प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का आर्किटेक्चर उनके फंक्शन के लिए जरूरी है । विभिंन जन spectrometric तकनीक का मेल शक्तिशाली साबित करने के लिए अपने विधानसभा का अध्ययन । हम रासायनिक पार से जोड़ने और देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते है और शो कैसे इन पूरक तकनीकों के लिए बहु की वास्तुकला स्पष्ट-यूनिट प्रोटीन सभाओं मदद करते हैं ।
प्रोटीन अपने लाइगैंडों के साथ बातचीत करने के लिए सक्रिय और गतिशील विधानसभाओं जो विभिंन सेलुलर कार्यों बाहर ले फार्म । Elucidating इन बातचीत इसलिए सेलुलर प्रक्रियाओं की समझ के लिए मौलिक है । हालांकि, कई प्रोटीन परिसरों गतिशील विधानसभाओं रहे है और पारंपरिक संरचनात्मक तकनीक तक पहुंच नहीं है । जन स्पेक्ट्रोमेट्री इन विधानसभाओं के संरचनात्मक जांच करने के लिए योगदान देता है, और विशेष रूप से विभिंन मास spectrometric तकनीकों का संयोजन उनके संरचनात्मक व्यवस्था में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि बचाता है ।
इस अनुच्छेद में, हम आवेदन और दो पूरक जन spectrometric तकनीक, अर्थात् रासायनिक पार जन स्पेक्ट्रोमेट्री और देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित जोड़ने के संयोजन का वर्णन । रासायनिक पार जोड़ने रासायनिक रिएजेंट का उपयोग करके करीब निकटता में अमीनो एसिड की आबंध लिंकेज शामिल है । साथ पाचन के बाद, क्रॉस-लिंक्ड डि-पेप्टाइड्स जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान कर रहे हैं और प्रोटीन बातचीत साइटों का पर्दाफाश कर रहे हैं । दूसरी ओर देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री एक मास स्पेक्ट्रोमीटर के गैस चरण में बरकरार प्रोटीन सभाओं का विश्लेषण है । इसमें प्रोटीन stoichiometries के साथ-साथ प्रोटीन और ligand इंटरैक्शन का पता चलता है. दोनों तकनीक इसलिए प्रोटीन की संरचना पर पूरक जानकारी देने ligand विधानसभाओं और उनके संयोजन पिछले अध्ययन में शक्तिशाली साबित कर दिया ।
प्रोटीन सभाओं की संरचनात्मक जांच सेलुलर प्रक्रियाओं की समझ के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो गई है । नतीजतन, कई, तकनीक और विकसित किया गया है संरचनात्मक जीवविज्ञान1में सुधार । हालांकि, इन तकनीकों के आकार, लचीलापन, या जांच के तहत प्रोटीन परिसरों के विविधता के कारण अपने आवेदन में कभी भी सीमित हैं । जन स्पेक्ट्रोमेट्री इन चुनौतियों से निपटने के लिए और कर सकते हैं, इसलिए, संरचनात्मक जीवविज्ञान2,3,4,5में एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा । मास स्पेक्ट्रोमेट्री का सबसे बड़ा लाभ, तथापि, स्पष्ट रूप से भी जटिल और विषम मिश्रण6में प्रोटीन की पहचान करने की क्षमता है । इस अंत करने के लिए, प्रोटीन आमतौर पर endoproteinases के साथ पचा रहे हैं और परिणामस्वरूप पेप्टाइड मिश्रण तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग किया जाता है और सीधे मास स्पेक्ट्रोमीटर में eluted. पेप्टाइड मास बाद में निर्धारित कर रहे हैं और अग्रदूत आयनों पेप्टाइड्स के आगे विखंडन के लिए चयनित कर रहे हैं. प्रोटीन तो एक ज्ञात डेटाबेस के खिलाफ पेप्टाइड और इसी टुकड़ा जनता खोज द्वारा की पहचान कर रहे हैं । यह प्रक्रिया न केवल पेप्टाइड्स/प्रोटीन की पहचान की अनुमति देता है, लेकिन यह भी उनके बाद अनुवाद संशोधन जो प्रणेता पेप्टाइड्स के एक बड़े पैमाने पर बदलाव और टुकड़ा7संशोधन ले जा आयनों का कारण. संरचनात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री में कई तकनीकों में से कुछ इस सिद्धांत4,8पर आधारित हैं । उदाहरण के लिए, लेबलिंग तकनीक जैसे हाइड्रोजन ड्यूटेरियम विनिमय9,10, रासायनिक लेबलिंग रणनीतियों11,12, या हाइड्रॉक्सिल कट्टरपंथी पैर मुद्रण13,14 , कुछ शर्तों के तहत प्रोटीन की सतह पहुंच में अंतर्दृष्टि दे ।
एक अंय तकनीक है (रासायनिक) पार अपने कार्यात्मक समूहों के माध्यम से करीब निकटता में अमीनो एसिड के आबंध संपर्क को शामिल जोड़ने । इसके लिए केमिकल रिएजेंट, यूवी activatable रिएजेंट, या अमीनो एसिड15,16कार्यरत हैं । पार से जोड़ने के बाद, प्रोटीन आमतौर पर hydrolyzed के साथ कर रहे है और पार से जुड़े di-पेप्टाइड्स तरल क्रोमैटोग्राफी-युग्मित जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । पार से जोड़ने की पहचान डेटाबेस खोज, तथापि, विशेष सॉफ्टवेयर है जो विभिंन प्रोटीन और असमान क्षेत्रों के पेप्टाइड अनुक्रम जोड़ना17,18,19के उपयोग की आवश्यकता है । रासायनिक पार के प्रयोग के लिंक का लाभ है कि यह लगभग हर प्रोटीन ब्याज के परिसर में नियोजित किया जा सकता है और यूवी-activatable अमीनो एसिड, जो केवल जब मेजबान कोशिकाओं में ब्याज की प्रोटीन व्यक्त प्राप्त किया जा सकता है की आवश्यकता नहीं है । जैसे, पार से जोड़ने एक बहुमुखी उपकरण है और सफलतापूर्वक भी बड़े प्रोटीन20विधानसभाओं के कई संरचनात्मक अध्ययन में कार्यरत थे ।
बरकरार प्रोटीन परिसरों की सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री (कई बार कहा जाता है ‘ देशी ‘ जन स्पेक्ट्रोमेट्री), दूसरी ओर, hydrolysis के बिना बरकरार प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों के विश्लेषण शामिल है । यह संरचना, विविधता, stoichiometry, टोपोलॉजी, और प्रोटीन परिसरों की उपइकाई बातचीत21,22से पता चलता है । आयन गतिशीलता के साथ संयोजन में, देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री आगे अपने अनुरूप23,24के निर्धारण की अनुमति देता है । यह प्रोटीन परिसरों कि पारंपरिक संरचनात्मक तकनीक द्वारा मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल है की संरचनात्मक जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाता है । हालांकि, मूल मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण बफ़र्स जो electrospray ionization के दौरान गैर-आबंध प्रोटीन बातचीत बनाए रखने की आवश्यकता है । यह आमतौर पर जलीय एसीटेट जैसे अमोनियम का उपयोग करके प्राप्त की है, वाष्पशील बफ़र्स25। इसके अलावा, साधन संशोधनों को जन स्पेक्ट्रोमीटर के गैस चरण में संचरण के दौरान पृथक्करण को रोकने के लिए आवश्यक हैं26. इस तरह से लागू, कई (बड़े) प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण किया गया । प्रभावशाली उदाहरण बरकरार ribosomes27, एटीपी synthases28, या वायरस29के अध्ययन कर रहे हैं ।
देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री और परस्पर जोड़ने का संयोजन पिछले अध्ययनों में विशेष रूप से सफल साबित हुआ. मसलन, एक अप्रत्याशित Hsp70 डिमर सहित निगरानी कॉम्प्लेक्सों का stoichiometries, बरकरार प्रोटीन कॉम्प्लेक्सों के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगों से प्राप्त किया जा सकता था, जबकि केमिकल क्रॉस जोडऩे में प्रोटीन्स की व्यवस्थाओं का पता चला. सभाओं30,31. एक अलग अध्ययन में, एक बरकरार एटीपी सिंथेस परिसर पर पोस्ट-शोधों संशोधनों के प्रभाव का अध्ययन किया गया. देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री उपस्थिति या फास्फारिलीकरण या acetylation३२,३३की अनुपस्थिति में प्रोटीन जटिल स्थिरता में अंतर्दृष्टि प्रदान की है । एक तुलनात्मक पार से जोड़ने की रणनीति३४ तो विभिंन परिस्थितियों में प्रोटीन परिसर के गठन के परिवर्तन का पता चला ।
यहां, हम जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रोटीन की पहचान के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, (रासायनिक) पार से जोड़ने, और देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री, डेटा विश्लेषण और व्याख्या सहित (चित्रा 1) । दो अच्छी तरह से विशेषता प्रोटीन परिसरों की मदद से इन तरीकों से प्राप्त पूरक परिणामों के संयोजन३५का प्रदर्शन किया है । हमारे प्रोटोकॉल किसी भी प्रोटीन विधानसभा जो कुछ शुद्धता और एकाग्रता पर शुद्ध किया जा सकता करने के लिए लागू किया जा सकता है । दृष्टिकोण कुछ मामलों में पार के डेटा विश्लेषण द्वारा सीमित डेटा, यानी, कार्यरत डेटाबेस के आकार, जो आवश्यक खोज स्थान और समय निर्धारित करता है । इसके अलावा, पहचान पार लिंक के मैनुअल सत्यापन अक्सर आवश्यक है और आगे उत्पादन कम कर देता है । देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री ज्यादातर नमूना गुणवत्ता द्वारा सीमित है, उदाहरणके लिए, बफ़र्स और adducts शोधन के दौरान इस्तेमाल किया और उंहें जलीय और अस्थिर बफ़र्स द्वारा विनिमय की संभावना है । हालांकि, प्रोटीन परिसरों संरचनात्मक विश्लेषण के लिए शुद्ध आमतौर पर हमारे प्रोटोकॉल के साथ सफल विश्लेषण के लिए आवश्यक गुणवत्ता है ।
प्रोटोकॉल बहु-इकाई प्रोटीन परिसरों के जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित संरचनात्मक विश्लेषण के लिए प्रदान की जाती हैं । दो तकनीकों, प्रोटोकॉल में वर्णित है, ज्यादातर पूरक परिणाम देने और अच्छी तरह से प्रोटीन के भीतर संरचनात्मक व्यवस्था में अंतर्दृष्टि लाभ (-ligand) परिसरों जो पारंपरिक संरचनात्मक तकनीक से अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो अनुकूल हैं । देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन stoichiometries में अंतर्दृष्टि उद्धार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपपरिसरों और स्थिर संपर्क मॉड्यूल का विश्लेषण करके प्रोटीन बातचीत । पार से जोड़ने, दूसरी ओर, सीधे संपर्क साइटों पर पैदावार जानकारी । क्रॉस-linker इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है, एक निश्चित लचीलापन कर सकते है या विश्लेषण में शामिल किया जाना चाहिए ।
प्रदान की प्रोटोकॉल सामांय में आसान प्रदर्शन करने के लिए और समय लेने वाली नहीं हैं । पूरे प्रोटोकॉल एक सप्ताह के भीतर निष्पादित किया जा सकता है और लगभग सभी प्रोटीन परिसरों के लिए लागू किया जा सकता है, हालांकि, सफल विश्लेषण के लिए प्रोटीन परिसर की एक निश्चित राशि की आवश्यकता है । नमूना तैयारी सरल है और विशेष रूप से शुद्ध प्रोटीन परिसरों की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, एक आम ख़तरा मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटीन पहचान के लिए नमूना तैयार करने के दौरान नमूने का संदूषण है । ज्यादातर मामलों में इन संदूषणों keratins जो धूल से उत्पंन, त्वचा, या बाल शामिल हैं । इसलिए, इस तरह के दस्ताने और प्रयोगशाला कोट पहने हुए, जलीय बफ़र्स निस्पंदन, और उच्च शुद्धता सॉल्वैंट्स का उपयोग कर के रूप में अतिरिक्त देखभाल बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटीन पहचान के लिए नमूना तैयारी के दौरान लिया जाना चाहिए । chaperones जैसे अंय दूषित प्रोटीन आमतौर पर प्रोटीन शुद्धि के दौरान शुरू की, जैसे, जब संबंध टैग का उपयोग कर रहे हैं । इन मामलों में, प्रोटीन शुद्धि सुधार किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए धोने कदम बढ़ाने के द्वारा । किसी भी मामले में, प्रोटीन के नमूने में संक्रमण आसानी से वर्गीकरण फ़िल्टर (यानी, सभी प्रजातियों से प्रोटीन के खिलाफ खोज) का लोप करके डेटाबेस खोज के दौरान पहचाने जाते हैं । यदि केवल कुछ पेप्टाइड्स मनाया (यानी, एक कम प्रोटीन कवरेज प्राप्त किया जा सकता है), भले ही पर्याप्त नमूना उपलब्ध है, यह पाचन के दौरान एक अलग proteinase का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है. सामान्य Trypsin में पर्याप्त संख्या में पेप्टाइड की पैदावार; हालांकि, झिल्ली प्रोटीन या प्रोटीन की झिल्ली डोमेन के रूप में कुछ मामलों में, tryptic क्लीवेज साइटों की संख्या कम हो गई है और अन्य एंजाइमों hydrophobic अमीनो एसिड लक्ष्यीकरण एक बेहतर विकल्प हैं.
इंस्ट्रूमेंटेशन के संदर्भ में, एक विशेष रूप से संशोधित साधन देशी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री जो गैस चरण में स्थानांतरण के दौरान गैर आबंध बातचीत का कहना है के लिए आवश्यक है. क्यू-तोफ और orbitrap इंस्ट्रूमेंट्स सहित कई साधन प्रकार पेश किए गए हैं । जबकि संशोधित Q-तोफ मास स्पेक्ट्रोमीटर कई वर्षों के बाद से देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, बाद में ही हाल ही में शुरू किए गए थे और ज्यादातर मामलों में विशेष संशोधन४५की आवश्यकता है । हालांकि, उच्च संकल्प उपकरणों के आवेदन एकाधिक लाइगैंडों और उनके ठहराव४६के बंधन का अध्ययन करने की अनुमति दी,४७ और भविष्य अनुप्रयोगों के लिए वादा कर रहा है ।
तरल क्रोमैटोग्राफी-युग्मित जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा क्रॉस-लिंक्ड डि-पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए, कुछ संशोधनों के साथ मानक कार्यविधियां लागू की जा सकती हैं । हालांकि, डेटाबेस खोज विशेष सॉफ़्टवेयर शायद ही कभी बड़े डेटाबेस के साथ सौदा कर सकते है के रूप में सीमित कारक है, और कम प्रोटीन वाले परिसरों के उपइकाईयों युक्त डेटाबेस आवश्यक हैं । हाल के अध्ययनों से पूरे सेल lysates४८,४९में प्रोटीन बातचीतकोलक्षित जन स्पेक्ट्रोमेट्री-सट क्रॉस-लिंकर्स का इस्तेमाल किया । रासायनिक पार से लिंकर का उपयोग करें कि मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगों में टुकड़ा ज्यादातर रैखिक पेप्टाइड्स पैदावार (क्रॉस-linker द्वारा संशोधित), जो आगे विखंडन और डेटाबेस रैखिक पेप्टाइड्स की खोज द्वारा पहचाना जा सकता है, और यह कम कर देता है खोज समय और गणना की खोज अंतरिक्ष । हालांकि, इन प्रयोगों, एक आयन ट्रैप जन विश्लेषक या एक आयन जाल के साथ एक संकर जन स्पेक्ट्रोमीटर करने के लिए आवश्यक है. सामांय में, के रूप में झूठी-सकारात्मक एक महत्वपूर्ण मुद्दा है, पार से जुड़े बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा पेप्टाइड्स अक्सर अपने टुकड़ा स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता है जो डेटा विश्लेषण समय काफी विस्तार से मैंयुअल रूप से मांय हैं । मजबूत स्कोरिंग प्रणालियों है कि आगे सत्यापन कदम के बिना लागू किया जा सकता है इसलिए संभावित भविष्य अनुप्रयोगों के विकास । एक तरह से डेटा विश्लेषण में सुधार करने के लिए और झूठी-सकारात्मक की संख्या को कम करने के लिए झूठी खोज दर गणना और उनके आवेदन को पार करने के लिए डेटा सेट५०का परिचय था ।
सामांय में, यहां वर्णित तकनीकों को आगे बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीकों के साथ पूरित किया जा सकता है (उदा, आबंध लेबलिंग) विश्लेषण से उत्पादन बढ़ाने के लिए । अंय संशोधनों और प्रोटोकॉल के सुधार आसानी से लागू किया जा सकता है । इस तरह के तुलनात्मक पार से जोड़ने के रूप में३४ प्रोटीन विधानसभा में संरचना परिवर्तन सुलझाना । देशी मास स्पेक्ट्रोमेट्री में आगे की घटनाओं आजकल झिल्ली प्रोटीन के विश्लेषण की अनुमति दें५१,५२ और लिपिड के साथ उनकी बातचीत28,५२,५३,५४ . देशी जन स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमीटर के नए विकास आवेदन और ligand बंधन बढ़ा दिया है, जैसे, झिल्ली प्रोटीन के लिए लिपिड के बंधन, अब विश्लेषण४५में शामिल किया जा सकता है, ४६. गणनात्मक मॉडलिंग के दृष्टिकोण के साथ संयोजन में, इन तकनीकों अलग संकल्प५५के संरचनात्मक मॉडल वितरित कर सकते हैं । यदि कोई क्रिस्टल संरचनाओं बरकरार परिसर या एकल उपइकाईयों के लिए उपलब्ध हैं, मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन बातचीत और अज्ञात परिसर की टोपोलॉजी में पहली अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । इस्तेमाल तकनीक और परिणाम प्राप्त के आधार पर, अज्ञात परिसर के कम संकल्प मॉडल प्राप्त किया जा सकता है५६,५७,५८। यदि क्रिस्टल संरचनाओं या समरूपता मॉडल उपलब्ध हैं, संरचनात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री से प्राप्त जानकारी भी निकट देशी मॉडल५९उपज सकते हैं ।
अंय संरचनात्मक तकनीक के साथ तुलना में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री लाभ है कि यह कम नमूना मात्रा की आवश्यकता है, यह विषम नमूनों के साथ सौदा कर सकते है और असीमित आकार के प्रोटीन परिसरों के लिए लागू है । इसके अलावा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री गतिशील प्रोटीन प्रणालियों की जांच की अनुमति देता है । प्रोटीन या प्रोटीन जटिल है कि समाधान में मौजूद के विभिंन आबादी आम तौर पर एक साथ विश्लेषण कर रहे है और इसलिए, अंय संरचनात्मक तकनीक है जो कुछ आबादी के चयन की आवश्यकता के साथ विपरीत, सभी संरचनाओं के दौरान बनाए रखा जाता है विश्लेषण और एक प्रयोग में assessable हैं । मात्रात्मक पार से जोड़ने के दृष्टिकोण हाल ही में३४,६०,६१ शुरू किए गए और भविष्य के विभिंन परिस्थितियों में गठन के परिवर्तन का वर्णन अनुप्रयोगों के लिए वादा कर रहे हैं ।
The authors have nothing to disclose.
हम उपयोगी विचार विमर्श के लिए हमारे सहयोगियों को धंयवाद । हम प्रोटीन कॉम्प्लेक्स प्रदान करने के लिए Ilme Schlichting और कार्ल-पीटर Hopfner का भी शुक्रिया अदा करते हैं । हम शिक्षा और अनुसंधान के लिए संघीय मंत्रालय से धन स्वीकार करते है (BMBF, ZIK कार्यक्रम, 03Z22HN22), यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधियों (EFRE, ZS/2016/04/78115) और MLU हाले-विटेनबर्ग को सीएस और धन से वेलकम ट्रस्ट (109854/658 z/15/z) एपी करने के लिए
Chemicals, Reagents, Consumables | |||
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma Aldrich | H4034 | buffer |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | pH |
Acetonitrile Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A955-1 | solvent |
Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO) | Millipore | i.e. UFC500396 | buffer exchange, concentration |
Ammonium acetate solution | Sigma Aldrich | A2706 | native MS |
Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | in-gel digestion |
Ammonium solution | Sigma Aldrich | 9859 | pH |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0) | Thermo Scientific | 21590 | cross-linker |
Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4) | Thermo Scientific | 21595 | cross-linker |
Caesium iodide | Sigma Aldrich | 203033 | calibration |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | in-gel digestion |
Capillaries (1.0 OD × 0.78 ID × 100 L mm) | Harvard Apparatus | 30-0038 | native MS |
Disuccinimidyl suberate (DSS) | Thermo Scientific | 21655 | cross-linker |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D5545 | in-gel digestion |
DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D8418 | solvent |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818 | solvent |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
Instant Blue Coomassie staining solution | expedeon | ISB1L | staining solution for gel electrophoresis |
Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well) | life technologies | NP0323BOX | gel electrophoresis |
Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | In-gel digestion |
Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
Micro BioSpin 6 columns | BioRad | 732-6222 | buffer exchange |
NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | running buffer, gel electrophoresis |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4 ×) | invitrogen | NP0007 | sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis |
NuPAGE MES SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE MOPS SDS Running buffer | life technologies | NP0001 | gel electrophoresis |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10 ×) | invitrogen | NP0004 | reducing Agent for gel electrophoresis |
PBS – phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | buffer |
SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker | invitrogen | LC5925 | prestained Protein Marker for gel electrophoresis |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | ethanol precipitation |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
Trypsin | Sigma Aldrich | TRYPSEQ-RO (11418475001) | in-gel digestion |
Vivaspin centrifugal devices (different MWCO) | Sartorius | i.e. VS0101 | buffer exchange, concentration |
Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge | Thermo Scientific | 75002425 | |
Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000 | Sutter Instruments | P-1000 | |
Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell | Invitrogen | EI0001 | |
Gold Coater Quorum Q150R S | Quorum Technologies Ltd. | Q150RS | |
Horizontal gel shaker Rotamax 120 T | Heidolph Instruments | 544-41200-00 | |
Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade | Waters (Micromass) | – | |
reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size) | Thermo Scientific | 164570 | |
reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size) | Thermo Scientific | 164213 | |
scalpel | Fisher Scientifc | 10463989 | |
SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge | Thermo Scientific | SPD121DP-230 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
Tweezers AA | Sigma Aldrich | Z680184-1EA | |
Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath | VWR | 142-0084 | |
UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source) | Thermo Scientific | 0726030+ | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software, Software Tools, Database search | |||
Mascot | www.matrixscience.com | ||
Massign | http://massign.chem.ox.ac.uk | ||
MassLynx | Micromass | ||
MassMatrix | Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010) | ||
MaxQuant | Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008) | ||
pLink | Yang, B. Nat Methods 9 (2012) | ||
pXtract conversion tool | http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html | ||
UniDec | Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015) | ||
XCalibur | Thermo Scientific | ||
XiNET | http://crosslinkviewer.org | ||
XLinkX | Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015) | ||
xQuest | Rinner, O. Nat Methods 5 (2008) | ||
Xvis | https://xvis.genzentrum.lmu.de |