A arquitetura de complexos de proteínas é essencial para a sua função. Combinar várias técnicas de espectrometria de massa provou poderosa para estudar seu assembly. Nós fornecemos protocolos para cross-linking química e espectrometria de massa nativa e mostrar como essas técnicas complementares ajudam a elucidar a arquitetura de assemblies multi o subunit da proteína.
Proteínas interagem com seus ligantes de forma ativa e dinâmica módulos (assemblies) que realizam várias funções celulares. Portanto, é fundamental para a compreensão dos processos celulares elucidar essas interações. No entanto, muitos complexos de proteína são assemblies dinâmicos e não são acessíveis por técnicas estruturais convencionais. Espectrometria de massa contribui para a investigação estrutural destes conjuntos, e particularmente a combinação de várias técnicas de espectrometria de massa fornece insights valiosos sobre seu arranjo estrutural.
Neste artigo, descrevemos a aplicação e a combinação de duas técnicas complementares de espectrometria de massa, ou seja cross-linking química juntamente com espectrometria de massa e espectrometria de massa nativa. Cross-linking química envolve a ligação covalente de aminoácidos nas proximidades usando reagentes químicos. Após digestão com proteases, reticulado de di-peptídeos são identificados por espectrometria de massa e sites de interações proteína são descobertos. Espectrometria de massa nativa por outro lado é a análise de conjuntos de proteína intacta na fase gasosa de um espectrômetro de massa. Ele revela que stoichiometries de proteína, bem como interações proteína e ligante. Ambas as técnicas, portanto, fornecer informações complementares sobre a estrutura da proteína-ligante assemblies e sua combinação provada poderosa em estudos anteriores.
A investigação estrutural de assemblies de proteína tornou-se particularmente importante para a compreensão dos processos celulares. Consequentemente, muitos, técnicas foram desenvolvidos e melhorados em biologia estrutural1. No entanto, essas técnicas às vezes são limitadas na sua aplicação devido ao tamanho, flexibilidade ou heterogeneidade dos complexos proteína sob investigação. Espectrometria de massa pode lidar com esses desafios e, portanto, surgiu como uma poderosa ferramenta na biologia estrutural2,3,4,5. A maior vantagem de espectrometria de massa, no entanto, é a capacidade de identificar inequivocamente proteínas mesmo em misturas complexas e heterogêneas6. Para este fim, as proteínas geralmente são digeridas com endoproteinases e a mistura resultante do peptídeo é separada por cromatografia líquida e eluída diretamente para o espectrômetro de massa. Massas de peptídeo são posteriormente determinadas e íons precursor são selecionados para maior fragmentação dos peptides. Proteínas são então identificadas por busca do peptide e massas de fragmento correspondente contra um banco de dados conhecido. Este procedimento não só permite a identificação de peptídeos/proteínas, mas também suas modificações borne-translational que causar uma mudança em massa de peptídeos o precursor e os íons de fragmento carregando a modificação7. Algumas das muitas técnicas de espectrometria de massa estrutural se baseiam neste princípio4,8. Por exemplo, rotulagem técnicas tais como o hidrogênio deutério troca9,10, química rotulagem estratégias11,12, ou o radical hidroxilo pé impressão13,14 , dar insights sobre a acessibilidade de superfície das proteínas sob certas condições.
Outra técnica é (química) cross-linking envolvendo a ligação covalente de aminoácidos nas proximidades através de seus grupos funcionais. Por isso, reagentes químicos, reagentes UV-ativável ou ácidos aminados são independentes de15,16. Depois do cross-linking, as proteínas geralmente são hidrolisadas com proteases e reticulados di-peptídeos são analisados por espectrometria de massa acoplada a cromatografia líquida. A identificação dos produtos do cross-linking por banco de dados de pesquisa, no entanto, requer o uso de software especializado que concatenar sequências peptídicas de várias proteínas e regiões díspares17,18,19. O uso de cross-linkers químicas tem a vantagem que podem ser empregada para quase todos os complexos de proteína de interesse e não exige a incorporação de aminoácidos UV-ativável, que só pode ser alcançado quando expressar a proteína de interesse em células hospedeiras. Como tal, cross-linking é uma ferramenta versátil e foi empregado com sucesso em muitos estudos estruturais de proteínas grandes módulos (assemblies)20.
Espectrometria de massa de proteína intacta complexos (às vezes chamado de ‘nativa’ espectrometria de massa), por outro lado, envolve a análise de proteínas intactas e complexos sem hidrólise de proteínas em peptídeos. Ele revela a composição, heterogeneidade, estequiometria, topologia e subunidade interações da proteína complexos21,22. Em combinação com a mobilidade do íon, espectrometria de massa nativa mais permite a determinação da sua conformação23,24. Isso o torna uma ferramenta poderosa para a investigação estrutural de complexos de proteínas que são difíceis de avaliar por técnicas estruturais convencionais. No entanto, espectrometria de massa nativa requer buffers de análise que mantêm interações da proteína não-covalente durante a ionização electrospray. Isto geralmente é conseguido usando amortecedores aquosas, voláteis, tais como acetato de amônio25. Além disso, o instrumento modificações são necessárias para evitar a dissociação durante a transmissão em fase gasosa, o espectrômetro de massa26. Aplicado desta forma, muitos complexos de proteína (grande) foram analisados. Exemplos impressionantes são os estudos de ribossomas intacta27, ATP sintases28ou vírus29.
A combinação de espectrometria de massa nativa e cross-linking provou ser particularmente bem sucedida em estudos anteriores. Por exemplo, os stoichiometries de complexos de acompanhante, incluindo um inesperado dímero de Hsp70, poderiam ser obtidos experimentos de espectrometria de massa dos complexos proteína intacta, enquanto cross-linking química revelou o regime das proteínas na módulos (assemblies)30,31. Em um estudo diferente, foram estudados os efeitos das modificações borne-translational sobre uma intacta ATP sintase complexo. Espectrometria de massa nativa forneceu insights sobre a estabilidade de complexos de proteína na presença ou ausência de fosforilação ou acetilação de32,33. Então, um comparativo do cross-linking estratégia34 revelou mudanças conformacionais da proteína complexa sob diferentes condições.
Aqui, nós fornecemos os protocolos para identificação de proteínas por espectrometria de massa, cross-linking (química) e espectrometria de massa nativa, incluindo a análise dos dados e interpretação (Figura 1). A combinação de resultados complementares obtidas a partir desses métodos com a ajuda de dois complexos de proteína bem caracterizadas é demonstrada35. Nosso protocolo pode ser aplicado a qualquer conjunto de proteína que pode ser purificado em determinados pureza e concentração. A abordagem é em alguns casos limitados pela análise dos dados dos dados, ou seja, o tamanho do banco de dados do cross-linking empregada, que determina a necessária busca espaço e tempo. Além disso, a validação manual de ligações cruzadas identificadas é muitas vezes necessária e reduz ainda mais a saída. Espectrometria de massa nativa é limitada principalmente pela qualidade da amostra, por exemplo, amortecedores e adutos usado durante a purificação e a possibilidade de trocá-los por buffers aquosos e volátil. No entanto, complexos da proteína purificados para análise estrutural geralmente têm a qualidade necessária para análise de sucesso com nossos protocolos.
Protocolos são fornecidos para análise estrutural de espectrometria de massa base de complexos multi o subunit da proteína. As duas técnicas, descritas no protocolo, principalmente, entregar resultados complementares e são well-suited para obter insights sobre os arranjos estruturais dentro da proteína (-ligante) complexos que são difíceis de estudar por técnicas estruturais convencionais. Espectrometria de massa nativa oferece insights sobre stoichiometries de proteína, bem como interações da proteína através da análise de subcomplexes e módulos de interação estável. Cross-linking, por outro lado, produz informações sobre sites de contato diretos. Dependendo o cross-linker usado, uma certa flexibilidade pode ou deve ser incluída na análise.
Os protocolos fornecidos são em geral fácil de executar e não demorado. O protocolo inteiro pode ser executado dentro de uma semana e pode ser aplicado a quase todos os complexos da proteína, apesar de uma certa quantidade de proteína complexa é necessária para a análise bem sucedida. Preparação da amostra é simples e não requer especificamente os complexos de proteína purificada. No entanto, uma armadilha comum é a contaminação da amostra durante a preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseadas da proteína. Estas contaminações na maioria dos casos incluem a queratina que se originam de pó, pele ou cabelo. Portanto, extra tais como usando luvas e jalecos, filtração buffers de aquosas e usando solventes de alta pureza tenha cuidados durante a preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseadas da proteína. Outras proteínas contaminantes tais como acompanhantes geralmente são introduzidas durante a purificação de proteínas, por exemplo, quando usando marcas de afinidade. Nestes casos, purificação de proteínas deve ser melhorada, por exemplo, aumentando a etapas de lavagem. Em qualquer caso, as contaminações de proteína na amostra são facilmente identificadas durante a pesquisa de banco de dados, omitindo o filtro de taxonomia (i.e., procurando contra proteínas de todas as espécies). Se apenas alguns peptídeos são observados (ou seja, uma cobertura de baixa proteína poderia ser obtida), apesar de amostra suficiente estiver disponível, talvez seja necessário usar uma protease diferente durante a digestão. Em geral a tripsina produz um número suficiente de peptídeos; no entanto, em alguns casos, tais como proteínas de membrana ou membrana domínios de proteínas, é reduzir o número de sítios de clivagem tryptic e outras enzimas como alvo aminoácidos hidrofóbicos são uma escolha melhor.
Em termos de instrumentação, um instrumento particularmente modificado é necessário para espectrometria de massa nativa que mantém interações não covalentes durante a transferência para a fase gasosa. Vários tipos de instrumento foram introduzidos, incluindo instrumentos Q-ToF e orbitrap. Enquanto espectrómetros de massa Q-ToF modificados estão disponíveis comercialmente para espectrometria de massa nativa desde vários anos, este último só recentemente foram introduzido e na maioria dos casos requerem modificação especializados45. No entanto, a aplicação de instrumentos de alta resolução permitiu estudar a ligação de vários ligantes e sua quantificação46,47 e é promissor para aplicações futuras.
Para identificar di-peptídeos reticulados por espectrometria de massa acoplada a cromatografia líquida, podem ser aplicados os procedimentos padrão, com poucas modificações. No entanto, a pesquisa de banco de dados é o fator limitante como software especializado pode raramente lidam com grandes bases de dados e reduzidos bancos de dados contendo as subunidades de proteína dos complexos são necessários. Estudos recentes usados espectrometria de massa-cleavable cross-linkers visando interações da proteína em toda a célula lysates48,49. O uso de cross-linkers químicos que fragmentam em experimentos de espectrometria de massa em tandem principalmente produz peptídeos lineares (modificados pelo cross-linker), que podem ser identificados por mais fragmentação e banco de dados à procura de peptídeos lineares e isso reduz tempo de pesquisa e espaço de pesquisa computacional. No entanto, para realizar estas experiências, um analisador de massa ion trap ou um espectrômetro de massa híbrido com uma armadilha do íon é necessário. Em geral, como falsos positivos são uma questão importante, espectros de massa de reticulado peptídeos são frequentemente validados manualmente pela qualidade dos seus espectros de fragmento que amplia enormemente o tempo de análise de dados. Desenvolvimento de sistemas robustos de pontuação que podem ser aplicados sem mais etapas de validação são, portanto, possíveis aplicações futuras. Uma maneira de melhorar a análise de dados e reduzir o número de falsos positivos foi a introdução de cálculos da taxa falsa da descoberta e sua aplicação para cross-linking de conjuntos de dados50.
Em geral, as técnicas aqui descritas podem ser complementadas com ainda mais técnicas de espectrometria de massa (por exemplo, rotulagem covalente) para aumentar a saída da análise. Outras modificações e melhoramentos dos protocolos podem ser facilmente implementados. Como tal comparativo do cross-linking34 desvenda mudanças conformacionais na Assembleia de proteína. Novos desenvolvimentos em espectrometria de massa nativa hoje em dia permitem a análise de proteínas de membrana51,52 e suas interações com lipídios28,52,53,54 . Novos desenvolvimentos de espectrómetros de massa de alta resolução para espectrometria de massa nativa ter alargado o aplicativo e vinculação de ligante, por exemplo, vinculação de lipídios, proteínas de membrana, agora podem ser incluídos na análise45, 46. em combinação com abordagens de modelagem computacional, estas técnicas podem entregar modelos estruturais de diferentes resolução55. Se não há estruturas de cristal estão disponíveis para as subunidades de complexas ou única intactas, espectrometria de massa pode entregar primeiros insights sobre a topologia do complexo desconhecido e interações da proteína. Dependendo das técnicas utilizadas e os resultados obtidos, modelos de baixa resolução do complexo desconhecido podem ser obtidos56,57,58. Se homologia modelos ou estruturas de cristal estão disponíveis, as informações estruturais recebidas de espectrometria de massa podem render até quase nativo modelos59.
Em comparação com outras técnicas estruturais, espectrometria de massa tem a vantagem que requer quantidades de amostra baixa, ele pode lidar com amostras heterogêneas e é aplicável a complexos de proteínas de tamanho ilimitado. Além disso, a espectrometria de massa permite a investigação de sistemas dinâmicos da proteína. Populações diferentes da proteína ou proteína complexa que existem em solução geralmente são analisadas em conjunto e, portanto, ao contrário com outras técnicas estruturais que requerem a seleção de determinadas populações, todas as conformações são mantidas durante análise e são tributáveis em um experimento. Abordagens do cross-linking quantitativas foram recentemente introduzidas34,60,,61 e são promissoras para futuros aplicativos descrevendo mudanças conformacionais em condições diferentes.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos nossos colegas para debates úteis. Também agradecemos Ilme Schlichting e Karl-Peter Hopfner fornecendo complexos da proteína. Reconhecemos que o financiamento do Ministério Federal da educação e pesquisa (BMBF, ZIK programa, 03Z22HN22), os fundos europeus de Desenvolvimento Regional (Pedro, ZS/2016/04/78115) e o MLU Halle-Wittenberg a C.S. e financiamento do Wellcome Trust (109854/658 Z/15/Z) de A.P.
Chemicals, Reagents, Consumables | |||
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma Aldrich | H4034 | buffer |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | pH |
Acetonitrile Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A955-1 | solvent |
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) | Millipore | i.e. UFC500396 | buffer exchange, concentration |
Ammonium acetate solution | Sigma Aldrich | A2706 | native MS |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | in-gel digestion |
Ammonium solution | Sigma Aldrich | 9859 | pH |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) | Thermo Scientific | 21590 | cross-linker |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) | Thermo Scientific | 21595 | cross-linker |
Caesium iodide | Sigma Aldrich | 203033 | calibration |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | in-gel digestion |
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) | Harvard Apparatus | 30-0038 | native MS |
Disuccinimidyl suberate (DSS) | Thermo Scientific | 21655 | cross-linker |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D5545 | in-gel digestion |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D8418 | solvent |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818 | solvent |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
Instant Blue Coomassie staining solution | expedeon | ISB1L | staining solution for gel electrophoresis |
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) | life technologies | NP0323BOX | gel electrophoresis |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | In-gel digestion |
Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
Micro BioSpin 6 columns | BioRad | 732-6222 | buffer exchange |
NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | running buffer, gel electrophoresis |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) | invitrogen | NP0007 | sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis |
NuPAGE MES SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) | invitrogen | NP0004 | reducing Agent for gel electrophoresis |
PBS – phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | buffer |
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker | invitrogen | LC5925 | prestained Protein Marker for gel electrophoresis |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | ethanol precipitation |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
Trypsin | Sigma Aldrich | TRYPSEQ-RO (11418475001) | in-gel digestion |
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) | Sartorius | i.e. VS0101 | buffer exchange, concentration |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge | Thermo Scientific | 75002425 | |
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 | Sutter Instruments | P-1000 | |
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell | Invitrogen | EI0001 | |
Gold Coater Quorum Q150R S | Quorum Technologies Ltd. | Q150RS | |
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T | Heidolph Instruments | 544-41200-00 | |
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade | Waters (Micromass) | – | |
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) | Thermo Scientific | 164570 | |
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) | Thermo Scientific | 164213 | |
scalpel | Fisher Scientifc | 10463989 | |
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge | Thermo Scientific | SPD121DP-230 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tweezers AA | Sigma Aldrich | Z680184-1EA | |
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath | VWR | 142-0084 | |
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) | Thermo Scientific | 0726030+ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software, Software Tools, Database search | |||
Mascot | www.matrixscience.com | ||
Massign | http://massign.chem.ox.ac.uk | ||
MassLynx | Micromass | ||
MassMatrix | Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010) | ||
MaxQuant | Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008) | ||
pLink | Yang, B. Nat Methods 9 (2012) | ||
pXtract conversion tool | http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html | ||
UniDec | Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015) | ||
XCalibur | Thermo Scientific | ||
XiNET | http://crosslinkviewer.org | ||
XLinkX | Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015) | ||
xQuest | Rinner, O. Nat Methods 5 (2008) | ||
Xvis | https://xvis.genzentrum.lmu.de |