Summary
Denne protokol beskriver en metode til at opnå stabile integration af et gen af interesse i det menneskelige genom transcriptionally regulerede Tornerose systemet. Forberedelse af integrationen af defekte lentiviral vektorer, in vitro- transduktion af menneskelige celler og molekylær analysen på transduced celler er rapporteret.
Abstract
Tornerose (SB) transposon er en ikke-virale integrere systemet med dokumenteret effekt for overførsel af gener og funktionel genomforskning. For at optimere SB transposon maskiner, er en transcriptionally regulerede hyperaktive transposase (SB100X) og T2-baserede transposon ansat. Typisk transposase og transposon leveres forbigående af plasmid Transfektion og SB100X udtryk er drevet af en konstitutiv promotor. Her beskriver vi en effektiv metode til at levere SB komponenter til humane celler, der er resistente over for flere fysiske og kemiske Transfektion metoder, til at styre SB100X udtryk og stabilt integrere et gen af interesse (GOI) gennem en "klippe og klistre" SB mekanisme. Udtryk for hyperaktive transposase styres stramt af Tet-ON system, almindeligt anvendt til at kontrollere genekspression siden 1992. Gen af interesse er flankeret af inverteret gentagelser (IR) af T2 transposon. Begge SB komponenter er pakket i integration defekte lentiviral vektorer forbigående produceret i HEK293T celler. Menneskelige celler, enten cellelinjer eller primærelementer fra humant væv, er i vitro forbigående transduced med virale vektorer. Efter tilsætning af doxycyclin (dox, tetracyklin analog) ind i substratet, en finjustering af transposase udtryk er målt og resulterer i en varig integration af gen af interesse i genomet af de behandlede celler. Denne metode er effektiv og gælder for cellelinje (fx HeLa celler) og primærelementer (fx, menneskelig primær keratinocytter), og udgør således et værdifuldt redskab for genteknologi og terapeutiske genoverførsel.
Introduction
Den hyperaktive SB100X transposase koblet til T2-baserede transposon er allerede blevet brugt i prækliniske gene therapy programmer1,2,3, genom ændringer4,5, og induceret pluripotente stamceller (iPSC) omprogrammering6,7. Typisk, SB komponenter leveres forbigående af plasmid Transfektion og en stærk konstitutive promoter drev udtryk for transposase. Dog trods forbedrede nye metoder af Transfektion levering af to-komponent-systemet er fortsat en udfordring for mange applikationer. Således er har udviklingen af en ny levering protokol stigende interesse. Udover Transfektion metoder for plasmid8 og mRNA9, viral levering baseret på adenoviral10,11, adeno-associeret virus (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 og lentiviral vektorer15 er blevet foreslået i tidligere. Navnlig, skal det foretrukne system garantere en forbigående levering af SB komponenter uden integration af den virale vektor. Ikke desto mindre, den konstituerende udtryk af transposase rejser sikkerhedsproblemer på grund af risikoen for ukontrollerbare rehopping af transposon.
Transkriptionel regulering af SB100X af en raffineret Tet-ON system er derfor den første udfordring. En modificeret Tet-responderende promotor, opnås ved at erstatte den oprindelige udviklede minimal cytomegalovirus (CMV) promotor med minimal promotor (-81) af Timidine Kinase (TK) genet af Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1)16, er klonet opstrøms af den SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). De muterede reverse-tetracyklin-transaktivatoren rtTA2s-M217 udtrykkes under kontrol af den stærke konstitutive promoter (fosfoglycerat promotor, PGK) klonet i en anderledes plasmid (pCCL-PGKrtTA2S-M2). Når føjet til næringssubstratet, dox binder rtTA2s-M2 modulator og bindsler Tet promotor komplekse eller resulterende i stramt reguleret induktion af SB100X udtryk18.
Den anden store udfordring opstår fra den ineffektive Transfektion af humane celler, primære af flere fysiske og kemiske metoder. Effektivt levere transposase i humane celler resistent mod Transfektion, SB100X og rtTA2s-M2 udtryk kassetter er pakket ind i to integration defekte lentiviral vektorer (IDLVs)19: IDLVTKSB og IDLVrtTA2s- M2. Virale vektorer er forbigående produceret som tredje generation vektorer i HEK293T celler20 og pseudotyped med glykoprotein G af mund Stomatitis Virus (VSV-G), som giver et bredt spektrum af infektion. Vektor partikler er koncentreret af ultracentrifugering og titreres af HIV-1 Gag p24 immunocapture. For at transduce cellelinjer og primærelementer, vektor partikler er kompleksbundet med polybrene og inkuberes med target-cellerne i tilstedeværelse eller fravær af dox. Stof-afhængige aktivering af SB100X udtryk i transduced celler er målt ved kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR)18.
Når Tet-regulerede SB100X udtryk er demonstreret, følger gennemførelse af den indiske regering (fx grøn fluorescerende proteiner, normal god landbrugspraksis) i target cell genom de molekylære begivenheder klart skematiserede Bak og Mikkelsen21. En tredje IDLV vektor transporterer et udtryk kassette for den indiske regering klonet mellem T2-transposon IRs (IDLVT2) har skal være konstrueret og pakket som nævnt ovenfor. Endelig, de tre IDLV vektorer kan bruges til effektivt transduce menneskelige celler (f.eks. primære keratinocytter) in vitro- og integrere den indiske regering i overværelse af doxycyclin18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plasmider ansat
Bemærk: Plasmidet pCCL-PGKrtTA2S-M2 blev venligst leveret af Prof. Zappavigna (universitetet i Modena og Reggio Emilia, Modena, Italien). PCMVSB100X plasmid transporterer den kodende sekvens af hyperaktive transposase og pT2/BH transposon plasmid blev venligst leveret af Prof. Z. Ivics (Paul Ehrlich instituttet, Langen, Tyskland) og Prof. Z. Izvak (Max Delbruck Center for Molekylær medicin, Berlin, Tyskland).
- For alle kloning i Escherichia Coli (E. coli), Følg den kloning strategi af valg og begrænsning enzym procedure eller PCR-amplifikation af fragment at blive klonet.
Bemærk: Tabel 1 opsummerer alle plasmider ansat i denne protokol. Er der en beskrivelse og referencer til hver plasmid.
2. viral vektor produktion
Bemærk: Alle de virale vektorer er produceret i en biohazard hætte på et BSL2 biosikkerhed indeslutningsniveau, institutionelle regler og forordninger.
- Kultur vedhængende HEK293T celler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium suppleret med 10% HyClone serum, 100 U/mL penicillin-streptomycin og 2 mM glutamin.
- Dag 0: Forberede fem 15 cm plader/viral forberedelse og frø 5.5x106 celler i 30 mL af substratet.
- Dag 1: Transfektion
- Før du starter Transfektion, forberede 100 mL 2 x HEPES buffer kogsaltopløsning (HBS):
NaCl (5 M) 5,6 mL
HEPES (1 M) 10,0 mL
Na2HPO4 (0,5 M) 0,3 mL
Sterilt vand 84.1 mL
Justeres til pH 7.1 med 37% HCl.
Bemærk: 2 x HBS kan opbevares ved 4 ° C. En nøjagtig pH er ekstremt vigtigt for effektiv Transfektion. Rækken optimale pH er 7,10 til 7.12. - Fjern mediet og tilsæt 22,5 mL/tallerken med frisk medium 4 h før Transfektion.
- Transfect HEK293T celler med overførsel plasmid, pMD.Lg/pRRE.D64VInt emballage plasmid, pMD2.G kuvert-kodning plasmid og pRSV-Rev (tabel 1) Ifølge den følgende beløb/plade:
overføre plasmid 25,00 µg
pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16,25 µg
pMD2.G 8,75 µg
pRSV-Rev 6.25 µg
Bemærk: Plasmid DNAs er tilberedt efter CsCl protokollen beskrevet af Maniatis22 eller ved hjælp af en endotoxin-fri plasmid rensning kit.- Resuspend 56,25 µg af DNA (blanding af 4 plasmider) i 1,125 mL sterilt vand og tilsæt 125 µL af 2,5 M CaCl2 (opløsning A).
- Tilføje 1.250 mL 2 x HBS til en steril 15 mL konisk centrifugeglas (løsning B).
- Tilføje løsning en (1.250 mL) til B (1.250 mL) dråbevis mens boblende med 1 eller 2 mL pipette (Transfektion løsning, samlede volumen 2.500 mL).
- Ruger i 20 min. ved stuetemperatur (RT).
- Bruger en P1000 mikropipette, distribuere alle Transfektion løsning (2.500 mL) til celle éncellelag dråbevis.
- Der inkuberes natten over i en celle kultur inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
- Før du starter Transfektion, forberede 100 mL 2 x HEPES buffer kogsaltopløsning (HBS):
- Dag 2: Fjern mediet og der tilsættes 15 mL frisk medium (Se trin 2.1).
- Dag 3: Indsamle og koncentrere lentiviral partikel-holdige supernatanten.
- Indsamle supernatanten (~ 70 mL) fra alle (n = 5) transfekteret celle plader, filtreres gennem et 0,45 µm PESS filter og fylde 2 polyallomer rør (1-tommer x 3,5 inches) / viral forberedelse.
- Koncentrere vektor partikler af ultracentrifugering ved 106.000 x g i 2,5 timer, ved 15 ° C med bremse.
- Umiddelbart efter forsigtigt at stoppe ultracentrifugering (for at undgå ophvirvling af toerstoffet i røret), hæld supernatanten i en beholder, der indeholder 10% blegemiddel og suspendere de 2 knap synlige pellets i 100 µL 1 x PBS (+ 1% BSA). Dette er normalt, da pelleten er klar og meget små. Bruge den koncentrerede vektor frisklavede, eller alikvot og gemme viral præparater ved-80 ° C.
Forsigtig: Supernatanten indeholder lentiviral partikler, der skal være bleget grundigt før udsmid i smittefarligt affald.
- For at titrere viral vektor forberedelse, bruge en HIV-1 Gag p24 immunocapture kit efter producentens protokol.
Bemærk: For at standardisere viral vektor produktion, Liposomer-baserede reagenser kunne være ansat. Viral vektor titer er imidlertid stærkt afhængig af Transfektion effektivitet og renhed af plasmid DNA.
3. transduktion af menneskelige cellelinjer (fx HeLa celler)
Bemærk: HeLa celler er kulturperler i Dulbeccos modificerede Eagle medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 100 U/mL penicillin-streptomycin og 2 mM glutamin. Tabel 1 sammenfatter alle vektorer ansat i denne protokol. En beskrivelse af hver vektor er fastsat. Transduktion af HeLa celler giver mulighed for verifikation af transkriptionel regulering af SB transposase i den bedste dosis-kombination af de to IDLV vektorer. Variation af IDLV doser kan være relateret til vektor partikel titrering og target celletype.
- Dag 0: Frø 2 x 105 celler i 3 mL af medium til hver brønd med en 6-godt plade. Forbered 4 brønde.
- Dag 1: Transduktion af HeLa celler.
- For hver betingelse, fortyndes lentiviral vektorer til en endelige mængden af 1 mL medium (se bemærkning ovenfor) i nærværelse af 10 μL polybrene (slutkoncentration 8 μg/mL):
Fortynding for godt #1: mock transduced celler (negativ kontrol).
Fortynding for godt #2: IDLVTKSB vektor (2.600 ng af p24).
Fortynding for wells #3, #4: IDLVTKSB vektor (2.600 ng af p24) + IDLVrtTA2s-M2 vektor (9.600 ng af p24). - Fjern mediet fra hver brønd hvor HeLa celler blev forgyldt på dag 0 og tilføje lentiviral vektor fortyndinger til de tilsvarende godt.
- Spinoculate 6-godt pladen på 754 x g for 45 min på 20-25 ° C, og derefter overføre 6-godt pladen til en celle kultur inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Efter 6 h, erstatte de medium indeholdende vektorer med friske medium i alle brønde og tilføje doxycyclin til 1 μM i godt #4. Læg pladen i en celle kultur inkubator ved 37 ° C for 48 h.
- For hver betingelse, fortyndes lentiviral vektorer til en endelige mængden af 1 mL medium (se bemærkning ovenfor) i nærværelse af 10 μL polybrene (slutkoncentration 8 μg/mL):
- Dag 3: Forberedelse af celle pellet for RNA udvinding.
- Før afmontering celler, forberede en trypsin brugsopløsning (1 x):
2,5% trypsin (10 x) 5,0 mL
500 mM EDTA (slutkoncentration = 5 mM) 0,5 mL
1 x PBS 44,5 mL - Varm trypsin brugsopløsning ved 37 ° C før brug. Gemme trypsin brugsopløsning ved 4 ° C.
- Fjerne medium og vaske cellerne med 1 x PBS. Tilsæt 0,5 mL af pre varmede 37 ° C trypsin brugsopløsning til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 7 min (i en celle kultur inkubator).
- Efter inkubation, tilsættes 0,5 mL serum-holdige medium til hver brønd til at inaktivere trypsin og indsamle celler i et centrifugeglas. Skyl hver godt en gang med 3 mL 1 x PBS, og centrifugeres cellesuspension i 5 min ved 240 x g.
- Vaske cellerne med 5 mL af 1 x PBS, centrifugeres i 5 min ved 240 x g og kassér supernatanten. Brug frisk indsamlede celle pellets eller opbevares ved-80 ° C. Uddrag total RNA fra pellets til at udføre semi-kvantitative RT-PCR (Se trin 6).
- Før afmontering celler, forberede en trypsin brugsopløsning (1 x):
4. transduktion af menneskelige primærelementer (fx keratinocytter)
Bemærk: Menneskelige primære keratinocytter udsås på lethally bestrålede 3T3-J2 celler (feeder lag)23, en slags gave fra Yan Barrandon (EPFL, Lausanne, Schweiz).
- Vokse schweiziske mus 3T3-J2 celler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium suppleret med 10% donor bovint serum, 50 U/mL penicillin-streptomycin og 4 mM glutamin (3T3 medium).
- Vokse keratinocytter belagt på lethally bestrålede 3T3-J2 celler i cFAD medium, en Dulbecco ændret Eagle Medium og Hams F12 media blanding (3:1), der indeholder føtal bovint serum (10%), penicillin-streptomycin (1%), Glutamin (2%), insulin (5 µg/mL), adenin ( 0.18 mM), hydrocortison (0,4 µg/mL), kolera toksin (0,1 nM), og triiodothyronin (2 nM).
- Dag 0: Seed 3 x 105 lethally bestrålet 3T3-J2 celler, tidligere fortyndet i 3T3 medium til en endelig koncentration på 1 X 105 celler/mL, i hver brønd af 6-godt plade. Forberede 9 brønde.
- Dag 1: Transduktion af primære keratinocytter
Bemærk: Transduktion af keratinocytter tillader kvantificering af transkriptionel regulering af SB transposase i den bedste dosis-kombination af de to vektorer, IDLV (af qRT-PCR) og kontrollere integration af den indiske regering (NGL) i target-cellerne (af cytofluorimetric analyse).- Før afmontering celler, forberede trypsin brugsopløsning:
0,5% trypsin-EDTA (10 x) 5,0 mL
500mM EDTA (slutkoncentration = 5 mM) 0,5 mL
1 x PBS 44,5 mL - Varm trypsin brugsopløsning ved 37 ° C før brug. Gemme trypsin brugsopløsning ved 4 ° C.
- For at frigøre subconfluent keratinocytter i kultur, fjerne medium, vaske cellerne med 1 x PBS og tilsættes 1 mL af pre varmede trypsin brugsopløsning til hver brønd. Der inkuberes ved 37 ° C i 15 min i celle kultur inkubator.
- Efter inkubering tilsættes resuspend cellerne i en brønd grundigt og overføre cellesuspension til et centrifugeglas, indeholdende 2 mL serum-holdige medium (hvis mange celler er stadig knyttet, inkuberes i en yderligere min ved 37 ° C). Skyl hver godt en gang med 3 mL 1 x PBS eller frisk medium og tilføje skyl løsning til centrifugeglasset med cellesuspension.
- Der centrifugeres i 5 min på 580 x g og supernatanten.
- Vaske cellerne med 5 mL af 1 x PBS, centrifugeres i 5 min på 580 x g og supernatanten.
- I en 15 mL polypropylen tube, fortyndes 1.6x105 keratinocytter i 1 mL af cFAD medium, én fortynding for hver betingelse.
- Fortynd lentiviral vektorer i 1 mL af cFAD medium i overværelse af 20 μL polybrene (endelig koncentration af 8 µg/mL på en endelige mængden af 2 mL):
Fortyndinger for wells #1, #2, #3: mock transduced celler (negativ kontrol uden vektorer).
Fortyndinger for wells #4, #5: IDLVTKSB vektor (13.000 ng af p24) + IDLVrtTA2s-M2 vektor (48.000 ng af p24).
Fortyndinger for wells #6, #7, #8, #9: IDLVTKSB vektor (13.000 ng af p24) + IDLVrtTA2s-M2 vektor (48.000 ng af p24) + IDLVT2 vektor (9,160 ng af p24). - Transduce celler i suspension ved at tilføje hver lentiviral vektor fortynding (1 mL) til de tilsvarende keratinocytter suspension (1.6x105 keratinocytter i 1 mL).
- Fjern mediet fra lethally bestrålede 3T3-J2 celler seedede på dag 0 og plade transduced keratinocytter (1.6x105 keratinocytter i 2 mL) på dem. Efter transducing et godt fortsætte med den næste.
- Der inkuberes ved 25 ° C i 30 min, og derefter overføre cellerne til 37 ° C i celle kultur inkubator for 6 h.
Bemærk: Du må ikke spinoculate primære keratinocytter, som levedygtighed og spredning vil blive kraftigt påvirket. - Efter 6 h, der tilsættes 1 mL af cFAD medium til hver brønd. Tilføj 1 μM doxycyclin (endelig koncentration) i wells #5, #8 og #9. Returnere celler til 37 ° C.
- Før afmontering celler, forberede trypsin brugsopløsning:
- Dag 2: Udskift cFAD medium med 3 mL af KC medium med 10 ng/mL EGF.
- Dag 3: Trypsinize og vask celler fra brønde #1, #4 og #5 som beskrevet før (Se 4.4.1 til 4.4.6). Fryse celle pellets ved-80 ° C hen til uddrag total RNA for qRT-PCR analyse (Se trin 7).
- Trypsinize celler fra godt #2, #6 og #8, som beskrevet i trin 4.4.1 til 4.4.5 og udføre cytofluorimetric analyse for normal god landbrugspraksis udtryk (Se trin 5).
- Holde kulturen fra brønde #3 og #7 #9 for mindst 3-4 doublings, tilstrækkelig til at fortynde un-integreret IDLVT2 vektor (5 dage for menneskers primære keratinocytter belagt på feeder lag).
- Dag 6: Ca. 5 dage post transduktion, trypsinize celler (Se trin 4.4.1 til 4.4.5) fra brønde #3 og #7 #9 til at udføre cytofluorimetric analyse for normal god landbrugspraksis udtryk (Se trin 5).
Bemærk: Eksperiment timing og transduktion effektivitet er stærkt påvirket af primær celletype og af variabiliteten af indsamlede prøver.
5. Cytofluorimetric analyse på transduced primære keratinocytter
Bemærk: En flow forskellige konfigureret med en blå laser (488 nm), en rød laser (633 nm) og filtre for påvisning af normal god landbrugspraksis og APC Fluorescens er ansat (Se Materialer tabel).
- For at diskriminere keratinocytter fra 3T3-J2 feeder lag, etiket transduced keratinocytter udskilt på dag 3 og 6 (Se trin 4.7 og 4.9) med musen monoklonale APC-konjugerede anti-Feeder antistof.
- Forbered 4 mL af farvning buffer for hver prøve:
5% FBS 200 ΜL
500 mM EDTA (slutkoncentration = 2,5 mM) 20 μL
PBS 1 x 3780 μL - Vask fritliggende celler med 1 mL af farvning buffer. Der centrifugeres i 5 min på 580 x g og supernatanten.
- I et rør for flow flowcytometri erhvervelse, resuspend 5 x 104 celler i 100 μL af farvning buffer og tilsættes 2 μl anti-Feeder antistof (1:50). Bland godt og Inkuber i 30 min på is i mørke.
- Efter 30 min., vask med 2 mL af farvning buffer. Der centrifugeres i 5 min på 580 x g og supernatanten. Resuspend i 200 μl af farvning buffer.
- Erhverve APC og normal god landbrugspraksis signaler af cytofluorimetric analyse18. Normal god landbrugspraksis+ celle brøkdel af APC- celle befolkning angiver transduced keratinocytter.
Bemærk: Hvis det ønskes, lave farves prøven før flowcytometri med 2% PARAFORMALDEHYD i PBS 1 x og opbevares ved 4 ° C i mørke indtil flugt.
- Forbered 4 mL af farvning buffer for hver prøve:
- Analysere flow flowcytometri data ved at plotte forholdet mellem andelen af normal god landbrugspraksis+celler på slutpunktet (5 dage) og procentdelen af normal god landbrugspraksis+celler 2 dage efter transduktion, normaliseret til resterende niveau af den IDLVT2-transduced celler.
6. semi-kvantitative RT-PCR
Bemærk: Brug en PCR termisk cycler.
- Uddrag total RNA fra transduced eller styre celler bruger et RNA oprensning kit, efter producentens protokol.
Bemærk: Total RNA kan opbevares ved-80 ° C. - Syntetisere cDNA i en 20 µL reaktion ved hjælp af 100 ng af total RNA og en reverse transkriptase kit, efter producentens protokol.
Bemærk: cDNA kan opbevares ved-20 ° C. - Design primere specifikke for SB100X, rtTA2s-M2 og GAPDH (en husholdning gen).
Foreslåede designs:
SB videresende primer: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
SB reverse primer: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
rtTAM2 fremad primer: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
rtTAM2 vende primer: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
GAPDH videresende primer: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
GAPDH reverse primer: 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3' - Udføre PCR i en endelig reaktion volumen af 50 µL. Især samles i hver PCR rør den følgende reaktion:
cDNA (1:5 fortynding) (fra trin 6.2) 1.00 µL
Videresende primer (10 µM lager) 1.00 µL
Vende primer (10 µM lager) 1.00 µL
dNTP'er (10 µM lager) 1.00 µL
Buffer (+ MgCl2) (10 x lager) 5,00 µL
Taq-polymerase (5 U/µL stock) 0,25 µL
Sterilt vand 40.75 µL - Bruge programmet følgende af den termiske cycler: 1 cyklus ved 95 ° C i 5 min så fortsætte med 95 ° C til 30 s, 58 ° C til 30 s og 72 ° C i 30 s 34 gange for SB100X, 32 cykler til rtTA2s-M2 , og 25 cykler for GAPDH.
- Forberede 1% agarosegel. 1 g af Agarosen i 100 mL af TBE 1 x (10 x stock opløses i sterilt vand), opløses i et bægerglas eller kolbe. Smelt i mikrobølgeovn, hvirvlende hvert minut indtil Agarosen er fuldstændigt opløst. Afkøle den smeltede Agarosen, indtil den når ca. 50 ° C, og derefter tilsættes 5 µL af ethidiumbromid (10 mg/mL bestand). Hæld smeltet Agarosen i en samlet gel bakke med en kam, for gel støbning.
- Indlæse prøver (10 µL) på agarosegel og udføre elektroforese.
- Hvis det ønskes, erhverve gel billede og udføre densitometric analyse på PCR-bands.
7. kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR)
Bemærk: En kommerciel sekvens Detection System er ansat. PCR primere og 6-carboxyfluorescein (FAM) sonde til glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) købes kommercielt.
- Retro-transskription, under trin 6.2.
- Bruge softwaren til at designe primere og sonde specifikke for SB100X.
Foreslåede design:
SB.2 fremad primer: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
SB.2 vende primer: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
Probe SB FAM: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3' - Udfør Real-Time PCR i 96-brønd plader med en PCR Master Mix og primere + sonde blandes i en endelig reaktion volumen af 25 µL. Navnlig omhandle følgende reaktion til hver brønd:
cDNA (1:10 fortynding i sterilt vand) 1.00 µL
2 x Master Mix 12,50 µL
Primere + 20 x sonde Bland 1,25 µL
Sterilt vand 10.25 µL
Bemærk: Udfør alle reaktioner i tre eksemplarer. For at forhindre pipettering fejl, skal du forberede en blanding på mindst n + 3 reaktioner (uden cDNA). Alikvot ved hjælp af en multikanalpipette. - Køre real-time PCR ved hjælp af følgende program: 1 cyklus ved 95 ° C i 10 min og derefter 40 cyklusser af 95 ° C til 15 s og 60 ° C i 1 min og hold ved 4 ° C.
- Analysere qRT-PCR data ved at normalisere den relative udtryk (RQ værdi) af SB100X til niveauet af GAPDH den samme cDNA prøve af de 2-ΔΔCT kvantificering, bruger typisk data analyse software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af proceduren, der præsenteres her, tre IDLV vektorer transporterer de regulerede SB komponenter (SB100X, rtTA2S-M2 og T2-normal god landbrugspraksis transposon) blev pakket og bruges til at effektivt levere og stramt regulere SB-systemet i humane celler. Figur 1A viser en ordning for in vitro- transduktion af HeLa celler, som blev udført for at evaluere det transkriptionel regulering af SB transposase med den bedste dosis-kombination af de to IDLV vektorer (rapporteret i tabel 2). Transkriptionel regulering af SB100X blev målt ved qRT-PCR (figur 1B) og afbildet som en relativ mængde (RQ) værdi for off-state (IDLVTKSB alene RQ = 1). I transduced HeLa celler, blev en 8-fold aktivering (+ dox) af SB100X udtryk over baggrunden (IDLVTKSB) opnået. Især, cotransduced HeLa celler i mangel af dox viste transposase udtryk svarer til de off stater, der angiver en stram styring af TetTK promotor af rtTA2s-M2 modulator.
Figur 1: Transduktion af HeLa celler for udtryk for transcriptionally reguleret SB transposase båret af IDLV vektorer. (A) en ordning for in vitro- transduktion af HeLa celler med IDLVs for udtryk for transposase. (B) qRT-PCR analyse af HeLa celler transduced med IDLVTKSB (2.600 ng af p24) i (+) eller ej (-) af IDLVrtTA2S-M2 (9.600 ng af p24) og 1 µM doxycyclin (dox). Den stiplede linje forbinder prøver viser væsentligt anderledes værdier (*** P < 0.005). Eksperimentet blev udført i tre eksemplarer. Mener S.E.M er vist som fejllinjer. (Figur ændres fra Cocchiarella, F. et al., 201618). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Som et eksempel, figur 2 viser den dosis spænder eksperiment sat op til at nå den optimale transkriptionel regulering af transposase. HeLa celler blev transduced med stigende doser (130, 260 og 2.600 ng af p24) af IDLVTKSB i kombination med IDLVrtTA2s-M2 (960 og 9.600 ng af p24), i tilstedeværelse eller fravær af dox. Semi-kvantitative RT-PCR analyse viser tydeligt, at høje doser af begge IDLVs var forpligtet til kraftigt fremkalde SB100X udtryk. Forskellige mål celletype og variationer i viral vektor titrering kan resultere i sup-optimal SB udtryk, og vi anbefaler derfor at udføre dosering indstilling eksperimenter.
Figur 2: IDLV dosis indstilling eksperiment i HeLa celler til at definere den optimale dosis kombination af de to IDLVs. Semi-kvantitative RT-PCR analyse på HeLa celler Co transduced med forskellige doser af IDLVTKSB vektor (130, 260 og 2.600 ng af p24) i fravær eller tilstedeværelse af IDLVrtTA2s-M2 vektor (960 og 9.600 ng af p24) og dox. GAPDH var forstærket som en standard kontrol. SB100X transposase og rtTA2s-M2 udtryk er rapporteret i alle testede betingelser; NC = negativ kontrol. (Figur ændres fra Cocchiarella, F. et al., 201618). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Transkriptionel regulerede SB systemet kunne også bruges i primærelementer, især i de celler, der er resistente over for flere Transfektion metoder, såsom menneskelige primære keratinocytter. Figur 3 viser en ordning for transduktion af primære keratinocytter dyrket på lethally bestrålet 3T3-J2 feeder lag, med IDLV vektorer transporterer de regulerede SB komponenter, i tilstedeværelse eller fravær af dox at inducere SB100X udtryk.
Figur 3: transduktion i suspension af menneskelige primære keratinocytter med IDLV vektorer for udtryk for transcriptionally reguleret SB transposase og transposon. En ordning for in vitro- transduktion af menneskelige primære keratinocytter med IDLVs til at udtrykke transcriptionally reguleret SB transposase og transposon, i tilstedeværelse eller fravær af 1 µM dox. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
QRT-PCR analyse i figur 4A viser at bedst dosis kombination af transposase og modulator vektorer, rapporterede i tabel 2, resulterede i 15-fold aktivering af SB udtryk over off-state (-dox). Transponering eksperimentet blev udført i keratinocytter transduced med de tre IDLV vektorer (IDLVTKSB, IDLVrtTA2s-M2 og IDLVT2) i tilstedeværelse eller fravær af dox. Udtryk for den indiske regering (normal god landbrugspraksis) beared af T2-transposon, i APC- rum, blev målt ved flow forskellige analyse 2 dage efter transduktion (dpt) og på endopoint af kultur (5 dage for menneskers primære keratinocytter). Slutpunktet blev nået, når uintegrerede T2-normal god landbrugspraksis transposon faldt til en knap påviselig niveau (et gennemsnit på 0,6%) på grund af celledeling-afhængige fortynding. Figur 4B viser forholdet mellem procentdelen af normal god landbrugspraksis+ celler i APC- rum på slutpunktet og 2 dage post transduktion, normaliseret til det resterende niveau af transposon alene. Dette angiver procentdelen af celler hosting mindst 1 kopi af den udtrykte GOI stabilt integreret i deres genom, vurderet på 12% for menneskers primære keratinocytter.
Figur 4: analyse af udtryk af transposase og normal god landbrugspraksis i transduced menneskelige primære keratinocytter. (A) qRT-PCR assay på primære keratinocytter transduced med IDLVTKSB og IDLVrtTA2S-M2 i tilstedeværelse eller fravær af 1 µM dox. (B) co transduktion af primære keratinocytter med IDLVT2 transposon og IDLVs for transposase udtryk i tilstedeværelse eller fravær af dox. På y-aksen, celler % normal god landbrugspraksis+ 5dpt / % normal god landbrugspraksis+ celler 2 dpt * 100 (mener ± SEM af to eksperimenter). ** Vis væsentligt anderledes værdier (P < 0,05). (Figur ændres fra Cocchiarella, F. et al., 201618). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Plasmid | Beskrivelse | Referencer |
| pCCL-TetOTKSB | Overføre plasmid brugt til at generere IDLVTKSB vektor. Denne plasmid stammer fra pTetOTKSB, efter kloning TetOTKSB i pCCL lentiviral rygrad. | 18, 20 |
| pCCL-PGKrtTA2S-M2 | Overføre plasmid brugt til at generere IDLVrtTA2s-M2 vektor. | leveret af Prof. V. Zappavigna |
| pCCL-T2GFP | Overføre plasmid brugt til at generere IDLVT2 vektor. Denne plasmid stammer fra pT2GFP, efter kloning normal god landbrugspraksis mellem T2-transposon IRs i pCCL lentiviral rygrad. | 18, 20 |
| pMD.Lg/pRRE.D64VInt | Emballage plasmid til at generere IDLV vektor. | 19 |
| pMD2.G | Plasmid kodning for VSV-G konvolut til at generere lentiviral vektor. | 20 |
| pRSV-Rev | Rev plasmid til at generere lentiviral vektor. | 20 |
| Vektor | Beskrivelse | |
| IDLVTKSB | Integration defekte lentiviral vektor for udtryk af SB100X under kontrol af Tet-responderende TK promotor. | |
| IDLVrtTA2s-M2 | Integration defekte lentiviral vektor for udtryk af rtTA2s-M2 modulator under kontrol af PGK promotor. | |
| IDLVT2 | Integration defekte lentiviral vektor for udtryk for den indiske regering klonet mellem T2-transposon IRs. | |
Tabel 1: plasmider og vektorer ansat i denne protokol. Der findes beskrivelser og henvisninger.
| Vektorer | HeLa (2 x 105 celler) | Keratinocytter (1.6x105 celler) |
| IDLVTKSB | 2.600 ng p24 | 13.000 ng p24 |
| IDLVrtTA2s-M2 | 9.600 ng p24 | 48.000 ng p24 |
| IDLVT2 | 9,160 ng p24 |
Tabel 2: Optimeret vektor doser for transduktion af HeLa celler og humane primære keratinocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, vi beskriver et bredt tilgængelige metode til stabilt integrere en GOI i genomet af target-cellerne af Tornerose-medieret gennemførelse. Selv om SB-systemet blev udviklet for at give en nonviral metode til genom-redigering, er effektiv levering af integration maskiner (transposase og T2 transposon) obligatorisk. Derfor, hvis du vil bruge SB system på næppe transfectable primærelementer, en viral levering af SB komponenter blev forfulgt i de seneste år10,12,15. Men ingen af de virale vektorer ansat op til nu behandlede spørgsmålet om konstitutiv udtryk for transposase, der kan medføre risikoen for ukontrollerbare rehopping af transposon.
Transcriptionally regulerer transposase udtryk, tog vi fordel af et modificeret Tet-ON system16. Den minimale TK promotor smeltet til elementet Millie ved binding til rtTA2s-M2 modulator i overværelse af dox, tillægges en finjustering af transposase aktivering over baggrunden (off-tilstand, i mangel af dox). Den lovgivningsmæssige ydeevne afhænger af de relevante IDLVs (IDLVTKSB og IDLVrtTA2s-M2) vektor dosis-kombination og på celletyper (fx HeLa celler og humane primære keratinocytter). Uafhængigt af target-cellerne, vektor dosis skal sikre det højeste niveau af transduktion af target-cellerne uden at det påvirker cellernes levedygtighed, således en eskalerende dosis-kombination eksperimentere i HeLa celler (eller andre cellelinjer) til at definere de optimale doser af semi-kvantitative RT-PCR, er kraftigt antydet.
Gennemførelse af den indiske regering blev vurderet i primærelementer. Menneskelige primære keratinocytter seedede på lethally bestrålede 3T3-J2 feeder lag var transduced med 3 IDLVs (IDLVTKSB, IDLVrtTA2s-M2 og IDLVT2) ved de eksperimentelt definerede doser. En klar dox-afhængige aktivering af transposase blev demonstreret af qRT-PCR. Desuden blev stabil integration af den indiske regering demonstreret af cytofluorimetric analyse af normal god landbrugspraksis udtryk i celler transduced i tilstedeværelse eller fravær af dox, der angiver muligheden for at ansætte IDLV platform til køretøjets transcriptionally regulerede SB komponenter til primærelementer og vellykket integration af en GOI i genomet af target-cellerne.
De kritiske trin i protokollen er IDLV vektor produktion og transduktion af target-cellerne på optimal effektivitet og vektor dosis-kombination. Lav Transfektion effektivitet af HEK293T celler kan resultere i lav vektor udbytte. Definitionen af doser af IDLVTKSB og IDLVrtTA2s-M2 er nødvendig for at undgå en ubalance af Tet-ON-komponenter, som kan resultere i høj leakiness i mangel af modulatoren eller i lavt fold induktion TetOTK selskabet på dox behandling. Disse kritiske trin kunne løses ved mindre ændringer. Eksempelvis kunne Transfektion protokollen være standardiseret kommercielle Transfektion reagenser. Transduktion protokollen bør tilpasses efter celletype af interesse, især i betragtning af om spinoculation øger transduktion effektivitet uden at det påvirker cellernes levedygtighed. Vektorer og polybrene kunne føjes til substratet af målcellerne og erstattet med frisk medium efter 6 timer eller natten inkubation. Det er også værd at bemærke, at procentdelen af normal god landbrugspraksis+ celler 5 dage efter transduktion kunne blive påvirket af baggrunden integration af IDLVs.
En mindre begrænsning af denne metode er, at IDLV vektorer er produceret forbigående af Transfektion af HEK293T celler. Afhængigt af vektoren gentagne doser skal anvendes, vektor produktioner er påkrævet. En anden begrænsning er relateret til længden af den indiske regering, da lasteevne af IDLV vektor er ca 8 kb.
Afslutningsvis, denne metode her giver mulighed for integration af en GOI gennem transcriptionally regulerede SB komponenter pakket ind i IDLV vektorer, som blandt de eksisterende metoder til at levere SB system, viser en bred vifte af tropisme og høj transduktion effektivitet. Desuden, den modificerede Tet-ON system tillader en transkriptionel regulering af SB100X udtrykket, et relevant spørgsmål i risikoen for transposon re hopping eller flere serielle gennemførelse arrangementer hvis de kræves. Mulige anvendelser af denne metode omfatter genom engineering af cellelinjer (fx, HeLa celler, HEK293 celler) at etablere stabile emballage celler for virale vektorer, og integration af terapeutiske gener i klinisk relevante primærelementer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Prof. Zappavigna, universitetet i Modena og Reggio Emilia, Modena, Italien for at forsyne os med pCCL-PGKrtTA2-S-M2 plasmid. Vi anerkender også Prof. Z. Ivics (Paul Ehlrich Institute, Langen, Tyskland) og Prof. Z. Izvak (Max Delbruck Center for Molekylær medicin, Berlin, Tyskland) til pCMVSB100X og pT2/BH plasmider. Dette arbejde blev støttet af DEBRA international og italiensk Universitet og forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine | Lonza | BE12-614F | Cell culture medium. |
| HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.03 | Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production. |
| Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml | Lonza | DE17-602E | Reagents for cell culture medium. |
| L-Glutamine 200mM | Lonza | BE17-605E | Reagent for cell culture medium. |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline | Lonza | BE17-737E | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5% | Merck | 106580 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | Reagent for HBS 2X preparation. |
| Sterile water for injection | Fresenius Kabi | - | Reagent for HBS 2X preparation. |
| 0.45 µm PESS filter | Whatman | 10462100 | Filters used to remove cell debris from viral supernatant. |
| Polyallomer Beckman tubes | Beckman Coulter | 326823 | Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation. |
| PBS-1X w/o Ca, Mg | Lonza | BE17-516F | Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | (Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension. |
| HIV-1 Gag p24 immunocapture kit | Perkin Elmer | NEK50001KT | Kit for IDLV particle titration. |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | Reagent to enhance transduction efficiency. |
| Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg | GIBCO | BE17-160E | Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted). |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | 100938B | AnalaR BDH | Reagent for trypsin working solution preparation. |
| 0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X) | GIBCO | 15400-054 | Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted). |
| Donor Bovine Serum, New Zealand Origin | GIBCO | 16030-074 | Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer). |
| Ham’s F12 media | GIBCO | 21765 | Medium for keratinocytes. |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | Serum for HeLa cell culture medium. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin | GIBCO | 10099-141 | Serum for human primary keratinocyte culture medium. |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Adenine | VWR | 1152-25 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Hydrocortisone | VWR | 3867-1 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T5516 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Human EGF | Austral Biological | GF-010-9 | Reagents for keratinocyte growth. |
| Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody | Miltenyi Biotech | 130-096-099 | To label feeder layer. |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | RNA purification kit. |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18080051 | Reverse transcriptase kit. |
| Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP) | Sigma-Aldrich | D7295 | Reagent for semi-quantitative PCR. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | (any) | - | Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR. |
| GoTaq G2 Hot Start Polymerase | Promega | M740B | Taq polymerase. |
| Agarose, for molecular biology | Sigma-Aldrich | A9539 | Reagent for agarose gel electrophoresis. |
| UltraPure TBE Buffer, 10X | Invitrogen | 15581028 | Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O. |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | Reagent for agarose gel electrophoresis. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D-9891 | drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4304437 | TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe. |
| 15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon Corning | 352096 | Tubes for cell collection and vector dilution preparation. |
| 150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile | Falcon Corning | 353025 | Cell culture dish for viral production. |
| 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile | Falcon Corning | 353046 | Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction. |
| Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 | Tubes for dilution preparation. |
| Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL | Eppendorf | 0030 120.094 | Tubes for dilution preparation. |
| 0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free | (any) | - | Tubes for semi-quantitative PCR. |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystem | 4346906 | 96-well for qRT-PCR. |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap | BD Falcon | 352052 | Tubes for flow cytometry acquisition. |
| Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes) | (any) | - | Pipettes for sterile tissue culture applications. |
| Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes) | (any) | - | Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications. |
| pH meter | (any) | - | Equipment for measurement of HBS 2X pH. |
| PCR Thermal cycler | (any) | - | Equipment for semi-quantitative PCR. |
| Agarose gel electrophoresis equipment | (any) | - | Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR. |
| BD FACS Canto II 2LSR 4/2 | BD | - | Flow cytometer. |
| 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 7900HT | Equipment for qRT-PCR. |
| Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets. | (any) | - | Centrifuge for cell culture processing and spinoculation. |
| Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor | Beckman Coulter | - | Ultracentrifuge for lentiviral particle production. |
| Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid). | |||
| Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction. |
References
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
- Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
- Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).
- Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).
- Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).
- Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9 (11), e112712 (2014).
- Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).
- Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).
- Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8 (10), e75344 (2013).
- Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8 (10), e76771 (2013).
- Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).
- Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).
- Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).
- Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
- Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).
- Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038 (2016).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).
- Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A laboratory Manual. , 4th edition, (2012).
- Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).
