Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/56761
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1, 1, 3, 1,2
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Trauma Office, Children's National Health System

Summary

Bir hayvan modeli tümör hücreleri (CTCs) kanseri metastaz sırasında akciğer kolonizasyon teşvik dolaşan rolü deşifre için gereklidir. Burada kurduk ve başarıyla gerçekleştirilen bir vivo içinde tahlil özel olarak test etmek için gereksinimin akciğer kolonizasyon için CTCs polimer fibronektin (polyFN) Meclisi.

Abstract

Metastaz kanser ölüm başlıca nedenidir. Tümör hücreleri (CTCs) kanseri metastaz, içinde akciğer kolonizasyonu CTCs tarafından katkıda eleştirel için erken akciğer metastatik oluşum, teşvik dolaşan rolü şiddetle araştırmış. Bu nedenle, hayvan modelleri metastaz tam sistemik süreci yakalar tek yaklaşım vardır. Verilen bu CTCs katkılar kan damarı ekstravazasyonu incelenmesi için önceki Deneysel tasarımlar sorun oluşursa, biz hangi bir in vivo akciğer kolonizasyon tahlil kurulan bir uzun vadeli floresans hücre-izleyici, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), askıya alınan tümör hücreleri etiketlemek için kullanılan ve akciğer perfüzyon akciğer Temizleme, confocal görüntüleme ve miktar önce özellikle kapana CTCs temizlemek için gerçekleştirildi. Polimer fibronektin (polyFN) CTC yüzeylerde monte akciğer kolonizasyon metastatik tümör doku son kurulmasında aracılık tespit edilmiştir. Burada, özellikle CTCs polyFN derlemede akciğer kolonizasyon ve ekstravazasyonu için gereksinim test etmek için biz kısa vadeli gerçekleştirilen akciğer kolonizasyon deneyleri hangi askıya stabil FN-shRNA (shFN) ifade Lewis Akciğer Karsinomu Hücre (LLCs) veya Scramble-shRNA (shScr) ve önceden etiketli 20 mikron CFSE intravenöz C57BL/6 fareler aşılanmış. Biz başarıyla fare akciğerlerde kolonize etmek shFN LLC hücreleri yeteneklerini shScr LLC hücreleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalmış gösterdi. Bu nedenle, özellikle CTCs yeteneğini akciğerlerde kolonize dolaşım içinde göstermek için kısa vadeli bu yöntemi yaygın olarak uygulanabilir.

Introduction

Metastaz kanser ölüm1,2önemli nedenidir. Birincil dokulardan türetilmiş tümör hücreleri kan dolaşımı süspansiyon girin ve önce onlar are çeşitli Hematojen zorluklar, Örneğin, anoikis, bağışıklık saldırı ve zararlar tansiyon ya da geometrik kısıtları, yamultma stres nedeniyle hayatta uzak organ metastazı3,4,5,6başarı dikte önemli bir adım kolonize etmek mümkün. Bu nedenle, dinç çabaları şu anda dolaşımdaki tümör hücreleri (CTCs) karakterize ve bu özellikleri tümör habis, metastaz ve sağkalım oranları kanser hastaları7,8 ile korele yapılmıştır , 9. kanser metastaz işlemini özellikle vivo içinde olay gösterir, hayvan modelleri metastaz10,11,12 tam sistemik süreci yakalar tek yaklaşım vardır .

CTCs metastatik tümör doku uzak organlara1,2kolonizasyon dahil olmak üzere birden çok hücresel olaylar aracılığıyla olur. Ancak, en yaygın kullanılan metastaz deneyleri13,14,15 değil uzak organlara kolonizasyon CTC gözlemlemek için bir yol sağlar. Bu nedenle, bir CTC kolonizasyon görselleştirme için in vivo tahlil tasarım acilen ihtiyacım vardı. Her ne kadar birkaç vivo içinde ve ex vivo kısa dönem akciğer kolonizasyon deneyleri tasarlanmış, sorunları ve dezavantajları kalır. Örneğin, yeşil floresans protein (GFP) iken-overexpressing tümör hücreleri bu kullanılmıştır deneyleri22,23, stabil transfect ve yeterli GFP floresan yoğunluğu altında ile tümör hücreleri clone için sürüyor mikroskop. Her ne kadar uzun vadeli hücre izleyici CFSE ile tümör hücrelerinin geçici boyama GFP ifade tümör hücreleri değiştirmek için istihdam edilmiş, benzer şekilde, bu zor CFSE etiketli tümör hücreleri bağlı olup olmadığını yargılamak ya da sadece mevcut içinde kalır damarlara eksize uzak organlara16,17.

Polimer fibronektin (polyFN) CTCs yüzeylerde monte eleştirel metastatik tümör doku18,19,20,21,22 son kurulması için katkıda bulundu . Burada, kısa vadeli askıya alınmış Lewis Akciğer Karsinomu (LLCs) hücreleri stabil FN-shRNA (shFN) veya scramble-shRNA (shScr) ifade ve CFSE ile önceden etiketli akciğer kolonizasyon deneyleri intravenöz C57BL/6 fareler aşısını gerçekleştirilen. 2-3 gün sonra fare akciğerler ilk fosfat tamponlu tuz (tabi önce bekâr CTCs damarlara içinde tamamen kaldırmak için PBS) ile confocal mikroskobu ve akciğer kolonileşmesi LLCs miktar periosteum. Biz açıkça akciğer kolonileşmesi shFN LLCs sayıda ve tümör nodüller önemli ölçüde shScr önemli ölçüde CTCs polyFN derlemede rolü kolonizasyon ve CTCs içinde gelişimini kolaylaştıran corroborating LLCs ile karşılaştırıldığında azalma olduğunu göstermiştir Akciğerler. Bizim çalışma daha fazla rol için incelenmesi kanser metastaz polyFN garanti eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bizim Enstitüsü (bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının, NCKU Tıp Fakültesi Kılavuzu) esaslarına göre fareler üzerinde tüm deneyler yapıldı.

1. hazırlanması aletleri, Kültür Medya ve yemekleri

  1. Steril Cerrahi dikişler, 1 mL şırınga ile 26 G/0.5 cm iğne (için kuyruk ven enjeksiyon), deneysel protokoller başlamadan önce elde etmek 3 mL batar (için akciğer perfüzyon), 24G/3 cm iğne ile Dulbecco'nın modifiye kartal medya (DMEM), tripsin-EDTA çözüm (5 g/M tripsin ve 0,53 mM), fetal Sığır serum (FBS), 1 x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PHO4ve 1.8 mM KH2PO4) ve 6 cm kültür yemekleri.

2. hazırlık ve kurtarma süspansiyon tümör hücrelerinin

  1. Steril Dulbecco'nın modifiye kartal medya (% 10 veya % 20 içeren DMEM) hazırlamak FBS ve taze eklemek 2 mM L-glutamin, 1 x PBS ve % 0.05 tripsin-EDTA.
  2. DMEM % 10 ile desteklenmiş hücrelerde kültür FBS 37 ° C'de ve kültür tabak içinde % 70-80 izdiham kadar onları büyümek.
  3. Kültür Medya (DMEM) 2 mL steril 1 x PBS ile iki yıkama ardından yemekleri kaldırın.
  4. 1 mL % 0.05 ekleyin tripsin-EDTA bulaşıkları içine iyice hücrelerin tümünü kapsayacak şekilde. Çözüm 800 μL kaldırmak ve sadece 200 μL yemekleri bırakılır. Yemekler için 30 37 ° C'de kuluçkaya s 1 dk (türüne bağlı olarak hücre) ve beklemek-e kadar askıya alınmış durumda hücrelerin çoğu için.
  5. Taze DMEM 1 mL ekleyin % 10 içeren FBS doğrudan içine yemekler tripsin ve şiddetle enzimatik faaliyetleri durdurmak için hücre süspansiyon yukarı ve aşağı bir tek hücre süspansiyon hazırlamak için 1000 µL pipet ile pipette.
  6. Hücreleri yemek 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve spin 162 x g 3 dk de oda sıcaklığında hücreleri aşağı.
  7. Süpernatant Aspire edin ve 1,5 mL %20 FBS ve bitti sıra içeren DMEM tümör hücreleri resuspend süspansiyon için 2 h 37 ° C'de hücrelerde döndürün.
    Not: taze orta % 20 içeren ile eski orta orta kurtarma sırasında sarı dönüşürse, Döviz FBS.

3. floresans boyama ve tümör hücreleri Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) ile süspansiyon Analizi

  1. Hücre kurtarma süspansiyon sonra Trypan mavi bir Neubauer odası dozlarda boyama floresan titrating için sayma ile uygun uygun hücre sayıları saymak ve kuyruk için enjeksiyon damar.
  2. 162 x g 3 dk ve resuspend pelleted hücreleri 1 ml 1 x 162 x g 3 dk de oda sıcaklığında Santrifüjü ardından PBS, steril oda sıcaklığında, hücreleri aşağı spin.
  3. 1 X PBS 10 içeren 500 µL pelleted hücrelerde resuspend % FBS ve 0, 5, 10, 20 veya 40 µM CFSE için doz titrasyon ve hücre süspansiyon 37 oC 10 dk içinde belgili tanımlık karanlık, kuluçkaya.
  4. 162 x g 3 dakika oda sıcaklığında, hücreleri aşağı spin ve 4 mL % 1'i içeren DMEM pelleted hücrelerle resuspend FBS. Bu çamaşır üç kez daha tekrarlayın. DMEM için son yıkama yalnız 4 mL pelleted hücrelerle resuspend.
  5. CFSE etiketli hücreleri tek bir hücre floresans yoğunluğunu ölçmek için (FACS) analizi sıralama floresans aktif hücreye konu veya damar enjeksiyon kuyruk.
    Not: hücreler FACS analiz veya kuyruk ven enjeksiyonları gerçekleştirmeden önce buz üzerinde tutmak.

4. akciğer kolonizasyon tahlil

  1. 20 µM CFSE etiketli hücreleri hazırlayın (3,4 adımları 3.1'e bakınız).
    Not: CFSE çalışma doz tümör hücreleri, FACS analiz titrasyon sonuçlara dayanarak etiketleme için karar (adım 3.3 için bakınız).
  2. 4-6 hafta kuyruk ısınmak-eski erkek C57BL/6 (6 fareler) 5-10 dk fare fare olarak fare kuyruğu damarlar dilate için halide lambalı fareler.
  3. İyice karıştırın ve CFSE etiketli tümör hücreleri hücre süspansiyon (5 x 106 hücre/mL son hücre yoğunluğu ile) herhangi bir kabarcıkları kaçınarak bir 1 mL (26Gx1/2) şırınga ile Aspire edin.
  4. Dikkatli bir şekilde enjekte 1 x106 CFSE etiketli tümör hücreleri DMEM 200 µL bir fare restrainer saplanmış fare kuyruğu ven içine.
    Not: iğne kuyruğu ven lümen içinde doğrudan yerleştirilmişse enjeksiyon sırasında tümör hücreleri kolayca dolaşıma şırıngayı zor itmek gerek kalmadan teslim edilmelidir. İle tümör hücreleri itmek zor olsa da, onlar büyük olasılıkla kuyruk ven dışında subkutan uzaya enjekte edilmiş.
  5. İntravenöz CFSE etiketli tümör hücreleri iki gruba alınan fareler bölün: bir grup tarafından confocal mikroskobu takip akciğer perfüzyon tabi ve ImageJ miktar akciğer kolonizasyon tahlil ve diğeri sol tek başına 4-5 için hafta içinde uzun vadeli akciğer kolonizasyon tahlil.
  6. 20, 38 veya 45 h ve intravenöz enjekte bir saat ders ve doz bağımlı titrasyon sırasında 1 x 106 tümör hücreleri ile tümörü taşıyan fareler ile iyi kabul edilen ve uygun anesthetizer2350-75 mg/kg zoletil 50, anestezi.
    Not: Kullanım veteriner merhem kuruluk anestezi iken altında önlemek için fareler'ın gözleri.
  7. Boyuna deri ve subkutan doku karın üzerinden göğüs bölgesine cerrahi makasla kesme. Plevral boşluğu cerrahi makas ve tam olarak kalp ve akciğerler duyurmak forseps ile açın.
    Not: kan damarları keserek önlemek dikkatli olun.
  8. Üstün vena kava (SVC) ve inferior vena kava (IVC) geri tepme perfüzyon çözüm akciğer perfüzyon sırasında önlemek için steril cerrahi sütür ile kravat.
  9. Sol ventrikül duvar akciğer perfüzyon çözümden boşaltmak için bir çatlak (yaklaşık 2-4 mm) açmak için cerrahi makas ile kesme.
  10. 1 x PBS 3 mL şırınga ile sağ ventrikül enjekte ve akciğerleri kırmızımsı bir renk için tamamen solgun çevirmek kadar süzülmüş çözüm sürekli emme sırasında akciğer perfüzyon kaldırın.

5. confocal mikroskobik görüntüleme ve çözümleme-in akciğer kolonize tümör hücreleri

  1. Şimdi-soluk akciğerler plevral boşluğundan kaldır ve beş loblar uzakta nefes borusu ve bağ dokusu bağ cerrahi makas ve forseps24ile keserek ayırın.
  2. Retiküle doku Akciğer lobları yerleşim için iki çubuklar arasında bir boşluk ile üretmek için Şekil 3B ' naylon dikiş sarma tarafından yaklaşık iki metal çubuklar gösterildiği gibi bir sedye gibi akciğer tutucu hazırlayın. Akciğer tutucu bir 6 cm tabak içinde ayarlayın.
    Not: Akciğer tutucu Akciğer lobları objektif lens confocal mikroskop altında stabilize etmek için kullanılır.
  3. Lodge ve Akciğer lobları akciğer tutucu retiküle dokusu üzerinde düzeltin. Kapak ve Akciğer lobları 1 x PBS ile nemlendirin.
  4. Konu Akciğer lobları akciğer kolonileşmesi tümör hücreleri kayıt floresans çekim confocal mikroskobu akciğer sahibine üzerinde barındıran 6 cm kültür çanak.
  5. Görüntüleme için objektif lens kullanımı (5 X, MPLN, NA: 0.1, WD: 20, hava).
  6. NIBA (uyarma/emisyon; 470-495 nm/510-550 nm) için filtre tekerleği döndürün ve CFSE açıkça Akciğer lobları floresans nokta görüntülerini görselleştirmek için heyecanlandırmak için 488 nm lazer kullanın.
  7. (İçin MaiTai HP DeepSee lazer) R690 için filtre tekerleği döndürün 2.0 ile taramak için µs/piksel scanning hız ve HV, kazanç ve ofset iyimserlik düzeyleri.
  8. Floresan (512 x 512 piksel) bir 10 ile belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı kullanarak çekim µs/piksel tarama hızı.
  9. Ölçmek ve istatistiksel analiz mikroskobik görüntüleri önceden açıklanan21ImageJ ve GraphPad yazılım kullanarak.

6. uzun vadeli akciğer kolonizasyon deneyleri

Not: 4.1 4.5 aracılığıyla adımları yineleyin.

  1. Tümör hücre aşılama için 4-5 hafta sonra farelerin kurban ve onların akciğer Bouin'ın sıvı25 ile 1-2 gün için tamir.
  2. Ölçmek ve istatistiksel analiz üzerinden yazılım21ile fareler akciğer tümörü nodüller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vivo akciğer kolonizasyon tahlil gerçekleştirmeden önce akciğer kolonizasyon ve/veya metastaz, kolaylaştırma ekstravazasyonu polyFN askıya alınmış tümör hücreleri üzerinde aracılık olup olmadığını sınamak için Şekil 1A gösterildiği gibi biz ilk farklı titre CFSE, hücre geçirgen ve kovalent hücre içi Amin içeren moleküller26,27 ' askıya alınan tümör hücreleri conjugates ve uzun bir süre için hücrelerde kalır floresan bileşik konsantrasyonları. Bu tümör hücreleri etkili CFSE ile bir doz bağımlı şekilde gösterildiği Şekil 1Betiketli bulduk. CFSE etiket 6 '5 LLC hücre/mL neredeyse 20 µM bir plato ulaşmış x10 resimli Şekil 1 ciçinde.

Hangi fiziksel olarak CTCs akışı içinde akciğer damarlara engel bol daralmış kapiller sistem sayesinde, biz akciğer perfüzyon intravenöz enjekte taşıyan farelerde CFSE etiketli LLC hücreleri olarak özellikle kapana CTCs, temizlemek için gerçekleştirilen akciğer Temizleme, Şekil 4' te gösterildiği gibi her zaman bir noktada önce Şekil 1A ' resimli. Perfüzyon önce akciğerleri gösterildiği gibi kan, varlığı nedeniyle açıkça kırmızımsı sol panelinde Şekil 2. Akciğerler , doğru kapı aynası içinde Şekil 2gösterildiği gibi 1 x PBS, 10-15 mL ile perfüzyon sonra soluk oldu.

Hemen periosteum fare akciğerler plevral uzaydan kaldırıldı sonra Akciğer lobları ayrılmış ve Şekil 3A iyice Akciğer lobları kapsayan 1 x PBS ile gösterildiği gibi yemekleri yerleştirilen akciğer sahibi monte. Şekil 3B ' gösterildiği gibi akciğer sahibi monte Akciğer lobları Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi confocal floresan mikroskopi için tabi tutuldu. Akciğerlerde kolonize CFSE etiketli tümör hücreleri gösterildiği gibi görüntüsü üst panel Şekil 3 c ve siyah beyaz görüntülere gösterildiği gibi alt panel Şekil 3 c görüntü J yazılımı ile akciğer kolonizasyon miktar kolaylaştırmak için.

İntravenöz 20 µM CFSE etiketli ve akciğer perfusions ve confocal mikroskobik görüntüleme gerçekleştirmeden önce bir zaman ders 24-72 saat bekledi ya shScr ya da shFN LLC hücreleri enjekte. Miktar önemli ölçüde daha az shFN LLC hücreleri shScr LLC hücreleri daha 38 h ve 45 h zaman puan, olarak sayıldı ki hücreler Şekil 4A ImageJ yazılımı ile gösterildiği gibi 6 farelerde olduğu ortaya çıktı akciğer kolonileşmesi tümör içinde şekil 4B resimli . Neden shScr akciğer kolonize ve yavaş yavaş azaldı shFN LLC hücreleri tarafından dolaşım'ın dokunulmazlık bile zaten kolonize LLC hücrelere karşı sürekli sitotoksisite nedeniyle büyük olasılıkla nedeni. Özet olarak, bu sonuçlar üzerinde CTCs monte bu polyFN gerçekten tam metastaz akciğerlerde intravenöz aliquots, alma hangi bazı fareler sonuçlarında tarafından ortaya gibi önde gelen akciğer kolonizasyon LLC hücreler tarafından arabuluculuk gerekli öneririm CFSE etiketli shScr ve shFN LLC hücre Şekil 4 ' te gösterildiği gibi akciğer kolonizasyon deneyleri için aloneuntil akciğer tümörü nodüller geliştirilmiş olup, tüm deneysel tümör metastazı tahlil Şekil 5A ' gösterildiği gibi kaldı ve 5B.

Figure 1
Şekil 1: tümör hücreleri akciğer kolonizasyon tahlil etiketleme için CFSE konsantrasyonları titrasyon. (A) akciğer kolonizasyon tahlil ve iletişim kuralları bölümünde ayrıntılı olarak deneysel metastaz tahlil için prosedürleri şematik gösterimi. (B) FACS analiz lekeli LLC hücreleri CFSE floresan yoğunluklarını CFSE çeşitli konsantrasyonları ile için. (C) floresan yoğunluklarda çeşitli CFSE konsantrasyonları işlevleri olarak çizildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: akciğerler öncesi ve sonrası perfüzyon. Önce akciğer temsilcisi görüntüleri (unperfused; Unperf.) ve sonra (periosteum; Perf.) akciğer perfüzyon gerçekleştiriliyor. Altın yıldız: kalp. Beyaz ok: IVC/SVC kapalı kravat. Kırmızı oklar: aynı fare öncesi ve sonrası perfüzyon akciğer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: akciğer periosteum lob akciğer kutusunda confocal floresan mikroskopi için montaj. Akciğer-montaj confocal mikroskobu akciğer kutusunda (A) şeması. (B) 3 akciğer periosteum lob akciğer sahibi temsilcisi bir görüntü. (C) LLC hücrelerle akciğer kolonileşmesi CFSE floresan görüntü J yazılım tarafından miktar için temsil edici görüntüleri. Üst paneli: düzenli görüntüleme. Alt paneli: siyah-beyaz görüntüleme ters. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: zamanlı ders görüntü, miktar ve istatistiksel analiz için akciğer akciğer perfüzyon akciğer kolonizasyon tahlil sonra shScr ve shFN LLC hücreleri kolonize. (A) (floresan görüntülerden dönüştürülür) temsilcisi siyah beyaz görüntüleri çeşitli zaman noktalarda akciğer damarlara içinde geniş akciğer perfüzyon sonra gösterildiği gibi kolonize shScr ve shFN LLC hücre. Noktalı çizgiler kenarına odaktaki confocal akciğer doku alanları gösterir. (B) miktar ve istatistiksel akciğer kolonileşmesi LLC hücreler için (A) 5 mutlak temsilcisi görüntüleri/akciğer lobu/fare sayı ortalaması alınarak görüntülenir. Not: Her çubuğun her odaktaki confocal alan ortalama floresans yoğunluğunu gösterir. Veri istatistiksel analiz 6 fareler ve ± SD demek olarak bildirilen vardı; NS öðe1 anlamına gelir; * p anlamına gelir < 0,05; ve ** p anlamına gelir < 0,01; İki yönlü ANOVA. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: FN ifade CFSE etiketli LLC hücrelerdeki susturmak vivo CTC kolonizasyon tahlil uzun vadede Akciğerlerde tümör nodüller azalır. (A) Bouin'ın sıvı-sabit fare akciğer tümörü nodüller taşıyan CFSE etiketli shScr veya shFN LLC hücrelerden türetilmiş. (B) miktar ve Akciğerlerde tümör nodüller için istatistiksel analiz. Veri ± SD demek olarak bildirilir; : p < 0,001; n = 6 her grubu; Unpaired t-testi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Uzun vadeli akciğer kolonizasyon deneyleri, burada in vivo akciğer kolonizasyonu CTCs tarafından uzak organlarda değerlendirmek için istihdam metodoloji açıkça örtüsünü açmak ve kolonileşmesi içinde CTCs üzerinde monte polyFN belirli rol Ayrıştırılan kısa vadeli ile birlikte akciğer, ekstravazasyonu ve metastatik işlemleri18,19,20,21yol açtı. Her ne kadar uzun vadeli hücre izci intravenöz enjekte CTCs üç gün önce akciğer perfüzyon için izleme ve nicel amaçlar için yeterli yeşil floresans korumak bize izin CFSE hücrelerle etiketleme, doğrudan belirlemek imkansızdı tümör hücreleri gemi lümen içinde yerleşmişti veya zaten vardı kan damarları extravasated. Bu sorun, kırmızı floresan çözmek için özel olarak sigara endothelia üzerinde ifade lektinlerinin bağlamak mümkün olan rodamine Birleşik dextran akciğer perfüzyon28,29sırasında, akciğer damarlara etiketlemek için kullanılabilir 30. CFSE bir uzun vadeli hücre izci, floresans şiddeti gerçek vardır rağmen yarıya her hücre bölünmesi27, teknikleri etiketleme kullanarak potansiyelini sınırlayan. Bu sorunu aşmak için bu CFSE etiketleme doz hücreler için süresi içinde vivo deneyler ve herhangi bir tedavi hücrelerine uygulanan hücre üzerinde hiçbir etkisi tespit kalması için yeterli olduğunu tespit nükleer silahların yayılmasına karşı. Karşılaştırma ve akciğer kolonileşmesi shScr ve shFN CTCs miktar ayrı farelerde yapılmıştır çünkü iki grup arasındaki farklar nedeniyle bireysel değişim olduğunu savundu. Böyle değişim dışlamak için DISTINCT ile etiketli hücreleri boyar maddeler (Örneğin, CFSE/CM-dıı) bulabilsem veya stabil GFP/dsRed ile transfected tümör iki tip bir karışımı kullanılazlar intravenöz akciğer kolonizasyon aynı hayvan içine enjekte edilir 31,32,33tahlil. Bu klonlama etkileri stabil çözmeye teşebbüs teknoloji klonlama hücreden çıkan yeterince güçlü floresans34,35ile, floresan protein transfected Hücre klonlar dikkati çekiyor 36 , 37 klonlanan hücrelerin unrepresentative tüm türdeş olmayan nüfus38,39,40temsil etmek için yapabilir. Herhangi bir floresan protein istikrarlı bir transfection tümör hücreleri içine akciğer kolonizasyon deneyleri için isterseniz, tümör hücreleri transfection verimliliği bir bütün olarak yükselen daha iyi özgün özellikleri hücre klonlama daha korumak nüfus ile yeterli floresans41,42.

Özellikle akciğer kapiller sisteme tutuklamak yerine bazı intravenöz enjekte tümör hücreleri mekanik tuzak ve akciğer kapiller ağ içinde sıkışan eğilimindedir bu deneyleri gerekli olan akciğer kolonizasyon akciğer perfüzyon adımları dokulara CTCs ortalama büyük çapları akciğer kapiller lümen43,44genişliğinden dolayı. Akciğerleri ventriküler olmadan akciğer kolonileşmesi tümör hücreleri miktar yanlışlıkla mekanik tutukluk hücreleri45,46,47sayarak bir tahmindi neden olabilir. Akciğerleri periosteum bile, ek sorunlar devam etmektedir. Örneğin, hala akciğer kolonileşmesi tümör hücreleri lumenal endothelia üzerinde bulunan veya zaten kan damarları extravasated olup olmadığını ayırt etmek zordur. Bu sorunu gidermek için kan damarlarının rodamine Birleşik dextran olarak anılan ile boyama yararlı30,48,49olabilir. Tümör ekstravazasyonu miktar isterseniz, alternatif olarak, kalsiyum-şelatör EDTA/EGTA veya tripsin, non-spesifik proteaz perfüzyon arabellekte ve kalsiyum-bağımlı - bağımsız engel için kullanılabilir tümör hücre adezyon olaylar50 , 51 , 52. böylece, akciğer dokusu içinde kalan tümör hücreleri extravasated olarak kabul edilebilir.

İçin miktar akciğer kolonileşmesi tümör hücrelerinin perfused akciğer kez geleneksel confocal mikroskobu tabi tutulmaktadır. Ancak, measurability doku derinlik doku autofluorescence ve floresan saçılma etkileri, işleme daha derin dokulara belirlenemeyen53,54kısmen nedeniyle sınırlıdır. Geleneksel confocal mikroskop daha yüksek duyarlılık iki foton mikroskopla yakın kızılötesi radyasyon iki fotonlu uyarma UV daha önemli ölçüde daha az absorpsiyonu-biyolojik örnekler ile birlikte kullanılan bu tür sorunları gidermek uygundur veya mavi-yeşil ışık tekniği daha kalın numuneler55,56,57görüntüleme için uygun yapar. Akciğer kolonileşmesi tümör hücrelerinin tümör hücre sayıları birkaç temsilcisi confocal görüntüler, akciğer kolonileşmesi tümör hücre sayının tamamını tek tek bir hayvan bütün akciğerlerde içermeyen sayı ortalaması alınarak dikkate alınır. Akciğer kolonizasyon deneyleri tüm akciğerlerde ölçmek için stabil luciferase ile transfected tümör hücreleri istihdam olabilir ve perfused akciğerler sonra varlığı askıya alınan tümör hücrelerinin intravenöz aşı sonra Imaging IVIS tabi biyoluminesans46,58,59. Alternatif olarak, perfused akciğer parçalar halinde kıyılmış ve proteaz, Örneğin, tek hücre süspansiyon60,61serbest collagenase, enzimatik sindirim tabi. Tümör hücreleri floresan boyalar ile veya stabil proteinler sonra ile floresan aktif hücre (FACS) analiz56,62sıralama sayılabilir floresan ile transfected.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Ming-Min Chang ve Bayan Ya-Hsin Cheng ve teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Tayvan'ın Bakanlığı Bilim ve teknoloji tarafından desteklenmiştir (en-103-2325-B-006-009, en-104-2325-B-006-001, en-105-2325-B-006-001 ve MOST-106-2320-B-006-068-MY3) ve Sağlık Bakanlığı ve refah (MOHW106-TDU-B-211-144004). Biz de onların çok foton confocal mikroskop için destek için minnettar College of Medicine, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi, temel araştırma laboratuardan vardır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Bovine Serum Albumin (BSA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-9048-46-8
Bouin's Fluid MCC(medical chemical corporation)/POISON 456-A-1GL
CFSE Proliferation Dye ebiosciences 65-0850-85 Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)  (Gibco)ThermoFisher Scientific 12100-061
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-6381-92-6 For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) 
Fetal bovine serum (FBS) (Gibco)ThermoFisher Scientific 10437-028
Lewis lung carcinoma (LLC) ATCC, Manassas, VA, USA CRL-1642
L-Glutamine, USP  (Gibco)ThermoFisher Scientific 21051-024
Potassium chloride (KCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7447-40-7 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM )
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7778-77-0 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM )
Sodium chloride (NaCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7647-14-5 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM )
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-10039-32-4 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM )
Trypan Blue Sigma Aldrich T6146 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS
Trypsin Sigma Aldrich T4799 For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L )
Zoletil 50 Virbac To dilute with 1X PBS 
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Compact Tabletop Centrifuge 2420 KUBOTA Co. 2420
Culture dish (6cm) Wuxi NEST Biotechnology Co. 705001
Disposable syringe (with needle) Perfect Medical Industry Co. 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml
End over end mixer C.T.I YOUNG CHENN TS-20 For suspended cells recovery 
FACSCalibur (FACS) BD biosciences
Forceps Dimeda 10.102.14
Forma Direct Heat CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Inc. HEPA CLASS 100
Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) Stoelting 51338
Multiphoton Confocal Microscope BX61WI Olympus FV1000MPE
Neubauer counting chamber Marienfeld-Superior 640010
Surgical scissor Dimeda 08.370.11
Surgical sutures  UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. NO. 0034 Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0)
1.5 mL microcentrifuge tube Wuxi NEST Biotechnology Co. 615001
15 mL Greiner tube Greiner bio-one 188271

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells - mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
  4. Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  5. Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687 (2017).
  6. Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
  7. Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  8. Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44 (2016).
  9. Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
  10. Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
  11. Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
  12. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680 (2016).
  13. van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
  14. Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
  15. Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
  16. von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
  17. Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
  18. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
  19. Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
  20. Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
  21. Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72 (2017).
  22. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
  23. Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
  24. Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162 (2012).
  25. Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
  26. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  27. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  28. Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
  29. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  30. Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
  31. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
  32. Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344 (2017).
  33. Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152 (2016).
  34. Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555 (2016).
  35. Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
  36. Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
  37. Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  38. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  39. Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
  40. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  41. Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
  42. Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
  43. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  44. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  45. Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30 (2014).
  46. Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
  47. Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678 (2015).
  48. Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
  49. Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
  50. Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
  51. Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796 (2015).
  52. Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
  53. Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
  54. Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
  55. Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
  56. Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
  57. Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
  58. Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
  59. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  60. Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
  61. Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
  62. Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18 (2012).

Tags

Kanser Araştırmaları sayı: 136 metastaz akciğer kolonizasyon deneyleri akciğer perfüzyon dolaşımdaki tümör hücreleri Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester polimer fibronektin ekstravazasyonu,
Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, T. C., Liao, Y. C., Chang, W.… More

Lin, T. C., Liao, Y. C., Chang, W. T., Yang, C. H., Cheng, L. H., Cheng, M., Cheng, H. C. The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues. J. Vis. Exp. (136), e56761, doi:10.3791/56761 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter