل هذا الجدول من الليمون وآخرون. 10 مع إذن من "المجتمع الملكي للكيمياء".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحديد التنوع الفطرية داخل بيئة مهنية باستخدام النهج القائم على التسلسل تحسن تقييم المخاطر الفطرية بتحديد الهوية والتعرض. وقد يسمح باستخدام هذا النهج للكشف عن العديد من الأنواع الفطرية الإضافية التي غالباً ما لا يتم الكشف عن استخدام الثقافة أو أساليب التقييم القائم على الفحص المجهري. طريقة لأخذ العينات بيوايروسولس من البيئات المهنية وداخلي واستخراج الحمض النووي من عينات الهواء للتضخيم وتسلسل يرد هنا. قرارات بشأن التنوع الفطرية باستخدام هذه الأساليب يعتمد اعتماداً كبيرا على: استخراج الحمض النووي (1) ناجحة وكاملة من الهواء عينات، (2) تضخيم جدنا مع الإشعال التي تسمح بمقارنة تضخيم في التسلسل راهن تسلسل في قاعدة البيانات والحد من التحيز التضخيم، وتحديد التصنيفية الصحيحة (3) تسلسل داخل قواعد البيانات.
نجاح استخراج الحمض النووي الجينوم تعتمد على منهجيات الاستخراج والكواشف المستخدمة في دراسة. وكما هو مذكور في البروتوكول، جمع الكثير من بيوايروسولس وأخرى جسيمات البيولوجية وغير البيولوجية التي تم جمعها في مراحل أنبوب أخذ العينات إعصار مرحلتين هي في الجزء العلوي من الأنبوب. من المهم جداً أن الأنابيب بعناية فتحه عند إضافة المخزن المؤقت تحلل لا أن يخسر أي الجسيمات وأن فورتيكسيد بطريقة تسمح لجميع الجسيمات الوقوع في المخزن المؤقت تحلل (الجانب الأيمن لأعلى وراسا على عقب لأسفل). من المهم أيضا أن يكون عامل التصفية بدقة التعامل معها باستخدام أساليب العقيم لا لعرقلة أي بيوايروسولس التي جمعت على السطح قبل استخراج أو الأخذ بتلويث الحمض النووي. فقد ثبت أن هناك كمية كبيرة من التباين بين العديد من المتوفرة تجارياً المجينية الحمض النووي استخراج مجموعات15. بعض التحيز إجراءات استخراج نحو الأنواع الفطرية المحددة والنتيجة في الحمض النووي متفاوتة غلة20. إذا كان منخفضا الحمض النووي العائد بعد الاستخراج، replicates تفاعل PCR أعلى يمكن أن يؤديها. تختلف غلة الاستخراج، بل العديد من المجموعات على المساهمة بقدر كبير من التلوث الميكروبي بالحمض النووي. ولهذا السبب، من المهم أن تشمل ضوابط سليمة طوال فترة الإجراءات لتحديد وإزالة الملوثات كاشف المحتملة من التحليل.
التضخيم خطوة حاسمة أخرى من البروتوكول. يمكن أن تختلف استخراج المنهجيات المستخدمة في قدرتها على إزالة مثبطات بكر من العينات البيئية. وهذا لا سيما فيما يتعلق بالعينات البيئية الغبار21. [بكر] تضخيم العينات المستخرجة باستخدام الأسلوب الذي قدم هنا عرضت بعض تثبيط PCR بعد إضافة 10 مغ من الغبار15. رغم تثبيط PCR الأشد إثارة للقلق في العينات البيئية الغبار، ينبغي أن يظل نظر عند تضخيم الحمض النووي المستخرج من عينات الهواء لتحديد التنوع الفطرية. التمهيدي PCR المحددة المستخدمة في هذا الأسلوب يوفر التغطية لكل من منطقتي 1، 2،. وهذا يسمح للمقارنة إلى كثير من تسلسل التي توضع في قواعد بيانات تسلسل. كما هو الحال مع إجراءات استخراج، كانت كثير من التحيزات التضخيم والتمهيدي هو موضح سابقا22. عدد النسخ الحجم والجينات في الجينوم الفطرية يمكن أن تؤثر أيضا على التضخيم في23. هذه التحيزات وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند تفسير البيانات الناتجة من التسلسل. لعل التعريف التقسيمي تسلسل هو العنصر الأكثر أهمية لهذا الأسلوب. من المهم الحفاظ على اتساق معايير تحديد الهوية. القدرة على التعرف على تسلسل يعتمد على تسلسل راهن في قواعد البيانات. لا يمكن تحديد تسلسلات كثيرة على مستوى الأنواع. وجود معايير محددة عند وضع التعريفات التصنيفية استناداً إلى تسلسل راهن، مثل النسبة المئوية قطع الهوية، أمر بالغ الأهمية لإبقاء مجموعات بيانات متسقة من الدراسة للدراسة.
بالمقارنة مع نهج التقييم التقليدية، استخراج تسلسل الحمض النووي الفطرية من عينات الهواء المهنية ويوفر تمثيل أكثر اكتمالا الفطرية التنوع داخل بيئة. بالإضافة إلى القيود المذكورة أعلاه، تجدر الإشارة إلى أن نتائج هذه الأنواع من التحليلات شبه كمي خلافا للثقافة أو التهم بوغ PCR الكمي24 التي يمكن أن تسفر عن بيانات كمية. تسلسل البيانات التي يمكن استخدامها لتحديد الوفرة النسبية للعينة الواحدة، فضلا عن حساب قياسات التنوع الفطرية. يمكن استخدام هذه الأساليب بالاقتران مع أساليب أخرى، مثل قبكر، للحصول على المزيد من البيانات القابلة للقياس الكمي. يمكن استخدام مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذه النهج في دراسات الصحة المهنية لاكتساب فهم أفضل للمخاطر الفطرية في بيئات مهنية محددة. النامية أكثر توحيدا النهج الاستخراج والتمهيدي اختيار ضرورية لأفضل وصف ومقارنة على أساس تسلسل دراسات التنوع الفطرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي آراء المؤلفين ولا تمثل بالضرورة الموقف الرسمي للمعهد الوطني للسلامة المهنية والصحية، ومراكز "مكافحة الأمراض" والوقاية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل جزئيا اتفاق مشترك بين الوكالات هي بين نيس (AES12007001-1-0-6).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
References
- Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
- Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
- Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
- Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
- Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
- Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629 (2014).
- Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863 (2012).
- Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
- Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
- Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
- Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308 (2015).
- Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
- Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
- ACGIH. Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).
- Rodes, C. E., Thornburg, J. W. Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. Ruzer, L. S., Harley, N. H. , CRC Press. (2005).
- Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
- Couch, J., et al. Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).
- Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
- Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
- Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
- Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
- Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).
