Arkitektur af proteinkomplekser er afgørende for deres funktion. Kombinere forskellige massespektrometriske metoder vist sig magtfulde at studere deres forsamling. Vi leverer protokoller for kemiske cross-linking og indfødte massespektrometri og viser hvordan disse supplerende teknikker bidrage til at belyse arkitektur af multi subunit protein forsamlinger.
Proteiner interagere med deres ligander form aktiv og dynamisk forsamlinger, som udfører forskellige cellulære funktioner. Belyse disse interaktioner er derfor grundlæggende for forståelsen af cellulære processer. Men mange proteinkomplekser er dynamisk forsamlinger og er ikke tilgængelige af konventionelle strukturelle teknikker. Massespektrometri bidrager til den strukturelle undersøgelse af disse forsamlinger, og især kombinationen af forskellige massespektrometriske metoder leverer værdifuld indsigt i deres strukturelle arrangement.
I denne artikel, vi beskriver anvendelsen og kombination af to supplerende massespektrometriske metoder, nemlig kemiske cross-linking kombineret med massespektrometri og indfødte massespektrometri. Kemiske cross-linking involverer kovalent sammenkoblingen af aminosyrer i umiddelbar nærhed af ved hjælp af kemiske reagenser. Efter fordøjelse med proteaser, tværbundet di-peptider er identificeret ved massespektrometri og protein interaktioner websteder er udækket. Indfødte massespektrometri er til gengæld analysen af intakt protein forsamlinger i gasfasen af et massespektrometer. Det afslører protein stoichiometries samt protein og ligand interaktioner. Begge teknikker derfor levere supplerende oplysninger om strukturen af protein-ligand forsamlinger og deres kombination viste sig magtfulde i tidligere undersøgelser.
Den strukturelle undersøgelse af protein forsamlinger er blevet særlig vigtig for forståelsen af cellulære processer. Derfor, mange teknikker har udviklet og forbedret i strukturbiologi1. Men disse teknikker er undertiden begrænset i deres ansøgning på grund af størrelse, fleksibilitet eller heterogenitet af proteinkomplekser under undersøgelsen. Massespektrometri kan håndtere disse udfordringer, og derfor opstod som et kraftfuldt værktøj i strukturbiologi2,3,4,5. Den største fordel ved massespektrometri, men er evnen til at utvetydigt identificere proteiner selv i komplekse og heterogene blandinger6. Med henblik herpå, proteiner er normalt fordøjes med endoproteinases og den resulterende peptid blanding er adskilt af væskekromatografi og direkte elueret i den massespektrometer. Peptid masserne bestemmes efterfølgende og forløber ioner er markeret for yderligere fragmentering af peptider. Proteiner er derefter identificeres ved søgning peptid og tilsvarende fragment masserne mod en kendt database. Denne procedure ikke kun tillader identifikation af peptider/proteiner, men også deres posttranslationelle modifikationer, som forårsager en masse Skift forløber peptider og fragmentioner transporterer ændring7. Nogle af de mange teknikker i strukturelle massespektrometri er baseret på dette princip4,8. For eksempel, fod mærkning teknikker såsom brint deuterium exchange9,10, kemiske mærkning strategier11,12, eller hydroxyl radikale udskrivning13,14 , give indsigt i den overflade tilgængelighed af proteiner under visse betingelser.
En anden teknik er (kemiske) danne tvaerbindinger, der involverer kovalent sammenkoblingen af aminosyrer i umiddelbar nærhed af gennem deres funktionelle grupper. For dette er kemiske reagenser, UV-activatable reagenser eller aminosyrer ansat15,16. Efter danne tvaerbindinger, proteiner er normalt hydrolyseret med proteaser og krydsbundet di-peptider er analyseret af liquid chromatography-koblet massespektrometri. Identifikation af tværbindingsmidler produkter-databasen til søgning, men kræver brugen af specialiseret software, som sammenkæde peptid sekvenser af forskellige proteiner og forskelligartede regioner17,18,19. Brugen af kemiske cross-linkers har den fordel, at det kan anvendes til næsten alle protein kompleks af interesse og ikke kræver indarbejdelse af UV-activatable aminosyrer, som kun kan opnås, når at udtrykke protein af interesse i værtsceller. Som sådan cross-linking er et alsidigt værktøj og var med held ansat i mange strukturelle undersøgelser af selv store protein forsamlinger20.
Massespektrometri af intakt proteinkomplekser (undertiden kaldet ‘native’ massespektrometri), på anden side indebærer analyse af intakt proteiner og proteinkomplekser uden hydrolyse til peptider. Det afslører sammensætning, heterogenitet, støkiometrisk, topologi og subunit vekselvirkninger mellem protein komplekser21,22. I kombination med ion mobilitet tillader indfødte massespektrometri yderligere bestemmelse af deres kropsbygning23,24. Dette gør det et stærkt værktøj til den strukturelle undersøgelse af proteinkomplekser, der er vanskelige at vurdere af konventionelle strukturelle teknikker. Men indfødte massespektrometri kræver analyse buffere, der fastholder ikke-kovalente protein interaktioner under electrospray Ionisation. Dette opnås normalt ved hjælp af vandig, flygtige buffere såsom ammonium acetat25. Derudover er instrument ændringer nødvendige for at undgå dissociation under transmission i gasfasen af massespektrometer26. Anvendes på denne måde, blev mange (store) proteinkomplekser analyseret. Imponerende eksempler er studier af intakt ribosomer27, ATP synthases28eller vira29.
Kombinationen af indfødte massespektrometri og danne tvaerbindinger succes især i tidligere undersøgelser. For eksempel, stoichiometries af anstandsdame komplekser, herunder en uventet Hsp70 dimer, kunne være fremstillet af massespektrometri eksperimenter af intakt proteinkomplekser, mens kemiske cross-linking afslørede ordningerne af proteiner i den assemblies30,31. I en anden undersøgelse, blev virkningerne af posttranslationelle modifikationer på en intakt ATPsyntase komplekse undersøgt. Native massespektrometri givet indsigt i protein kompleks stabilitet i tilstedeværelse eller fravær af fosforylering eller acetylation32,33. En sammenlignende tværbindingsmidler strategi34 afslørede derefter konformationelle ændringer af protein kompleks under forskellige forhold.
Her give vi protokollerne for protein identifikation af massespektrometri, (kemiske) cross-linking og indfødte massespektrometri, herunder data-analyse og fortolkning (figur 1). Kombinationen af supplerende resultaterne fra disse metoder ved hjælp af to godt karakteriseret proteinkomplekser er demonstreret35. Vores protokol kan anvendes til enhver protein forsamling, som kan renses på visse renhed og koncentration. Metoden er i nogle tilfælde begrænset af dataanalyse for danne tvaerbindinger data, dvs, størrelsen af databasen ansat, som bestemmer den krævede Søg tid og rum. Derudover manuel validering af konstaterede cross-links er ofte nødvendig og yderligere reducerer produktionen. Native massespektrometri er for det meste begrænset af prøven kvalitet, fx, buffere og adukter anvendes under rensning og mulighed for at udveksle dem af vandige og flygtige buffere. Proteinkomplekser renset for strukturel analyse normalt har dog kvalitetskrav for vellykket analyse med vores protokoller.
Protokoller leveres til massespektrometri-baseret strukturel analyse af multi subunit proteinkomplekser. De to teknikker, beskrevet i protokollen, for det meste levere supplerende resultater og er velegnet til at få indsigt i de strukturelle ordninger inden for protein (-ligand) komplekser, som er vanskelige at studere af konventionelle strukturelle teknikker. Native massespektrometri leverer indblik i protein stoichiometries samt protein interaktioner ved at analysere subcomplexes og stabil interaktion moduler. Cross-Linking, på den anden side giver oplysninger om direkte kontakt websteder. Afhængigt af tværs linker anvendes en vis fleksibilitet kan eller bør indgå i analysen.
De angivne protokoller er generelt nemme at udføre og ikke tidskrævende. Hele protokollen kan udføres inden for en uge og kan anvendes på næsten alle proteinkomplekser, selv om en vis mængde af protein kompleks er nødvendige for vellykket analyse. Forberedelse af prøver er enkel og kræver ikke specifikt oprenset proteinkomplekser. Dog er én fælles faldgrube kontaminering af prøven under prøveforberedelse til massespektrometri-baseret protein identifikation. Disse forureninger i de fleste tilfælde omfatter keratiner, der stammer fra støv, hud eller hår. Ekstra pleje såsom iført handsker og lab frakker, filtrerende vandig buffere, og ved hjælp af høj renhed opløsningsmidler bør derfor tages under prøveforberedelse til massespektrometri-baseret protein identifikation. Andre forurenende proteiner som chaperoner er som regel indført under protein oprensning, f.eks.når du bruger affinitet tags. I disse tilfælde, bør protein oprensning forbedres, for eksempel ved at øge vaske trin. Under alle omstændigheder protein forureninger i stikprøven er let identificeres under til databasesøgning ved at udelade filteret taksonomi (dvs.søge mod proteiner fra alle arter). Hvis kun et par peptider overholdes (dvs., en lav protein dækning kunne opnås), selv om tilstrækkelig prøven er tilgængelig, det kan være nødvendigt at bruge en anden proteinase under fordøjelsen. Generelt giver Trypsin et tilstrækkeligt antal peptider; men i nogle tilfælde som Membranproteiner eller membran domæner af proteiner, reduceres antallet tryptic kavalergang websteder og andre enzymer målretning hydrofobe aminosyrer er et bedre valg.
Med hensyn til instrumentering kræves en særligt modificerede instrument for indfødte massespektrometri, som bevarer ikke-kovalente interaktioner under overførsel til gas-fase. Flere instrumenttyper er blevet indført, herunder Q-ToF og orbitrap instrumenter. Mens modificerede Q-ToF massespektrometre er kommercielt tilgængelige for indfødte massespektrometri da flere år, sidstnævnte var først for nylig indført og i de fleste tilfælde kræver specialiseret ændring45. Men anvendelsen af høj opløsning instrumenter tilladt at studere binding af flere ligander og deres kvantificering46,47 og er lovende for fremtidige ansøgninger.
For at identificere krydsbundet di-peptider ved liquid chromatography-koblet massespektrometri, kan standard procedurer med få ændringer anvendes. Men til databasesøgning er den begrænsende faktor som specialiseret software kan sjældent behandle store databaser og reduceret databaser indeholdende protein-underenheder af komplekser er påkrævet. Nylige undersøgelser anvendes masse massespektrometri-cleavable cross-linkers målretning protein interaktioner i hele cellen lysates48,49. Brugen af kemiske cross-linkers, der fragmenterer i tandem massespektrometri eksperimenter for det meste giver lineær peptider (ændret ved tværs linker), som kan identificeres ved yderligere fragmentering og database søgning af lineære peptider, og det reducerer Søg efter tid og beregningsmæssige søgning plads. Men for at udføre disse eksperimenter, en ion trap masse analyzer eller en hybrid massespektrometer med en ion trap er påkrævet. I almindelighed, som falske-positiver er et vigtigt spørgsmål, er massespektre af krydsbundet peptider ofte valideret manuelt af kvaliteten af deres fragment spektre, som udvider data analyse tid enormt. Udvikle robuste scoring systemer, der kan anvendes uden yderligere validering trin er derfor potentielle fremtidige applikationer. En måde at forbedre dataanalyse og reducere antallet af falsk-positive var indførelsen af falsk opdagelse sats beregninger og deres anvendelse til cross-linking datasæt50.
Generelt er de teknikker, der beskrives her kan suppleres med yderligere massespektrometri teknikker (f.eks.kovalente mærkning) at øge outputtet fra analysen. Andre ændringer og forbedringer af protokollerne, der kan gennemføres let. Som sådan optrevler sammenlignende tværbindingsmidler34 konformationelle ændringer i protein-forsamling. Yderligere udviklinger i native massespektrometri i dag giver mulighed for analyse af membran proteiner51,52 og deres interaktioner med lipider28,52,53,54 . Nye udviklinger i høj opløsning massespektrometre for indfødte massespektrometri har udvidet den ansøgning og ligand bindende, fx, binding af lipider til Membranproteiner, kan nu medtages i analysen45, 46. i kombination med datamodellering tilgange, disse teknikker kan levere strukturelle modeller af varierende opløsning55. Hvis ingen crystal strukturer er tilgængelige for de intakte komplekse eller enkelt underenheder, kan massespektrometri levere første indsigt i protein interaktioner og topologi af ukendt komplekset. Afhængigt af de anvendte metoder og opnåede resultater, kan lav opløsning modeller af ukendt komplekset opnås56,57,58. Hvis krystal strukturer eller homologi modeller er tilgængelige, kan den strukturelle oplysninger modtaget fra massespektrometri udbytte selv nær-indfødte modeller59.
I forhold til andre strukturelle teknikker, massespektrometri har fordelen, at det kræver lave prøve beløb, det kan håndtere heterogene prøver og gælder for proteinkomplekser af ubegrænset størrelse. Desuden giver massespektrometri undersøgelsen af dynamisk protein systemer. Forskellige populationer af protein eller protein kompleks, der findes i løsningen bliver normalt analyseret sammen og derfor, i modsætning til andre strukturelle teknikker, som kræver udvalg af visse befolkningsgrupper, alle konformationer vedligeholdes under analyse og er evaluerbare i et eksperiment. Kvantitative tværbindingsmidler tilgange blev for nylig indført34,60,61 og er lovende for fremtidige ansøgninger der beskriver konformationelle ændringer under forskellige betingelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker vores kolleger for nyttige diskussioner. Vi takker også Ilme Schlichting og Karl-Peter Hopfner for at give proteinkomplekser. Vi anerkender støtte fra Forbundsministeriet for uddannelse og forskning (BMBF, ZIK programmet, 03Z22HN22), den europæiske fond for Regionaludvikling (EFRE, ZS/2016/04/78115) og MLU Halle-Wittenberg C.S. og finansiering fra the Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) at A.P.
Chemicals, Reagents, Consumables | |||
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma Aldrich | H4034 | buffer |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | pH |
Acetonitrile Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A955-1 | solvent |
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) | Millipore | i.e. UFC500396 | buffer exchange, concentration |
Ammonium acetate solution | Sigma Aldrich | A2706 | native MS |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | in-gel digestion |
Ammonium solution | Sigma Aldrich | 9859 | pH |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) | Thermo Scientific | 21590 | cross-linker |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) | Thermo Scientific | 21595 | cross-linker |
Caesium iodide | Sigma Aldrich | 203033 | calibration |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | in-gel digestion |
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) | Harvard Apparatus | 30-0038 | native MS |
Disuccinimidyl suberate (DSS) | Thermo Scientific | 21655 | cross-linker |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D5545 | in-gel digestion |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D8418 | solvent |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818 | solvent |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
Instant Blue Coomassie staining solution | expedeon | ISB1L | staining solution for gel electrophoresis |
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) | life technologies | NP0323BOX | gel electrophoresis |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | In-gel digestion |
Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
Micro BioSpin 6 columns | BioRad | 732-6222 | buffer exchange |
NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | running buffer, gel electrophoresis |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) | invitrogen | NP0007 | sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis |
NuPAGE MES SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) | invitrogen | NP0004 | reducing Agent for gel electrophoresis |
PBS – phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | buffer |
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker | invitrogen | LC5925 | prestained Protein Marker for gel electrophoresis |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | ethanol precipitation |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
Trypsin | Sigma Aldrich | TRYPSEQ-RO (11418475001) | in-gel digestion |
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) | Sartorius | i.e. VS0101 | buffer exchange, concentration |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge | Thermo Scientific | 75002425 | |
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 | Sutter Instruments | P-1000 | |
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell | Invitrogen | EI0001 | |
Gold Coater Quorum Q150R S | Quorum Technologies Ltd. | Q150RS | |
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T | Heidolph Instruments | 544-41200-00 | |
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade | Waters (Micromass) | – | |
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) | Thermo Scientific | 164570 | |
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) | Thermo Scientific | 164213 | |
scalpel | Fisher Scientifc | 10463989 | |
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge | Thermo Scientific | SPD121DP-230 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tweezers AA | Sigma Aldrich | Z680184-1EA | |
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath | VWR | 142-0084 | |
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) | Thermo Scientific | 0726030+ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software, Software Tools, Database search | |||
Mascot | www.matrixscience.com | ||
Massign | http://massign.chem.ox.ac.uk | ||
MassLynx | Micromass | ||
MassMatrix | Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010) | ||
MaxQuant | Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008) | ||
pLink | Yang, B. Nat Methods 9 (2012) | ||
pXtract conversion tool | http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html | ||
UniDec | Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015) | ||
XCalibur | Thermo Scientific | ||
XiNET | http://crosslinkviewer.org | ||
XLinkX | Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015) | ||
xQuest | Rinner, O. Nat Methods 5 (2008) | ||
Xvis | https://xvis.genzentrum.lmu.de |