Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

संग्रह और कवक डीएनए के विश्लेषण के लिए व्यावसायिक हवा के नमूनों की निकासी

doi: 10.3791/56730 Published: May 2, 2018

Summary

एक वातावरण के भीतर कवक विविधता का निर्धारण एक व्यावसायिक स्वास्थ्य अध्ययन में उपयोग के लिए स्वास्थ्य खतरों की पहचान विधि है । यह प्रोटोकॉल कवक अपने क्षेत्रों के प्रवर्धन और अनुक्रमण के लिए व्यावसायिक हवा के नमूनों से डीएनए निष्कर्षण का वर्णन करता है । इस दृष्टिकोण कई कवक प्रजातियों कि पारंपरिक आकलन के तरीकों से अनदेखी की जा सकती है का पता लगाता है ।

Abstract

व्यावसायिक वातावरण में फंगल जोखिम की पहचान के पारंपरिक तरीकों, जैसे संस्कृति और सूक्ष्म आधारित दृष्टिकोण, कई सीमाएं है कि अनेक प्रजातियों के अपवर्जन में हुई है । पिछले दो दशकों में क्षेत्र में अग्रिम व्यावसायिक स्वास्थ्य शोधकर्ताओं ने कवक खतरों की पहचान के लिए आणविक आधारित दृष्टिकोण को बारी करने के लिए नेतृत्व किया है । इन पद्धतियों इनडोर और व्यावसायिक वातावरण है कि पारंपरिक तरीकों का उपयोग नहीं पाया गया है के भीतर कई प्रजातियों का पता लगाने में हुई है । इस प्रोटोकॉल का विवरण जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण, प्रवर्धन, अनुक्रमण, और फफूंद आंतरिक लिखित स्पेसर (इसके) क्षेत्रों के वर्गीकरण की पहचान के माध्यम से हवा के नमूनों के भीतर कवक विविधता का निर्धारण करने के लिए एक दृष्टिकोण । कई कवक प्रजातियों का पता लगाने में इसके अनुक्रमण परिणाम है कि या तो पता नहीं या मुश्किल प्रजातियों के स्तर की पहचान करने के लिए संस्कृति या माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे हैं । हालांकि इन तरीकों कवक बोझ के मात्रात्मक उपाय प्रदान नहीं करते हैं, वे खतरा पहचान के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करते है और एक व्यावसायिक वातावरण में समग्र प्रजातियों समृद्धि और विविधता का निर्धारण किया जा सकता है ।

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

इनडोर और व्यावसायिक वातावरण में फफूंद जोखिम, एलर्जी संवेदीकरण और अस्थमा1सहित सांस की रुग्णता में परिणाम कर सकते हैं । कवक खतरों की पहचान जोखिम का आकलन करने और कामगार जोखिम को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । इन कवक खतरों इनडोर संदूषण, आउटडोर हवा घुसपैठ, या पर्यावरणीय गड़बड़ी है कि उन क्षेत्रों में कवक सामग्री के परिवहन में परिणाम है, जहां श्रमिकों2मौजूद है का परिणाम हो सकता है । कवक जोखिम का आकलन करने के तरीकों व्यवहार्य संस्कृति नमूना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कवक बीजाणुओं की सूक्ष्म पहचान शामिल है । इन तरीकों कई सीमाएं है और अक्सर कई कवक प्रजातियों कि समग्र कवक बोझ3के लिए योगदान हो सकता है नजरअंदाज । संस्कृति आधारित दृष्टिकोण केवल उन व्यवहार्य कवक जीवों कि पोषक तत्व मीडिया पर खेती की जा सकती है अंतर कर सकते हैं । सूक्ष्मता के माध्यम से प्रजातियों के स्तर को कवक बीजाणुओं की पहचान के समान morphologies साझा करने वाले बीजाणुओं द्वारा पाया जा सकता है । दोनों तरीकों mycologists पर अत्यधिक निर्भर है विश्लेषण और कवक प्रजातियों की पहचान, कई शेष अज्ञात के साथ ।

मौजूदा व्यावसायिक जोखिम पहचान और जोखिम आकलन में इस्तेमाल के तरीकों पर सुधार करने के लिए, कई शोधकर्ताओं आणविक आधारित प्रौद्योगिकियों के लिए बदल गया है । इनडोर और व्यावसायिक वातावरण के भीतर माइक्रोबियल विविधता का आकलन करने के लिए अनुक्रमण आधारित दृष्टिकोण इस तरह के सूक्ष्म और व्यवहार्य संस्कृति3,4 के रूप में तरीकों की तुलना में कवक प्रजातियों का सामना करना पड़ा की एक व्यापक स्पेक्ट्रम से पता चला है ,5. यहां प्रस्तुत विधि व्यावसायिक वातावरण और संभावित कवक खतरों की पहचान के लिए जीनोमिक डीएनए के निष्कर्षण के हवा नमूना वर्णन करता है । जोखिम पहचान परमाणु राइबोसोमल आंतरिक लिखित स्पेसर, या इसके, क्षेत्रों है कि कवक के बीच अत्यधिक चर रहे है अनुक्रमण द्वारा पूरा किया है और सामांयतः कवक प्रजातियों में अंतर करने के लिए इस्तेमाल कर रहे है6,7, 8,9. ऐसी कुछ प्रजातियों के रूप में व्यावसायिक सेटिंग्स में पाया कई प्रजातियों, जाति Basidiomycota से संबंधित, व्यवहार्य संस्कृति में पहचाने जाने योग्य नहीं हैं और microscopically अंतर करने के लिए मुश्किल हैं. इन कवक उच्च सापेक्ष बहुतायत में इनडोर और व्यावसायिक परिवेशों के अनुक्रमण कवक अपने क्षेत्रों में3,4,10द्वारा मूल्यांकनकेभीतर मनाया गया है । इसके अनुक्रमण इनडोर और व्यावसायिक वातावरण के भीतर का सामना करना पड़ा कवक की विविधता में अधिक से अधिक ज्ञान प्रदान की गई है ।

प्रोटोकॉल यहां वर्णित विवरण के लिए इकट्ठा, निकालने, और क्रम विश्लेषण के लिए एयरोसोल से कवक अपने क्षेत्रों बढ़ाना इस्तेमाल किया तरीकों । इस दृष्टिकोण को हवा में कण इकट्ठा करने के लिए व्यावसायिक सुरक्षा और स्वास्थ्य (NIOSH) दो चरण चक्रवात एयरोसोल नमूना के लिए राष्ट्रीय संस्थान का इस्तेमाल करता है । इस पारखी को और अलग respirable (≤ 4 µm बेधड़क व्यास) और गैर respirable (> 4 µm बेधड़क व्यास) कणों, जो इनडोर वातावरण के भीतर कवक जीवों की पहचान के लिए अनुमति देता है कि सबसे अधिक कर रहे हैं इकट्ठा करने के लिए विकसित किया गया था एक कार्यकर्ता11से सांस की संभावना । चक्रवात नमूना सहित अन्य हवा नमूना, बाजार है कि respirable रेंज (< 4 µm) फिल्टर12,13का उपयोग कर के भीतर कणों को इकट्ठा करने की क्षमता है पर उपलब्ध हैं । इसके विपरीत, NIOSH दो चरण चक्रवात एयरोसोल पारखी डिस्पोजेबल में अपने बेधड़क व्यास के आधार पर कवक प्रजातियों अलग करती है, कि तुरंत बहाव अनुप्रयोगों14के लिए संसाधित किया जा सकता है ।

जीनोमिक डीएनए निकालने की प्रक्रिया और कवक अपने क्षेत्रों बढ़ाना इस प्रोटोकॉल में विस्तृत रहे हैं । निष्कर्षण के तरीके में प्रस्तुत कवक और बैक्टीरिया से जीनोमिक डीएनए की निकासी के लिए विशेष रूप से विकसित किया गया है, के रूप में कई वाणिज्यिक किट लक्ष्य स्तनधारी कोशिकाओं, बैक्टीरिया, या विशेष रूप से15जिये. इस अध्ययन में इस्तेमाल प्राइमरों दोनों कवक इसके 1 और उसके 2 क्षेत्रों के4,5के अपने समग्र कवरेज के आधार पर चुना जाता है । इन क्षेत्रों के sequencing कई बैंक अपने दृश्यों की तुलना के लिए अनुमति देता है, उन है कि अनुक्रम अपने 1 क्षेत्र, अपने 2 क्षेत्र, या दोनों अपने 1 और उसके 2 क्षेत्रों सहित । इन तरीकों का उपयोग कर एक इनडोर सेटिंग में एकत्र हवा के नमूनों की कवक विविधता दिखाया जाता है, संघ Ascomycota और Basidiomycota के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य अनुक्रम कम प्रमुख कवक संघ से संबंधित में रखा दृश्यों की एक पर्याप्त संख्या का खुलासा, जैसे Zygomycota । इस दृष्टिकोण का उपयोग कर की पहचान की कवक दृश्यों की व्यापक विविधता खेती या माइक्रोस्कोपी की तरह पारंपरिक जोखिम पहचान के तरीके का उपयोग कर कब्जा नहीं किया जाएगा. फंगल अपने क्षेत्रों के अनुक्रमण कवक खतरों की पहचान और इनडोर और व्यावसायिक कवक जोखिम की एक बेहतर समझ के लिए अनुमति देने के लिए एक बढ़ाया विधि प्रदान करता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. NIOSH एयरोसोल नमूना तैयार करना

नोट: NIOSH एयरोसोल नमूना एक दो चरण चक्रवात एयरोसोल नमूना है कि दो नमूने ट्यूबों और एक polytetrafluoroethylene (PTFE) फिल्टर का उपयोग कर एयरोसोल एकत्र करता है ।

  1. विधानसभा से पहले, ध्यान से पारखी का निरीक्षण किया । यह सुनिश्चित करने के लिए नमूना की जांच करें क्षतिग्रस्त नहीं है, सभी शिकंजा जगह और सुखद में हैं, और दो हिस्सों द्वारा गठित सीवन चारों ओर सील टेप बरकरार है । नमूना O-अंगूठी यह सुनिश्चित करने के लिए किसी भी निक, दरारें या आंसू नहीं है और यह है कि यह सिलिकॉन तेल का एक बहुत ही प्रकाश कोटिंग है निरीक्षण किया ।
    नोट: नमूना एक polystyrene या तीन टुकड़ा फिल्टर कैसेट में ३७ mm 3 µm PTFE फ़िल्टर शामिल हैं ।
    1. आधार टुकड़ा के gridded सतह पर एक फाइबर या प्लास्टिक फ़िल्टर समर्थन पैड (फिल्टर के साथ शामिल) रखकर फिल्टर कैसेट को इकट्ठा ( चित्रा 1देखें). फ़िल्टर संदंश का उपयोग फ़िल्टर समर्थन पैड के शीर्ष पर संग्रह पक्ष के साथ ऊपर का सामना करना पड़ के साथ रखने के लिए ।
    2. एक मैनुअल या वायवीय प्रेस का उपयोग कर फिल्टर कैसेट सील. हाथ बंद हवा फिल्टर के आसपास लीक करने के लिए और संग्रह क्षमता को कम करने की अनुमति देगा । अंगूठी के आकार का टुकड़ा डालें (विस्तार काउल), और प्रेस का उपयोग करने के लिए यह नीचे धक्का कसकर और समान रूप से । फिल्टर पर काफी कसकर हवा को सुनिश्चित करने के लिए फिल्टर के आसपास रिसाव नहीं है पर विस्तार काउल नीचे प्रेस ।
      नोट: कैसेट का शीर्ष टुकड़ा उपयोग नहीं है, जबकि नमूना लेकिन फिल्टर एक बार नमूना पूरा हो गया है कवर करने के लिए बचाया जाना चाहिए ।
    3. पारखी के शीर्ष पर इकट्ठे कैसेट फिट और इसे नीचे धक्का के रूप में जहां तक संभव हो । फिल्टर कैसेट और पारखी के बाहर के आसपास 19 मिमी (3/4 इंच) टेप के एक टुकड़े लपेटें जगह में फिल्टर कैसेट पकड़ और लीक को रोकने के लिए एक बैकअप सील के रूप में कार्य करने के लिए ।
    4. पेंच प्रत्येक ट्यूब कसकर और पूरी तरह से पारखी में जब तक यह नीचे से बाहर है और एक ट्यूब के आसपास सील टेप लपेटें लीक के खिलाफ एक माध्यमिक मुहर के रूप में कार्य करने के लिए ।
      नोट: पहली ट्यूब, एक 15 एमएल के ट्यूब, एक बेधड़क व्यास के साथ गैर respirable कणों इकट्ठा > 4 µm । दूसरी ट्यूब, एक १.५ मिलीलीटर के microcentrifuge ट्यूब, 1 और 4 µm के बीच respirable कणों इकट्ठा । शेष छोटे कणों, < 1 µm, PTFE फ़िल्टर ( चित्र 2देखें) पर संग्रहीत किए जाते हैं ।
  2. फिल्टर और पारखी में मतभेद के रूप में प्रत्येक का उपयोग करने से पहले एक अंशांकन जार के साथ NIOSH पारखी के माध्यम से airflow जांचना airflow को अलग करने के लिए कारण होगा ।
    1. एक अंशांकन जार का उपयोग करने के लिए, फिल्टर कैसेट के शीर्ष में जार के Luer फिटिंग डालें, जार में पारखी जगह है, और जार सील ।
    2. एक अंशांकन प्रवाह मीटर और नमूना पंप करने के लिए अंशांकन जार कनेक्ट करें । पर प्रवाह मीटर बारी और यह कुछ मिनट के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं । ध्यान दें कि प्रवाह मीटर हमेशा एक फिल्टर अपने प्रवेश करने के लिए संलग्न करने के लिए प्रवाह मीटर दूषित और पारखी से बचने के लिए होना चाहिए ।
    3. पर नमूना पंप बारी और यह कुछ मिनट के लिए गर्म और स्थिर करने के लिए चलाने के लिए अनुमति देते हैं ।
    4. ३.५ L/मिनट पर सही प्रवाह दर निर्धारित करने के लिए पंप समायोजित करें ।
      नोट: NIOSH एयरोसोल पारखी के लिए प्रवाह की दर आमतौर पर सेट है ३.५ L/ इस प्रवाह की दर पर, पारखी ACGIH के लिए अनुरूप/respirable कण नमूना16के लिए आईएसओ मानदंड । अन्य प्रवाह दरों का इस्तेमाल किया जा सकता है अगर अलग कट-ऑफ आकार वांछित हैं या शोर के स्तर को कम करने के लिए, लेकिन पता है कि अगर एक अलग प्रवाह दर का उपयोग किया जाता है, तो पारखी अब respirable नमूना मानदंड के अनुरूप होगा.
    5. अंशांकन समाप्त होने पर, पंप और फ्लो मीटर बंद कर दें ।

2. स्थैतिक और व्यक्तिगत एयरोसोल नमूना

  1. या तो व्यक्तिगत या स्थैतिक क्षेत्र नमूना के लिए NIOSH एयरोसोल नमूना सेट करें ।
    नोट: स्थैतिक नमूना एयरोसोल नमूना का उपयोग करते हुए यह एक तिपाई या अंय होल्डिंग डिवाइस से जुड़ा हुआ है को संदर्भित करता है ( चित्रा 3देखें), के रूप में व्यक्तिगत नमूना बनाम जब पारखी और पंप व्यक्ति पर बढ़ रहे है अध्ययन किया जा रहा है (देखें चित्रा 4) ।
    1. स्थिर क्षेत्र नमूने के लिए, नमूने के रूप में विशिष्ट क्षेत्र के लिए संभव के रूप में बंद रखने का अध्ययन किया जा रहा है । नमूना हवा की सुविधा से दूर रखें, कमरे के प्रवेश द्वार और स्थानों है कि airflow के रास्ते में हो सकता है ।
      नोट: एयरोसोल सांद्रता काफी कम दूरी पर भी भिंन हो सकते हैं, खासकर यदि एयरोसोल स्रोत कमरे में है17
    2. व्यक्तिगत नमूना के लिए, व्यक्ति के श्वास क्षेत्र के भीतर पारखी सेट. अंचल, कंधे या छाती के लिए पारखी संलग्न, और कमर में या एक बैग में नमूना पंप जगह है ।
      नोट: श्वास क्षेत्र सामांयतः एक व्यक्ति की नाक जिसमें से हवा के बहुमत सांस लेना17के दौरान तैयार की है चारों ओर एक 30 सेमी गोलार्द्ध माना जाता है ।
  2. सुनिश्चित करें कि पारखी टयूबिंग नमूना की सुविधा देता है की अच्छी तरह से स्पष्ट है और कुछ भी नहीं है कि निरोधक की सुविधा देता है या पारखी में airflow के साथ हस्तक्षेप. पारखी टयूबिंग चुटकी या गुत्थी नहीं होना चाहिए । किसी भी रुकावट पंप बंद करने के लिए कारण होगा ।
  3. पंपों को चालू करें । एक या दो मिनट के बाद जांच करें कि पंप अभी भी चल रहे हैं ।
    नोट: आचरण हवा के रूप में कम से लेकर 10 मिनट के रूप में एक पूर्ण 8 एच काम शिफ्ट करने के लिए, पर्यावरण के आधार पर10,18,19चित्रा 6 में प्रस्तुत परिणाम एक इनडोर वातावरण में ६० ंयूनतम नमूना अवधि के प्रतिनिधि हैं ।
  4. हवा नमूने के बाद पूरा हो गया है, नमूना ट्यूबों और फिल्टर इकट्ठा । सील टेप निकालें, ट्यूबों unक्रू, और उंहें टोपी । फिल्टर कैसेट के तीसरे टुकड़े को फ़िल्टर पर रखें । प्रसंस्करण के लिए तैयार जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान ।

3. हवा के नमूनों से जीनोमिक डीएनए का निष्कर्षण

  1. NIOSH BC251 पारखी के प्रत्येक चरण से जीनोमिक डीएनए (gDNA) निकालें. नमूना में respirable और गैर respirable माइक्रोबियल एयरोसोल्स के निर्धारण के लिए अनुमति देने के लिए अलग से हवा नमूना संग्रह ट्यूबों और फिल्टर प्रक्रिया ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, तीन चरणों और संयुक्त किया जा सकता है अगर नमूना इनोक्युलम बहुत छोटा है निकाले ।
    1. एक वर्ग द्वितीय जैविक सुरक्षा कैबिनेट या लामिना प्रवाह स्वच्छ पीठ में, aseptically फिल्टर हटा दें । ७०% इथेनॉल का उपयोग कर नीचे नमूना कैसेट पोंछ और एक कैसेट खोलने उपकरण का उपयोग कर नमूना कैसेट खुला खोदकर । फ़िल्टर और समर्थन पैड ऊपर की ओर पुश करने के लिए एक फिल्टर लिफ्टर का उपयोग करें । फिल्टर संदंश का उपयोग कर फिल्टर समझ और यह एक बाँझ पेट्री पकवान में जगह है । 6 बराबर टुकड़ों में फिल्टर कट और उंहें एक 2 मिलीलीटर प्रबलित ट्यूब युक्त ३०० मिलीग्राम ग्लास मोती (०.२-०.५ मिमी) में जगह है ।
    2. 30 एस के लिए तरल नाइट्रोजन में फिल्टर युक्त ट्यूब प्लेस और तुरंत यह एक मनका मिल homogenizer में जगह 30 एस के लिए ४.५ मी ।
    3. दोहराएं चरण 3.1.2 एक या दो बार जब तक फिल्टर कटा हुआ है । बरकरार फिल्टर के छोटे टुकड़े रह सकते हैं । lysis बफर (4 एम यूरिया, २०० मिमी Tris, 20 मिमी NaCl, २०० मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), पीएच ७.४) के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. 15 मिलीलीटर और १.५ मिलीलीटर हवा नमूना ट्यूबों के लिए ०.३ मिलीलीटर lysis बफर जोड़ें । भंवर 10-15 एस के लिए ट्यूब जबकि ईमानदार और फिर एक और 10-15 एस औंधा । 2 मिलीलीटर प्रबलित ट्यूबों ३०० मिलीग्राम कांच मोतियों से युक्त करने के लिए प्रत्येक ट्यूब की सामग्री स्थानांतरण ।
      नोट: प्रत्येक नमूना ट्यूब में एकत्र सामग्री के अधिकांश ट्यूब के शीर्ष के पास जमा होगा ।
    5. प्रक्रिया मनका मिल homogenizer में सभी ट्यूबों 30 एस के लिए ४.५ मी पर और उंहें २०,००० x जी में 22 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक । स्थानांतरण supernatants बाँझ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के लिए और २०,००० x g पर ट्यूबों फिर से 1 मिनट के लिए 22 ° c. इस चरण को दोहराएं ।
  2. lysis रिएजेंट के 30 µ एल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) प्रत्येक ट्यूब के लिए और ३७ ° c पर ट्यूबों 15 मिनट के लिए मशीन.
  3. बाइंडिंग बफ़र की ०.२ मिलीलीटर जोड़ें (10 मीटर यूरिया, 6 एम guanidine-एचसीएल, 10 एमएम Tris-एचसीएल, 20% ट्राइटन X-१००, pH ४.४) और proteinase K (१०० µ g/एमएल) के लिए प्रत्येक ट्यूब और 10 मिनट के लिए ७० ° c पर ट्यूबों मशीन । जोड़ें १०० µ प्रत्येक ट्यूब के लिए isopropanol के एल ।
  4. ग्लास फाइबर फिल्टर ट्यूबों में निकालें समाधान स्थानांतरण (७०० µ एल क्षमता) 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों में रखा और 30 एस के लिए २०,००० एक्स जी में संग्रह ट्यूबों के केंद्रापसारक 22 डिग्री सेल्सियस । संग्रह ट्यूबों त्यागें और नए 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों में फिल्टर ट्यूबों जगह है ।
  5. अवरोधक हटाने बफर के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें (5 एम guanidine-एचसीएल, 20 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच ६.६, ३८% इथेनॉल) प्रत्येक ट्यूब के लिए और 30 एस के लिए २०,००० x g पर संग्रह ट्यूबों के केंद्रापसारक 22 डिग्री सेल्सियस । संग्रह ट्यूबों त्यागें और नए 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों में फिल्टर ट्यूबों जगह है ।
  6. (20 मिमी NaCl, 2 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच ७.५, ८०% इथेनॉल) प्रत्येक ट्यूब के लिए धोने बफर के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और 30 एस के लिए २०,००० x g पर संग्रह ट्यूबों के केंद्रापसारक 22 डिग्री सेल्सियस । संग्रह ट्यूबों त्यागें और नए 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूबों में फिल्टर ट्यूबों जगह है । इस प्रक्रिया को दोहराएँ ।
  7. २०,००० x g पर संग्रह ट्यूबों के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 1 मिनट के लिए किसी भी अवशिष्ट धोने बफर हटाने के लिए । संग्रह ट्यूबों त्यागें और नए संग्रह ट्यूबों में फिल्टर ट्यूबों जगह है ।
  8. जोड़ें १०० µ एल गर्म (≥ ७० ° c) रेफरेंस बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच ८.५) प्रत्येक ट्यूब के लिए और उन्हें कमरे के तापमान पर में मशीन 1-2 मिनट के लिए 30 एस के लिए २०,००० एक्स जी में संग्रह ट्यूबों 22 ° c. केंद्रापसारक । एक बाँझ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए खाली फिल्टर ट्यूबों स्थानांतरण और ३.८ कदम से eluates फिर से लागू. 1-2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन २०,००० एक्स जी में 30 एस के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर ।
    नोट: Eluates का उपयोग करने के लिए तैयार जब तक चरण 4 के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या पर संग्रहित-20 ° c । जीनोमिक डीएनए में एक साल तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c । यह सिफारिश की है कि डीएनए में संग्रहित किया जा-८० ° c लंबी अवधि के भंडारण की आवश्यकता है ।

4. फंगल राइबोसोमल डीएनए का प्रवर्धन

  1. यूनिवर्सल फंगल प्राइमर का प्रयोग करें अपने क्षेत्रों 1 और 2 निकाले gDNA से बढ़ाना ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, प्राइमरी जोड़ी Fun18Sf (5 '-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3 ')/ITS4R (5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ') अपने क्षेत्रों के4,5की सबसे बड़ी कवरेज प्रदान करने के लिए उपयोग किया जाता है । ऐसे उन है कि ITS1 या ITS2 क्षेत्रों अकेले बढ़ाना के रूप में अंय प्राइमर सेट, इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रियाओं (पीसीआर) तपसिल में प्रत्येक नमूने के लिए सेट करें ५० µ l प्रतिक्रियाओं में बाँझ ०.५ एमएल पीसीआर ट्यूब या ९६-खैर पीसीआर प्लेट निम्नानुसार: 5 µ l की निकाली गई टें पलेट डीएनए (चरण 3 से), ३३.३ µ l की पीसीआर ग्रेड पानी, 5 µ 10x पीसीआर बफर के एल , १.५ µ l की ५० mM MgCl2, 1 µ l के 10 एमएम 2 '-deoxynucleoside 5 '-triphosphates, ०.५ µ l के 20 µ m Fun18Sf फॉरवर्ड प्राइमरी, ०.५ µ l के 20 µ m ITS4R रिवर्स प्राइमरी, और ०.२ µ l के Taq DNA पोलीमरेज़.
    2. एक थर्मल साइकिल चालक में प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन: 3 मिनट के लिए ९५ ° c पर विकार; विकार के 6 चक्र (९६ ° c, 30 s) एनीलिंग (५० ° c, ४५ s) और प्राइमर विस्तार (७२ ° c, 3 min); विकार के 20 चक्र (९६ ° c, 30 s), एनीलिंग (५० ° c, ४५ s), और प्राइमर विस्तार (७२ ° c, 1 min); और प्राइमर विस्तार पर ७२ ° c 10 मिनट के लिए, अगले कदम तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण रखें ।
  2. तपसिल पीसीआर प्रतिक्रियाओं का मिश्रण एक सिलिका झिल्ली आधारित शोधन किट का उपयोग कर शुद्ध ।
    नोट: यह प्रक्रिया पीसीआर घटकों (प्राइमरों, dNTPs, एंजाइमों, लवण, आदि) और प्रवर्धित डीएनए तैयारियों से अन्य दूषित पदार्थों को हटाने के लिए अनुमति देती है ।
    1. प्रत्येक नमूने के लिए तीन प्रतिक्रियाओं का मिश्रण (१५० µ l कुल) बाँझ में १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों. एक 5x वॉल्यूम (७५० µ l) पर बाइंडिंग बफ़र (5 M guanidine-HCl, 30% isopropanol) जोड़ें और समाधान को दस बार ऊपर और नीचे pipetting करके मिलाएं ।
    2. मिश्रण के ४५० µ एल जोड़ें कॉलम संग्रह ट्यूबों में रखा स्पिन और 30 एस के लिए १७,९०० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक छोड़ो । शेष ४५० µ l को स्तंभों में जोड़ें और 30 एस के लिए १७,९०० x g पर 22 ° c पर केंद्रापसारक करें ।
      नोट: स्पिन कॉलम में एक सिलिका झिल्ली होती है जो डीएनए के स्तंभों को सोखना के लिए अनुमति देती है ।
    3. छानने का त्याग और स्पिन कॉलम के लिए ७५० µ एल धोने बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच ७.५, ८०% इथेनॉल) जोड़ें । 30 एस के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर १७,९०० x g पर कॉलम केंद्रापसारक ।
      नोट: इस प्रक्रिया के ऊपर वर्णित पीसीआर प्रतिक्रिया से संदूषणों को हटा ।
    4. छानने का त्याग करें और १७,९०० x g पर खाली स्तंभों को 1 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक ।
      नोट: इस कदम के बहाव अनुप्रयोगों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि किसी भी अवशिष्ट धोने बफर को दूर करने के लिए है ।
    5. हस्तांतरण करने के लिए स्पिन कॉलम बाँझ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों. रेफरेंस बफर के ४५ µ एल जोड़ें (10 मिमी Tris-सीएल, पीएच ८.५) और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों की मशीन 22 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए १७,९०० x जी में स्पिन कॉलम केंद्रापसारक ।
    6. eluted डीएनए का उपयोग तुरंत चरण 4 और 5 या स्टोर के लिए-20 ° c जब तक उपयोग के लिए तैयार है ।
      नोट: amplicons के लिए एक वर्ष के लिए संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c । यह सिफारिश की है कि डीएनए में संग्रहित किया जा-८० ° c लंबी अवधि के भंडारण की आवश्यकता है ।

5. कवक का सत्यापन इसके प्रवर्धन agarose जेल ट्रो का उपयोग

  1. 1 µ g/mL ethidium ब्रोमाइड युक्त 1% agarose जेल डाले । उबलते में agarose भंग 1x Tris-एसीटेट-EDTA (ताे) बफर । एक बार समाधान लगभग ५० डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा है, ethidium ब्रोमाइड जोड़ें और जेल कास्ट में डालना ।
  2. agarose जेल जम जाने के बाद, 1x ताे में जेल को विसर्जित करें और amplicons को जेल पर लोड करने की तैयारी करें । प्रवर्धित डीएनए के 8 µ एल, 5x लोडिंग बफर के 2 µ एल जोड़ें ।
    नोट: इन संस्करणों वांछित लोड हो रहा है बफर की एकाग्रता के आधार पर समायोजित किया जा सकता है ।
  3. नमूने लोड, सभी 10 µ एल, आकार संदर्भ के लिए एक डीएनए सीढ़ी के साथ साथ जेल पर । लगभग ९० मिनट और visualize बैंड, आम तौर पर ७५० और १,००० आधार जोड़े के बीच देखा, पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग ( चित्रा 5देखें) के लिए ७५ वी (6 वी/

6. फफूंद अपने क्षेत्रों के अनुक्रमण और विश्लेषण

  1. अनुक्रम निकाली gDNA या प्रवर्धित कवक अपने क्षेत्रों और वर्तमान और उचित तरीकों का उपयोग कर दृश्यों का विश्लेषण ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

एक वातावरण के भीतर प्रजातियों के वितरण के प्रत्येक ओटू हवा के नमूनों में पहचान की क्लोन की संख्या का निर्धारण करके सापेक्ष बहुतायत का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । चित्रा 6 एक क्रोना हवा नमूने के ६० मिनट के बाद एक इनडोर वातावरण के भीतर taxonomically रखा प्रजातियों का प्रतिनिधित्व चार्ट है । यह देखा जा सकता है कि पर्यावरण दो प्रमुख कवक संघ, Ascomycota और Basidiomycota के भीतर प्रजातियों की एक किस्म है, साथ ही प्रजातियों के रूप में जाति Zygomycota (Rhizopus microsporus) से संबंधित । मूल्यांकन के पारंपरिक तरीकों Ascomycota प्रजातियों की ओर पक्षपातपूर्ण हैं, के रूप में कई Basidiomycota culturable नहीं कर रहे है या सूक्ष्म आधारित तरीकों का उपयोग कर विभेदित नहीं किया जा सकता है । फफूंद अपने क्षेत्रों के अनुक्रमण कई कवक प्रजातियों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, विशेष रूप से कुछ Basidiomycota, कि अक्सर पता नहीं चला जाना. इस वातावरण के विश्लेषण से पता चलता है कवक के ६८% की पहचान की है उनमें से ज्यादातर के साथ Basidiomycota से संबंधित क्रम Polyporales में रखा ।

वर्गीकरण डेटा sequencing-आधारित approaches का उपयोग कर प्राप्त एक वातावरण में वर्गीकरण विविधता निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । ऐसी तालिका 1 में प्रस्तुत उन के रूप में विविधता सूचकांक, निर्धारित कैसे पर्यावरण समृद्ध है, जो प्रत्येक नमूने में पहचान की प्रजातियों की संख्या का वर्णन है, साथ ही साथ कैसे विविध पर्यावरण है, जो खाते में प्रजातियों की संख्या और की बहुतायत लेता है प्रत्येक. तालिका 1 दो इनडोर वातावरण के लिए चाओ 1 समृद्धि सूचकांक और शैनन विविधता सूचकांक से पता चलता है । सूचकांक वाष्पीकरण कूलर वातावरण की तुलना में अधिक समृद्धि और वातानुकूलित वातावरण में विविधता का संकेत है । भी शामिल ब्रे-कर्टिस समानता गुणांक हैं । ये वर्णन कैसे वातावरण के भीतर भिंन नमूने प्रत्येक नमूने के भीतर की पहचान की प्रजातियों के बारे में हैं । दोनों 1 तालिका में वर्णित वातावरण के भीतर नमूने उच्च ९८% और हवा कंडीशनर और वाष्पीकरण कूलर वातावरण के लिए ९७%, क्रमशः में भिंन हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: एक तीन टुकड़ा फिल्टर कैसेट विधानसभा के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । फिल्टर कैसेट तीन टुकड़ों से बना है: एक शीर्ष या टोपी टुकड़ा (प्रवेश), एक विस्तार काउल और एक आधार टुकड़ा (आउटलेट) । एक समर्थन पैड और फिल्टर आधार टुकड़ा की gridded सतह पर रखा जाता है । एक्सटेंशन काउल तो एक मैनुअल या वायवीय प्रेस का उपयोग कर आधार पर सील है । NIOSH एयरोसोल चक्रवात नमूना के साथ प्रयोग के लिए, शीर्ष टुकड़ा नमूना के दौरान बंद कर दिया जाता है और फिर भंडारण और परिवहन के लिए जगह है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: NIOSH एयरोसोल चक्रवात नमूना के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. NIOSH चक्रवात एयरोसोल नमूना प्रवेश के माध्यम से पारखी में हवा ड्राइंग द्वारा हवाई कण इकट्ठा, और नमूना ट्यूबों की दीवार पर जमा कणों कि एक चक्रवात का निर्माण. हवा पहले एक 15 मिलीलीटर में तैयार की है ट्यूब, जहां बड़े कणों (> 4 µm) ट्यूब की दीवारों पर इकट्ठा । हवा तो पहले ट्यूब से बाहर बहती है और एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब, जहां छोटे कणों (1 से 4 µm) इकट्ठा में तैयार की है । शेष कण (< 1 µm) एक PTFE फ़िल्टर पर एकत्रित होते है क्योंकि हवा पारखी से बाहर खींची जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: एक स्थिर नमूना सेट-अप का उदाहरण. छवि नमूना स्थिर क्षेत्र नमूने के लिए सेट को दर्शाता है । NIOSH नमूना स्थापित कर रहे हैं ४० इंच (१०२ सेमी) और ६० इंच (१५२ सेमी) मंजिल से, एक बैठे और खड़े वयस्क की ऊंचाइयों का प्रतिनिधित्व करने के लिए क्रमशः इकट्ठा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एक व्यक्तिगत पारखी विधानसभा का उदाहरण. छवि एक NIOSH एक व्यक्ति द्वारा एक बैग पर पहना पारखी दिखाता है । नमूना और बिजली स्विच पैक की पट्टियों पर स्थित हैं, जबकि नमूना पंप बैग के भीतर ही स्थित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एक agarose जेल visualizing के उदाहरण हवा के नमूनों से अपने डीएनए परिवर्धित । छवि ७५० और १,००० आधार जोड़े के बीच डीएनए बैंड से पता चलता है । ये बैंड निकाले हवा के नमूनों से परिवर्धित कवक अपने क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं । इसके क्षेत्रों प्रजातियों मूल के आधार पर आकार में बदलती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: उदाहरण क्रोना taxonomically रखा कवक एक इनडोर वातावरण के भीतर की पहचान की प्रजातियों में पेश चार्ट । क्रोना चार्ट NIOSH एयरोसोल चक्रवात नमूना के साथ एक ६० मिनट हवा नमूना अवधि के बाद घरों से एकत्र 4 नमूनों में पाया कवक प्रजातियों के सापेक्ष बहुतायत को दर्शाया गया है । ६८% की पहचान की प्रजातियों के Ascomycota से संबंधित शेष के साथ जाति Basidiomycota से संबंधित है (३३%) और Zygomycota (1%) । इस वातावरण में सबसे प्रचुर मात्रा में अपने दृश्यों के आदेश Polyporales से संबंधित है और Phanerodontia chrysosporium और Gelatoporia dichroaके रूप में पहचान की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चाओ-1 समृद्धि शैनन विविधता ब्रे-कर्टिस दूरी
मतलब (मिनट, अधिकतम) मतलब (मिनट, अधिकतम) मतलब (मिनट, अधिकतम)
एयर कंडीशनर (एन = 9) ३३.८६ (१५.०, १०२.०) १.३९ (०.६८, २.५१) ०.९७७८ (०.८३१३, १.००)
वाष्पीकरण कूलर (n = 10) २५.४६ (१२.५, ४९.५) १.१० (०.५०, १.७२) ०.९६२४ (०.३८०४, १.००)

तालिका 1: उदाहरण डेटा प्रस्तुत विविधता और प्रजातियों के इनडोर वातावरण की तुलना में समृद्धि सूचकांक । तालिका चाओ 1 समृद्धि सूचकांक (नमूना प्रति प्रजातियों की संख्या) से पता चलता है, शैनन विविधता सूचकांक (प्रजातियों और प्रत्येक की बहुतायत की संख्या), और ब्रे-कर्टिस समानता गुणांक (कैसे भिंन प्रजातियों के वितरण 0-1 के पैमाने पर नमूनों के बीच है) । इन आंकड़ों में उच्च समृद्धि और वातानुकूलित वातावरण और दोनों वातावरण में नमूनों के बीच उच्च समानता में विविधता का प्रदर्शन । इस तालिका को लेमन्स एट अलसे संशोधित किया गया है । रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ 10

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

एक व्यावसायिक वातावरण के भीतर कवक विविधता का निर्धारण sequencing आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कवक खतरा पहचान और जोखिम आकलन में सुधार हुआ है । इस दृष्टिकोण का उपयोग कई अतिरिक्त कवक प्रजातियों का पता लगाने के लिए अनुमति दी है कि अक्सर संस्कृति या सूक्ष्म आधारित मूल्यांकन के तरीकों का उपयोग नहीं पता चला रहे हैं । व्यावसायिक और इनडोर वातावरण से और इसके प्रवर्धन और अनुक्रमण के लिए हवा के नमूनों से जीनोमिक डीएनए की निकासी के नमूने के लिए एक विधि यहां प्रस्तुत किया है । कवक विविधता के निर्धारण इन तरीकों का उपयोग पर अत्यधिक निर्भर है: (1) हवा के नमूनों से जीनोमिक डीएनए के सफल और पूर्ण निष्कर्षण, (2) प्राइमरों के साथ gDNA के प्रवर्धन कि प्रवर्धित अपने जुगाड़ की तुलना के लिए अनुमति देने के लिए बैंक डेटाबेस में अनुक्रम और सीमा प्रवर्धन पूर्वाग्रहों, और (3) डेटाबेस के भीतर अनुक्रम के वर्गीकरण की पहचान सही है ।

सफल जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण निष्कर्षण के तरीके और एक अध्ययन में कार्यरत रिएजेंट पर निर्भर है । के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, के एक बहुत जैव एयरोसोल और अंय जैविक और गैर जैविक NIOSH के ट्यूब चरणों में एकत्र कण दो चरण चक्रवात नमूना ट्यूब के शीर्ष पर इकट्ठा । यह बहुत महत्वपूर्ण है कि ट्यूबों ध्यान से खोला जब lysis बफर जोड़ने के रूप में किसी भी कण खोने के लिए नहीं है और वे एक तरह से है कि सभी के लिए अनुमति देता में भंवर हो lysis बफर में गिर कण (दाईं ओर ऊपर और उल्टा) । यह भी महत्वपूर्ण है कि फिल्टर ध्यान से अपूतित तरीकों का उपयोग कर के रूप में किसी भी है कि सतह पर एकत्र किया है कि निष्कर्षण या दूषित डीएनए परिचय से पहले बाधित नहीं संभाला है । यह प्रदर्शित किया गया है कि वहां व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट के कई के बीच भिंनता की एक बड़ी राशि है15। कुछ निष्कर्षण प्रक्रियाओं विशिष्ट कवक प्रजातियों और अलग डीएनए पैदावार20में परिणाम की ओर पूर्वाग्रह । यदि निंन निष्कर्षण के बाद डीएनए उपज कम है, उच्च पीसीआर प्रतिक्रिया प्रतिकृति किया जा सकता है । न केवल निष्कर्षण पैदावार बदलती हैं, लेकिन किट के कई माइक्रोबियल डीएनए संदूषण की एक पर्याप्त राशि का योगदान । इस कारण के लिए, यह पहचान करने के लिए और विश्लेषण से संभावित रिएजेंट दूषित पदार्थों को निकालने के लिए प्रक्रिया में उचित नियंत्रण शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

इसका प्रवर्धन प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम है. निष्कर्षण के तरीके का इस्तेमाल किया उनके लिए पर्यावरणीय नमूनों से पीसीआर अवरोधकों को दूर करने की क्षमता में भिंन हो सकते हैं । यह विशेष रूप से पर्यावरण धूल के नमूनों के साथ21से संबंधित है । पीसीआर प्रस्तुत की विधि का उपयोग कर निकाले गए नमूनों का प्रवर्धन यहां प्रदर्शित कुछ पीसीआर निषेध के अलावा के बाद 10 धूल की मिलीग्राम15. हालांकि पीसीआर निषेध पर्यावरण धूल के नमूनों में सबसे बड़ी चिंता का विषय है, यह अभी भी एक विचार जब कवक विविधता का निर्धारण करने के लिए हवा के नमूनों से निकाले डीएनए बढ़ाना चाहिए । इस विधि में प्रयुक्त पीसीआर प्राइमर सेट अपने 1 और उसके 2 क्षेत्रों दोनों के कवरेज प्रदान करता है । यह अनुक्रम डेटाबेस में रखा अनुक्रम के कई करने के लिए तुलना के लिए अनुमति देता है । निष्कर्षण प्रक्रिया के साथ के रूप में, कई प्रवर्धन और प्राइमर पूर्वाग्रहों पहले22वर्णित किया गया है । कवक जीनोम आकार और जीन की नकल नंबर भी अपनी प्रवर्धन23प्रभावित कर सकता है । परिणामी अनुक्रम डेटा की व्याख्या करते समय इन पूर्वाग्रहों को ध्यान में रखा जाना चाहिए । वर्गीकरण अपने दृश्यों की पहचान शायद इस पद्धति का सबसे महत्वपूर्ण घटक है । यह पहचान मानदंड सुसंगत रखने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके जुगाड़ को पहचानने की क्षमता डेटाबेस में बैंकेड जुगाड़ पर निर्भर है । कई जुगाड़ से प्रजातियों के स्तर को पहचाना नहीं जा सकता । विशिष्ट मापदंड होने जब वर्गीकरण पहचान के आधार पर बैंक अनुक्रम, प्रतिशत पहचान कटऑफ की तरह बनाने, अध्ययन करने के लिए अध्ययन से संगत डेटासेट रखने के लिए महत्वपूर्ण है.

पारंपरिक आकलन दृष्टिकोण की तुलना में, निकालने और व्यावसायिक हवा के नमूनों से फंगल डीएनए sequencing एक वातावरण के भीतर कवक विविधता का एक और अधिक पूरा प्रतिनिधित्व प्रदान करता है । इसके बाद के संस्करण पर चर्चा की सीमाओं के अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विश्लेषण के इन प्रकार के परिणाम संस्कृति के विपरीत अर्द्ध मात्रात्मक हैं, बीजाणु मायने रखता है, या मात्रात्मक पीसीआर24 जो मात्रात्मक डेटा प्राप्त कर सकते हैं । sequencing डेटा नमूने प्रति सापेक्ष बहुतायत निर्धारित करने के साथ ही कवक विविधता मैट्रिक्स की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन तरीकों को और अधिक quantifiable डेटा प्राप्त करने के लिए, qPCR जैसे अंय तरीकों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इन तरीकों का उपयोग कर बनाया डेटासेट विशिष्ट व्यावसायिक वातावरण में कवक खतरों का एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए व्यावसायिक स्वास्थ्य अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है । निष्कर्षण और प्राइमर चयन के अधिक मानकीकृत दृष्टिकोण का विकास बेहतर विशेषताएं और फंगल विविधता के अनुक्रमण आधारित अध्ययन की तुलना करने के लिए आवश्यक हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

इस रिपोर्ट में निष्कर्षों और निष्कर्ष लेखकों के हैं और यह जरूरी व्यावसायिक सुरक्षा और स्वास्थ्य, रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र के लिए राष्ट्रीय संस्थान की आधिकारिक स्थिति का प्रतिनिधित्व नहीं करते ।

Acknowledgments

यह काम NIOSH और NIEHS (AES12007001-1-0-6) के बीच एक एजेंसी के समझौते के हिस्से में समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler NIOSH BC251 The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps Fisher Scientific 02-681-373 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352096 15 mL polypropylene tubes for air sampling
Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width McMaster-Carr 76505A1 sealing tape
Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm SKC Inc. 225-3LF 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs
PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm EMD Millipore FSLW03700 Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads
Fisherbrand filter forceps Fisher Scientific 09-753-50 filter forceps
Model 502 Precision PanaPress PanaVise 502 pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press
Scotch Super 33+ vinyl electrical tape McMaster-Carr 76455A21 19 mm tape
Multi-purpose Calibration Jar, Large SKC Inc. 225-112 calibration jar
Universal PCXR4 Sample Pump SKC Inc. 224-PCXR4 sampling pump
Mass Flowmeter 4140 TSI Inc. 4140 flow meter
Roche High Pure PCR Template Kit Roche Diagnostics 11796828001 Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes
Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps Fisher Scientific 15340162 2 mL reinforced tubes for bead homogenization
Glass beads, acid washed, 212-300 µm Sigma-Aldrich G1277 glass beads
Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer Fisher Scientific 15-340-163 bead homogenizer
CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X Sigma-Aldrich C8740 lysis reagent
Platinum Taq polymerase Invitrogen 10966-018 Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender
dNTP Mix Invitrogen 18427-088 10 mM dNTP mix
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye
Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System Thermo Fisher B1 or B2
TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder Thermo Fisher 10488-085 DNA ladder

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119, (6), 748-756 (2011).
  2. Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14, (4), 285-293 (2017).
  3. Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. (2016).
  4. Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74, (1), 233-244 (2008).
  5. Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16, (1), 33-43 (2014).
  6. Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
  7. Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84, (1), 165-175 (2013).
  8. Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9, (6), e97629 (2014).
  9. Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7, (7), e40863 (2012).
  10. Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. (2017).
  11. Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13, (12), 3321-3328 (2011).
  12. Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11, (12), D215-D219 (2014).
  13. Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10, (3), e0120308 (2015).
  14. Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8, (11), 1136-1142 (2006).
  15. Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14, (3), 766-774 (2012).
  16. ACGIH. Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).
  17. Rodes, C. E., Thornburg, J. W. Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. Ruzer, L. S., Harley, N. H. CRC Press. (2005).
  18. Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13, (10), D159-D165 (2016).
  19. Couch, J., et al. Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).
  20. Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75, (16), 5428-5433 (2009).
  21. Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7, (4), 311-318 (2005).
  22. Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
  23. Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61, (7), 2798-2801 (1995).
  24. Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49, (8), 829-833 (2007).
संग्रह और कवक डीएनए के विश्लेषण के लिए व्यावसायिक हवा के नमूनों की निकासी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).More

Lemons, A. R., Lindsley, W. G., Green, B. J. Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA. J. Vis. Exp. (135), e56730, doi:10.3791/56730 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter