Summary
순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이 동안 폐 식민을 촉진 역할을 해독 하는 동물 모델 필요 합니다. 여기, 우리가 설립 하 고 성공적으로 수행는 vivo에서 시험의 구체적으로 테스트를 폐 식민 CTCs에 고분자 fibronectin (polyFN) 어셈블리의 요구.
Abstract
전이 암 사망의 주요 원인입니다. 순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이, 폐 식민 CTCs에 의해 비판적으로 공헌 한다 폐 전이성 프로세스 초기에 홍보에 역할을 적극적으로 조사 되었습니다. 따라서, 동물 모델은 유일한 접근 전이의 전체 조직의 프로세스를. 우리는 vivo에서 폐 식민 분석 결과 설립 문제가 혈관 넘쳐 흐름 CTCs의 기여를 조사 하기 위한 이전 실험 설계에서 발생, 그 긴 장기 형광 세포 추적 프로그램, carboxyfluorescein 그리고 에스테 르 succinimidyl (CFSE), 일시 중단 된 종양 세포를 사용 폐 관류 폐 제거, confocal 영상 및 정량화 이전 비 특히 갇혀 CTCs를 수행 했다. CTC 표면에 고분자 fibronectin (polyFN) 전이성 종양 조직의 최종 설립에 폐 식민 중재 발견 되었습니다. 여기, 특히 polyFN 어셈블리 CTCs에 폐 식민 넘쳐 흐름의 요구 사항을 테스트, 단기 수행 있는 폐 식민 분석 실험 중단 루이스 폐 암 세포 (LLCs) 안정적으로 FN-shRNA (shFN)를 표현 하거나 출 격-shRNA (shScr)와 20 미리 레이블이 CFSE의 μ M C57BL/6 쥐로 정 맥 주사 했다. 우리는 성공적으로 마우스 폐를 식민지로 shFN LLC는 세포의 능력 shScr LLC 셀에 비해 현저 하 게 점감 되었다 설명 했다. 따라서,이 단기 방법론 특히 식민지 폐 순환 내 CTCs의 능력을 보여 주기 위해 널리 적용할 수 있습니다.
Introduction
전이 암 죽음1,2의 주요 원인입니다. 기본 조직에서 파생 하는 종양 세포에에서 순환을 입력 하 고 전에 그들은 다양 한 hematogenous 도전, 예를 들면, anoikis, 면역 공격, 및 혈압 또는 기하학적 구속 조건에서 전단 응력으로 인해 손해 생존 식민지 먼 장기 전이3,4,,56의 성공을 지시 된 중요 한 단계를 수 있습니다. 순환 종양 세포 (CTCs) 특성화 및 종양 악성 종양, 전이, 암 환자7,8 의 생존 율과 이러한 특성을 상호 활발 한 노력에 현재 되었습니다 따라서, , 9. 암 전이의 과정 vivo에서 이벤트를 구체적으로 묘사, 동물 모델은 유일한 접근 전이10,11,12의 전체 조직의 프로세스를 .
CTCs 먼 장기1,2의 식민지를 포함 하 여 여러 개의 셀룰러 이벤트를 통해 전이성 종양 조직 된다. 그러나, 가장 일반적으로 사용 되 전이 분석 실험13,,1415 먼 장기의 CTC 식민지를 관찰 하는 방법을 제공 하지 않습니다. 따라서,는 vivo에서 분석 결과 디자인 CTC 식민 시각화에 대 한 긴급 하 게 필요 합니다. 하지만 여러 vivo에서 비보 전 짧은 기간 폐 식민 분석 실험 설계 되었습니다, 문제 및 단점 남아 있습니다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP) 동안-overexpressing 종양 세포에서 사용 된 분석 실험22,23, 안정적 transfect 아래에서 충분 한 GFP 형광 강도 종양 세포를 복제 하는 시간이 걸립니다 현미경입니다. 마찬가지로, 비록 GFP 표현 종양 세포를 대체 하 긴 기간 셀 추적 CFSE와 종양 세포의 얼룩 과도 고용 된 남아 CFSE 표시 된 종양 세포 부착 여부를 판단 하기 어렵거나 단지 내 존재는 삭제 먼 장기16,17의 맥 관 구조.
CTCs의 표면에 고분자 fibronectin (polyFN) 전이성 종양 조직18,,1920,21,22의 마지막 설립에 비판적으로 기여할 발견 되었습니다. . 여기, 우리가 수행 단기 폐 식민 분석 실험 중단된 루이스 폐 암 셀 (LLCs)에서 안정적으로 표현 하는 FN-shRNA (shFN) 또는 출 격-shRNA (shScr) 고 미리 CFSE와 C57BL/6 쥐로 정 맥 주사 했다. 2-3 일 후, 마우스 폐 처음 confocal 현미경 검사 법 및 폐 식민지 LLCs의 정량화를 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)를 완전히 복종 되기 전에 맥 관 구조 내에서 연결 되지 않은 CTCs 제거와 함께 끼얹는다 했다. 우리가 명확 하 게 보여주었다 폐 식민지 shFN LLCs의 숫자와 종양 혹 shScr LLCs, 실질적으로 식민과 CTCs에의 성장 촉진에 CTCs에 polyFN 어셈블리의 역할을 확실 한지 알아보는 비해 크게 감소 했다 그는 폐입니다. 우리의 연구 영장 추가 암 전이에서 polyFN의 역할에 대 한 조사.
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Protocol
모든 실험 쥐에 우리의 연구소 (관리 및 실험 동물의 사용, NCKU 의학 대학에 대 한 가이드)의 지침에 따라 수행 했다.
1. 악기, 문화 미디어, 및 요리 준비
- 시작 하기 전에 실험 프로토콜, 메 마른 외과 봉합, 1 mL 주사기 26 G/0.5 c m 바늘 (대 한 꼬리 정 맥 주사), 얻을 3 mL 주사기 24 G/3 c m 바늘 (대 한 폐 관류), Dulbecco의 수정이 글 미디어 (DMEM), 트립 신-EDTA 솔루션 (5 g/L 트립 신 및 0.53 m m), 소 태아 혈 청 (FBS), 1 x PBS (137 m NaCl m, 2.7 m m KCl, 10mm 나2포4및 1.8 m m KH2포4), 그리고 6 cm 문화 요리.
2. 준비 및 서 스 펜 션에 종양 세포의 복구
- 살 균 Dulbecco의 수정이 글 미디어 (DMEM) 10% 또는 20% 포함 된 준비 FBS 갓 추가 2mm L-글루타민, 1 x PBS, 0.05% 트립 신-EDTA.
- 10% 보충 DMEM 셀 문화 37 ° C에서 FBS 문화 접시에 70-80% 합류 있을 때까지 그들을 성장 하 고.
- 뒤에 두 세척 살 균 1 x PBS의 2 mL와 함께 요리에서 문화 미디어 (DMEM)를 제거 합니다.
- 0.05%의 1 mL를 추가 모든 세포를 철저 하 게 요리에 트립 신-EDTA. 즉시 솔루션의 800 μ를 제거 하 고 요리에만 200 μ를 떠나. 30에 대 한 37 ° C에서 요리를 품 어 s (셀 유형)에 따라 1 분 및 일시 중단된 상태에서 세포의 대부분은 때까지 기다립니다.
- 신선한 DMEM 1 mL을 추가 10% 포함 된 트립 신 하 고 적극적으로 효소 활동을 중지 하는 요리에 직접 FBS 플라스틱 셀 서 스 펜 션 아래로 단일 세포 현 탁 액을 준비 하는 1000 µ L 피 펫과.
- 접시에서 1.5 mL microcentrifuge 튜브 셀을 전송 하 고 162 x g 3 분에 실 온에서 셀 아래로 회전.
- 상쾌한 발음 하 고 resuspend 종양 세포 1.5 mL 20 %FBS 및 이상 끝 포함 된 DMEM 회전 2 h 37 ° C에서에 셀.
참고: 경우 매체 복구 하는 동안 노란색, 교환 20% 포함 된 신선한 매체와 오래 된 매체 FBS.
3. 형광 착 색 및 Carboxyfluorescein Succinimidyl 에스테 르 (CFSE)에 종양 세포의 분석
- 정지에서 세포 복구, 후 Trypan 파랑 Neubauer 챔버 titrating 복용량을 얼룩이 지기 형광 세기에 적절 한 실행 가능한 핸드폰 번호를 계산 하 고 꼬리 정 맥 주입.
- 3 분 및 resuspend 수송과 셀의 1 mL에 1 x PBS, 실내 온도 3 분 162 x g에서 원심 분리 뒤 소독에 대 한 실 온에서 162 x g에서 셀 아래로 회전 합니다.
- 500 µ L 10를 포함 하는 1 X PBS의 수송과 셀 resuspend %FBS 0, 5, 10, 20, 또는 40 µ M CFSE 복용량 적정을 위한 37 oC 어둠 속에서 10 분 동안에 세포 현 탁 액을 품 어 고.
- 3 분 동안 실 온에서 162 x g에서 셀 아래로 회전 하 고 1% 포함 된 DMEM의 4 mL와 수송과 셀 resuspend FBS. 이 세척 단계 세 번 더 반복 합니다. 마지막 세척에 대 한 혼자 DMEM의 4 mL와 수송과 셀 resuspend
- 꼬리 정 맥 주입 또는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 단일 셀의 형광 강도 계량 분석 CFSE 표시 된 셀을 대상 합니다.
참고: 얼음 FACS 분석 또는 꼬리 정 맥 주사를 수행 하기 전에 셀을 계속.
4. 폐 식민 분석 결과
- 20 µ M CFSE와 함께 표시 하는 셀을 준비 (3.4 통해 단계 3.1 참조).
참고: 종양 세포, FACS 분석에서 적정 결과에 따라 라벨 CFSE의 작업 복용량 결정 (단계 3.3 참조). - 4-6 주 꼬리 워밍업-오래 된 남성 C57BL/6 마우스 (6 쥐) 마우스 꼬리 혈관을 팽창 하는 마우스-의해-마우스 기준 5-10 분 위한 할로겐 램프로.
- 철저 하 게 혼합 하 고 (5 x 106 셀/mL의 최종 셀 밀도)와 세포 현 탁 액에서 모든 거품을 피하고 1 mL (26Gx1/2) 주사기 CFSE 표시 된 종양 세포를 발음.
- 신중 하 게 주사 1 x10 마우스 restrainer에 제기 해야 하는 마우스 꼬리 정 맥으로 DMEM의 200 µ L에서6 CFSE 표시 된 종양 세포.
참고: 동안 주입, 바늘 꼬리 정 맥의 루멘에 직접 배치 됩니다 경우 종양 세포 한다 쉽게 배달 순환으로 주사기에 하드 밀어 필요 없이. 경우를 통해 종양 세포를 밀어, 그들은 있다 가장 가능성이 되었습니다 주입 꼬리 정 맥 이외의 피하 공간으로. - 쥐를 두 그룹으로 CFSE 표시 된 종양 세포를 정 맥으로 받은 분할: 하나의 그룹 confocal 현미경 검사 법 이어서 폐 관류를 받게 될 것 이다 및 ImageJ 정량화 폐 식민 분석 결과 다른 것에서 남아 있을 것입니다 혼자 4-5 장기적인 폐 식민 주 시험.
- 20, 38, 또는 45 h와 시간 과정 및 복용량 의존 적정 하는 동안 정 맥으로 주입 하는 1 x 106 종양 세포, anesthetize 50-75 mg/kg zoletil 50, 잘 허용 하 고 적절 한 anesthetizer23와 종양 방위 쥐.
참고: 사용 하 여 수 의사 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 쥐의 눈에 연 고. - 경도 수술가 위로 잘라 피부와 가슴 지역에서 복 부 피하 조직. 수술가 위 및 심 혼 및 폐를 완전히 노출 하는 집게와 흉 막 캐비티를 엽니다.
참고: 혈관을 절단 하지 않도록 주의 해야 합니다. - 뛰어난 베 나 정 맥 (SVC) 및 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC) 폐 관류 동안 관류 솔루션의 역류를 방지 하기 위해 불 임 수술 봉합을 묶어.
- 좌 심 실 벽 균열 (약 2-4 m m) 폐 로부터 관류 솔루션을 배출 하 여 수술가 위로 잘라.
- 3 mL 주사기 1 x PBS를 우 심 실에 삽입 하 고 폐는 완전히 창백 하는 붉은 색에서 돌 때까지 폐 관류 동안 지속적인 흡입 물기 솔루션을 제거 합니다.
5. confocal 현미경 이미징 및 식민지 화 하는 폐 종양 세포의 분석
- 흉 막 캐비티에서 지금 창백 폐를 제거 하 고 멀리 외과 시저 및 집게24기도 및 결합 조직 인 대를 절단 하 여 5 개의 돌출부를 분리.
- 폐 엽의 배치에 대 한 두 개의 막대 사이의 공간을 가진 reticulate 텍스처를 생산 하기 위해 들 것 같은 폐 홀더 같이 그림 3B 에서 나일론 봉합 와인딩 하 여 약 2 개의 금속 막대를 준비 합니다. 6 cm 접시에 폐 소유자를 설정 합니다.
참고: 폐 홀더 confocal 현미경의 대물 렌즈 아래 폐 엽을 안정 시키기 위해 사용 됩니다. - 별장 및 폐 소유자의 reticulate 텍스처에 폐 엽을 수정. 표지 및 1 x PBS와 폐 엽을 축 축 하 게.
- 제목 6 cm 문화 접시 폐 엽 폐 식민지 종양 세포를 기록 하는 형광 이미지를 캡처 confocal 현미경 검사 법을 폐 소유자를 은닉.
- 이미징, 렌즈를 사용 하 여 (5 X, MPLN, 나: 0.1, WD: 20, 공기).
- NIBA (여기/방출, 470-495 nm/510-550 nm)을 필터 바퀴를 회전 하 고 488 nm 레이저를 사용 하 여 폐 엽에 형광 점의 이미지를 명확 하 게 시각화 CFSE를 자극.
- R690 (MaiTai HP DeepSee 레이저)에 대 한 필터 휠을 회전 2.0 스캔 µs/픽셀 스캔 속도 및 HV, 이득 및 오프셋 최적화 수준.
- 10 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 형광 이미지 (512 x 512 픽셀) 캡처 µs/픽셀 스캔 속도.
- 계량 하 고 앞에서 설명한21로 ImageJ GraphPad 소프트웨어를 사용 하 여 미세한 이미지를 통계적으로 분석.
6. 장기 폐 식민 분석 실험
참고: 4.1 4.5 통해 단계를 반복 합니다.
- 4-5 주 동안 종양 세포 접종 후 쥐를 희생 하 고 1 ~ 2 일 동안 Bouin의 유체25 그들의 폐를 고치십시오.
- 계량 하 고 통계 분석 소프트웨어21쥐 폐에서 종양 작은 혹.
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Representative Results
Vivo에서 폐 식민 분석 결과 수행 하기 전에 일시 중단 된 종양 세포에 polyFN 중재 폐 식민지 그리고/또한 전이, 촉진에 넘쳐 흐름 여부를 테스트 하려면 그림 1A 에서 볼 수 있듯이 우리가 먼저 적정 다른 CFSE, 세포 투과성 covalently 세포내 포함 하는 아민 분자26,27 일시 중단 된 종양 세포에 변화 하 고 꽤 긴 시간 동안 셀에 남아 형광 화합물 농도 우리는 그 종양 세포에 그림된 그림 1B와 복용량 의존 방식에서 CFSE와 효과적으로 표시 했다 발견. CFSE 라벨 6에서 그림 1 c에 나와 있는5 LLC 셀/mL는 거의 20 µ M로에 대 지를 도달 하는 x10.
때문에 풍부한 좁혀진된 모 세관 시스템을 물리적으로 폐 맥 관 구조 내의 CTCs의 흐름을 방해 수도, 폐 정 맥 주입 베어링 쥐에서 관류 CFSE 표시 LLC 셀으로 비 특히 갇혀 CTCs를 수행 그림 4에서 같이 각 시간 지점에서 폐 제거 전에 그림 1A 에 나와 있습니다. 관류, 전에 폐 했다 명확 하 게 붉은 혈액의 존재 때문에 볼 수 있듯이 왼쪽된 패널 그림 2. 폐 오른쪽 패널 그림 2에서 볼 수 있듯이 1 x PBS의 10-15 mL와 함께 재 관류 후 창백 되었다.
끼얹는다 마우스 폐는 흉 막 공간에서 제거 되었다, 후에 즉시 폐 엽 분리 하 고 폐 엽을 철저 하 게 취재 1 x PBS를 가진 그림 3A 에서 볼 수 있듯이 요리에 배치 하는 폐 보유자에 장착 했다. 그림 3B 에서 볼 수 있듯이 폐 보유자에 장착 하는 폐 엽 공초점 형광 현미경 그림 3A에서 볼 수 있듯이 대상이 되었다. CFSE 표시 된 종양 세포 폐를 식민지 화 했다에서 볼 수 있듯이 몇 군데는 상단 패널 그림 3C 와 같이 흑백 이미지 바 뀌는 하단 패널 그림 3C J 이미지 소프트웨어와 함께 폐 식민의 정량화를 촉진 하기 위하여.
우리 정 맥으로 주입 하는 shScr 또는 shFN LLC 셀 20 µ CFSE M으로 표시 되었고 confocal 현미경 이미징 및 폐 perfusions를 수행 하기 전에 시간 코스 24-72 h에서 기다렸다. 그림 4B 에 설명 된 셀 6 쥐 같이 그림 4A ImageJ 소프트웨어에 계시는 상당히 적은 shFN LLC 셀 shScr LLC 셀 보다 했다 계산 38 h 45 h 시간 포인트에서로 폐 식민지 종양의 정량화 . 이유는 왜 폐 식민지 shScr와 shFN LLC 셀 점차적으로 점감의 숫자는 매우 가능성이 지속적인 세포 독성도 이미 식민지 LLC 셀에 대 한 순환의 면역에 의해가 해지 때문. 이 결과 CTCs에 그 polyFN 실제로 폐에서 완전 한 전이를 선도 하는 정 맥의 aliquots를 받고 일부는 마우스에 결과 밝혀 LLC 세포에 의해 폐 식민 중재에 필요한 제안 하는 모두는 CFSE 표시 된 shScr 및 shFN LLC 셀 그림 4 에서 볼 수 있듯이 폐 식민 분석 실험에 대 한 aloneuntil 폐 종양 혹 그림 5A 에서 볼 수 있듯이 실험 종양 전이 분석 결과에서 개발 되었다 남아 있었다 및 5B.
그림 1: 식민지의 분석 결과 폐에에서 종양 세포를 라벨에 대 한 CFSE 농도의 적정. (A) 폐 식민 분석 결과 및 프로토콜 섹션에서 자세한 실험 전이 분석 결과 대 한 절차의 개요 그림. (B) FACS 분석 CFSE의 다양 한 농도와 스테인드 했다 LLC 셀의 CFSE 형광 강도 대 한. (C) 형광 강렬 다양 한 CFSE 농도의 기능으로 구성 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 폐 관류 전후. 하기 전에 폐의 대표 이미지 (unperfused; Unperf입니다.) 후 (끼얹는다. Perf입니다.) 폐 관류를 수행. 골드 스타: 심장. 흰색 화살표: IVC/SVC 폐쇄 넥타이. 빨간색 화살표: 전과 재 관류 후 같은 마우스의 폐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 형광 confocal 현미경 검사 법에 대 한 폐 보유자에 끼얹는다 폐 엽의 장착. Confocal 현미경 검사 법에 대 한 폐 보유자에 폐 마운트의 (A) 체계. (B) 3 끼얹는다 폐 엽 폐 소유자의 대표 이미지. (C) 폐 식민지 CFSE 형광 이미지 J 소프트웨어에 의해 정량화에 대 한 LLC 셀의 대표 이미지. 상단 패널: 일반 이미징. 하단 패널: 흑백 이미지 반전. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 시간 코스 이미징, 정량화, 및 폐에 대 한 통계 분석 식민지 shScr 및 shFN LLC 세포 폐 식민 분석 결과에서 폐 관류 후. (A) 대표 흑백 이미지 (형광 이미지에서 변환) 광범위 한 폐 관류 후와 같이 다양 한 시간 지점에서 폐 맥 관 구조에 식민지 화 했다 shScr 및 shFN LLC 셀의. 점선 초점에 confocal 폐 조직 영역의 가장자리를 나타냅니다. (B) 부 량 및 폐 식민지 LLC 셀으로에 대 한 통계 분석 5 절대 대표 이미지/폐 엽/마우스를 평균 하 여 (A)에 시각. 참고: 각 바 각에 초점 confocal 영역의 평균된 형광 강도를 나타냅니다. 데이터 분석 6 쥐에서 통계적으로 되었고 ± SD; 뜻으로 보고 n.s. 의미 의미; p를 의미 < 0.05; 그리고 * * p를 의미 < 0.01; 양방향 ANOVA입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: vivo CTC 식민 분석 결과 긴 기간에 폐에 종양 작은 혹을 감소 입을 LLC CFSE 표시 된 셀에 FN 식. (A) Bouin의 유체-고정 마우스 폐 종양 혹 베어링 CFSE 표시 된 shScr 또는 shFN LLC 셀에서 파생 된. (B) 부 량 및 폐에 종양 작은 혹에 대 한 통계 분석. ± SD; 뜻으로 데이터 보고 : p < 0.001; n = 6 그룹; 짝이 없는 t-테스트 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
긴 기간 폐 식민 분석 실험, 단기 우리 고용 여기 먼 장기에 폐 식민 CTCs에 의해 vivo에서 평가 하는 방법론 명확 하 게 발표 하 고 식민지에서 CTCs에 조립 하는 polyFN의 특정 역할 분화와 함께 폐에 넘쳐 흐름 및 전이성 프로세스18,19,,2021다음 주도. 비록 장기 셀 추적기 CFSE 3 일전 폐 관류에 대 한 정 맥 주입된 CTCs를 추적 하 고 양적으로 충분 한 녹색 형광을 유지 하는 셀 라벨, 그건 직접 확인할 수 종양 세포 배 루멘 내 위치 여부 이미 혈관에서 extravasated. 이 문제, 빨간색 형광을 해결 하기 위해 rhodamine 활용 된 dextran lectins endothelia에에 비 특정 바인딩 할 수 있는 폐 관류28,29, 중 폐 맥 관 구조를 사용할 수 있습니다. 30.도 불구 하 고 사실 CFSE 장기 셀 추적기, 그것의 형광 강도 절반 모든 세포 분열27, 라벨 기술에 그것을 사용 하 여의 잠재력을 제한. 이 문제를 회피, 그것은 해야 될 ascertained CFSE의 라벨 복용량은 감지 남아 전체 기간의 vivo에서 실험 하 고 셀에 영향을 주지는 어떤 치료는 셀에 적용 된 셀에 대 한 충분 한 확산입니다. 비교 및 폐 식민지 shScr 및 shFN CTCs의 정량화는 별도 마우스에 다 했다, 때문에 두 그룹 간의 차이 때문에 개별 변형 했다 주장 수도 있습니다. 그런 변이 제외 하려면 종양 세포와 별개 라는 형광 염료 (예를 들어, CFSE/CM-diI) 또는 안정적으로 GFP/dsRed와 페의 두 가지 유형의 혼합물 수 있습니다 수반 정 맥에 주입 폐 식민지에 같은 동물 31,,3233시험 그것은 그 복제 기술을 안정적으로 해결 하려고 하는 세포에서 발생 하는 복제 효과 형광 단백질 transfected 세포 충분히 강한 형광34,35, 와 클론 협조할 36 , 37 전체 이기종 인구38,,3940대표 unrepresentative 복제 셀을 만들 수 있습니다. 종양 세포로 어떤 형광 단백질의 안정 되어 있는 transfection 폐 식민 분석 실험에 대 한 원하는 경우 전체적으로 종양 세포의 transfection 효율을 높이기 잘 보존 해야 원래 특성 복제 셀 보다 충분 한 형광41,42의 인구
폐 관류 분석 실험은 필요한 일부 정 맥으로 주입 된 종양 세포, 특히 폐 모 세관 시스템을 체포 하는 대신 경향이 기계적으로 갇혀 폐의 모 세관 네트워크 내 걸린 폐 식민 단계 때문에 폐 모 세관 루멘43,44의 너비 보다 평균적으로 더 큰 직경 CTCs의 조직. Perfusing 폐 하지 않고 폐를 정착 하는 종양 세포의 정량화는과 기계적으로 걸린된 셀45,,4647를 잘못 계산 하 여 발생할 수 있습니다. 경우에 폐 끼얹는다 되었습니다, 추가 문제 남아 있다. 예를 들어, 폐 식민지 종양 세포 lumenal endothelia에 있는 또는 이미 혈관에서 extravasated는 차별화 하는 데 여전히 어렵습니다. 이 문제를 해결 하려면 위에서 Rhodamine 활용 된 dextran와 혈관을 얼룩이 지는 유용한30,,4849있을 수 있습니다. 또는, 종양 넘쳐 흐름의 정량화를 바란다면 칼슘 chelator EDTA 및 EGTA 또는 트립 신, 비 특정 효소 사용할 수 있습니다 관류 버퍼에 칼슘 종속 및 독립을 방해 하 종양 세포 접착 이벤트50 , 51 , 52. 따라서, 폐 조직에 남아 있는 종양 세포 extravasated으로 간주 될 수 있습니다.
폐를 정착 종양 세포의 정량화에 대 한 perfused 폐 종종 전통적인 confocal 현미경 검사 법을 복종 된다. 그러나, 조직의 깊이의 측정 가능성 때문에 부분 조직 autofluorescence 및 형광 산란 효과, 렌더링 깊은 조직 탐지53,54제한 됩니다. 전통적인 confocal 현미경 보다 높은 감도 가진 두 개의 광자 현미경은 근처-적외선 방사선 생물 표본 UV 보다 훨씬 적은 흡수와 2 광자 여기에 사용 되는 이러한 문제를 해결 하기 위해 적합 한 또는 파란-녹색 빛 기술을 두꺼운 표본55,,5657이미징에 대 한 더 적합 한 만든다. 종양 세포 폐 식민지는 몇 가지 대표적인 confocal 이미지, 개별 동물의 전체 폐에 종양 세포 폐 식민지의 전체 수를 포함 하지 않습니다에서 종양 세포 수를 평균 하 여 계산 됩니다. 폐 식민 분석 실험에서 전체 폐를 계량, 종양 세포 luciferase와 페 안정적 고용 수 및 perfused 폐 IVIS 일시 중단 된 종양 세포의 존재에 정 맥 주사 접종 후 이미징 대상이 될 다음 소46,,5859. 또한, perfused 폐 조각으로 다진 수 및 프로 테아 제, 예를 들면, 콜라, 서 스 펜 션60,61에 단일 셀을 방출 효소 소화를 받게. 종양 세포를 형광 염료 또는 안정적으로 형광 단백질 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 분석56,62다음 정해질 수와 페.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 박사 Ming 분 장 및 양 나중 Hsin 쳉 그들의 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 이 작품만 사역의 과학 및 기술에 의해 지원 되었다 (대부분-103-2325-B-006-009, 대부분-104-2325-B-006-001, 대부분-105-2325-B-006-001, 및 MOST-106-2320-B-006-068-MY3)의 보건 및 복지 (MOHW106-TDU-B-211-144004). 우리는 또한 그들의 다 광자 공초점 현미경에 대 한 국립 쳉 쿵 대학, 의학 대학의 핵심 연구소에서 지원에 대 한 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-9048-46-8 | |
| Bouin's Fluid | MCC(medical chemical corporation)/POISON | 456-A-1GL | |
| CFSE Proliferation Dye | ebiosciences | 65-0850-85 | Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 12100-061 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-6381-92-6 | For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) |
| Fetal bovine serum (FBS) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 10437-028 | |
| Lewis lung carcinoma (LLC) | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-1642 | |
| L-Glutamine, USP | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 21051-024 | |
| Potassium chloride (KCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7447-40-7 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM ) |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7778-77-0 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM ) |
| Sodium chloride (NaCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7647-14-5 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM ) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-10039-32-4 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM ) |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T6146 | 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T4799 | For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L ) |
| Zoletil 50 | Virbac | To dilute with 1X PBS | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Compact Tabletop Centrifuge 2420 | KUBOTA Co. | 2420 | |
| Culture dish (6cm) | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 705001 | |
| Disposable syringe (with needle) | Perfect Medical Industry Co. | 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml | |
| End over end mixer | C.T.I YOUNG CHENN | TS-20 | For suspended cells recovery |
| FACSCalibur (FACS) | BD biosciences | ||
| Forceps | Dimeda | 10.102.14 | |
| Forma Direct Heat CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc. | HEPA CLASS 100 | |
| Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) | Stoelting | 51338 | |
| Multiphoton Confocal Microscope BX61WI | Olympus | FV1000MPE | |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld-Superior | 640010 | |
| Surgical scissor | Dimeda | 08.370.11 | |
| Surgical sutures | UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. | NO. 0034 | Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0) |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | |
| 15 mL Greiner tube | Greiner bio-one | 188271 |
References
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