Summary
Животной модели необходимо расшифровать роль циркулирующих опухолевых клеток (CTCs) в содействии легких колонизации во время метастазов рака. Здесь мы создали и успешно выступила в естественных условиях анализа специально тест требование Ассамблеи полимерных фибронектина (polyFN) на CTCs для легких колонизации.
Abstract
Метастазирование является основной причиной смерти от рака. Энергично исследована роль циркулирующих опухолевых клеток (CTCs) в содействии метастазов рака, в котором легких колонизации CTCs критически способствует метастатических процессов раннего легких. Таким образом Животные модели являются единственный подход, который захватывает полный системный процесс метастазирования. Учитывая, что проблемы возникают в предыдущих экспериментальные проекты для изучения вклад ЦОК в кровеносный сосуд кровоподтек, мы создали assay колонизации в естественных условиях легких в котором долгосрочной перспективе флуоресценции клеток трассирующими, Карбоксифлуоресцеина Эстер succinimidyl (CFSE), была использована для ярлык приостановлено опухолевых клеток и легких перфузии была исполнена очистить-специально в ловушке CTCs до легкого удаления, конфокальная томография и количественной оценки. Было установлено, что полимерные фибронектина (polyFN) собрал на поверхностях КТК посредником легких колонизации в окончательном создании метастатические опухоли тканей. Здесь, чтобы специально проверить требования polyFN Ассамблеи на CTCs для легких колонизации и кровоподтек, мы провели короткий срок легких колонизации анализов в которой приостановлено клеток карциномы легкого Льюис (LLC), стабильно выражая FN-индуцируемый (shFN) или схватка индуцируемый (shScr) и предварительно помечены с 20 мкм CFSE внутривенно были привиты в мышей C57BL/6. Мы успешно продемонстрировали, что способности клеток shFN ООО колонизировать мыши легких значительно сократились по сравнению с shScr ООО клетки. Таким образом это краткосрочные методологии могут широко применяется конкретно продемонстрировать способность ЦОК в циркуляции колонизировать легких.
Introduction
Метастазирование является основной причиной рака смерти1,2. Опухолевые клетки, полученные из основной ткани введите тираж в суспензии и выжить различных гематогенного вызовы, например, anoikis, иммунных нападений и убытки из-за напряжения сдвига от кровяного давления или геометрических зависимостей, прежде чем они возможность колонизировать отдаленные органы, ключевой шаг диктуют успех метастазированием3,4,5,6. Таким образом энергичные усилия в настоящее время достигнут в характеристике циркулирующих клеток опухоли (CTCs) и соотнося эти характеристики с злокачественности опухоли, метастазы и выживаемость больных раком7,8 , 9. Поскольку процесс метастазирования рака специально изображает события в естественных условиях , Животные модели являются единственный подход, который захватывает полный системный процесс метастазирования10,11,12 .
ЦОК стать метастатические опухоли тканей через несколько клеточных события, включая колонизации отдаленные органы1,2. Однако наиболее часто используемых метастазов анализов13,,1415 не позволяют соблюдать КТК колонизации отдаленные органы. Таким образом срочно необходима в vivo пробирного дизайн для визуализации колонизации КТК. Хотя несколько in vivo и ex vivo короткий срок легких колонизации, анализы были разработаны, проблемы и недостатки остаются. Например, в то время как зеленый флуоресценции белков (ГПУП)-избытком опухолевые клетки были использованы в эти assays22,23, это занимает время стабильно transfect и клонировать опухолевых клеток с достаточной интенсивности флуоресценции GFP под Микроскоп. Аналогичным образом, хотя переходные окрашивание опухолевых клеток с трассирующими сотовый долгосрочной перспективе CFSE был нанят для замены GFP-выражая опухолевых клеток, он по-прежнему трудно судить, присоединены ли CFSE-меченых опухолевые клетки или просто присутствует в сосудистую подакцизным отдаленные органы16,17.
Было установлено, что полимерные фибронектина (polyFN) собрал на поверхностях CTCs критически внести вклад в окончательное создание метастатические опухоли тканей18,19,20,21,22 . Здесь мы провели короткий срок легких колонизации анализов в которых приостановлено Льюис легких карцинома клетки (LLC) стабильно выражая FN-индуцируемый (shFN) или схватка индуцируемый (shScr) и предварительно помечены CFSE внутривенно были привиты в мышей C57BL/6. После 2-3 дня легкие мыши были впервые увлажненную с-фосфатный буфер (PBS), чтобы полностью удалить неприсоединенной ЦОК в сосудистую прежде чем подвергнуться confocal микроскопии и количественная оценка легких колонизировать LLC. Мы ясно показали, что количество легких колонизировать shFN LLC и узелки опухоли были значительно снижены по сравнению с shScr LLC, существенно подтверждающих роль polyFN Ассамблеи на ЦОК в деле содействия колонизацией и рост ЦОК в легкие. Наше исследование заслуживает дальнейшего расследования для роли polyFN в рак метастазы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на мышах были исполнены в соответствии с руководящими принципами нашего института (руководство для ухода и использования лабораторных животных, NCKU медицинский колледж).
1. Подготовка документов, средства массовой информации культуры и блюда
- Перед началом экспериментальные протоколы, получить стерильные хирургические нити, шприцы 1 мл с иглой 26G/0,5 см (для инъекции Вену хвост), шприцы 3 мл с иглой 24G/3 см (для легких перфузии), Дульбекко изменение орел СМИ (DMEM), раствор трипсина ЭДТА (5 g/L трипсина и 0.53 мм), плода бычьим сывороточным (ФБС), ПБС (137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мм Na2Пхо4и 1,8 мм х2PO4) и 6 см культуры блюда.
2. Подготовка и восстановление опухолевых клеток в суспензии
- Подготовить стерильные Дульбекко изменение орел СМИ (DMEM) содержит 10% или 20% FBS и свежезаваренным добавить 2 мм L-глютамином, ПБС и 0,05% трипсина-ЭДТА.
- Культура клетки в DMEM дополнена 10% FBS при 37 ° C и вырастить их до тех пор, пока существует 70-80% слияния в культуре блюдо.
- Удалите медиа культуры (DMEM) от блюда, следуют две автомойки с 2 мл стерильного ПБС.
- Добавить 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в посуду тщательно освещать все клетки. Немедленно удалите 800 мкл раствора и оставить только 200 мкл в блюда. Инкубировать блюда при 37 ° C за 30 s 1 мин (в зависимости от типа клеток) и подождать до тех пор, пока большинство клеток находятся в приостановленном состоянии.
- Добавьте 1 mL свежих DMEM содержащие 10% FBS непосредственно в блюда, чтобы остановить Ферментативная активность трипсина и энергично Пипетка суспензию клеток вверх и вниз с 1000 мкл пипетки подготовить одну ячейку подвеска.
- Передать пробки microcentrifuge 1,5 мл клетки от блюдо и спина вниз клетки при комнатной температуре на 162 x g на 3 мин.
- Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте опухолевых клеток в 1,5 мл DMEM, содержащий 20% FBS и конца над вращать клетки в подвеска при 37 ° C на 2 ч.
Примечание: Если носитель желтеет во время восстановления, Обмен старых средних с свежими носитель, содержащий 20% FBS.
3. флуоресценции окрашивание и анализ опухолевых клеток в суспензии с Карбоксифлуоресцеина Succinimidyl эфира (CFSE)
- После восстановления клеток в суспензии рассчитывать число соответствующих жизнеспособных клеток с Трипановый синий в Нойбауэр, подсчета камеры для титрования флуоресценции, окрашивание дозы и для хвоста вен инъекций.
- Спин вниз клетки на 162 x g при комнатной температуре 3 мин и Ресуспензируйте гранулированных клеток в 1 мл стерилизованное ПБС, следуют комнатной температуре центрифугирования в 162 x g на 3 мин.
- Ресуспензируйте гранулированных клетки в 500 мкл ПБС, содержащие 10% FBS и 0, 5, 10, 20 или 40 мкм CFSE для титрования дозы и инкубировать суспензию клеток на 37 oC на 10 мин в темноте.
- Спин вниз клетки на 162 x g при комнатной температуре 3 мин и Ресуспензируйте гранулированных клетки с 4 мл DMEM, содержащей 1% FBS. Повторите этот шаг Стиральная еще три раза. Ресуспензируйте гранулированных клетки с 4 мл DMEM только для окончательной стирки.
- Тема CFSE-меченых клетки флуоресценции активированный ячейку Сортировка (FACS) анализ для количественного определения интенсивности флуоресценции одну ячейку, или хвост инъекции Вену.
Примечание: Держите клетки на льду до выполнения инъекции Вену СУИМ анализа или хвост.
4. легких колонизации Assay
- Подготовка клетки, помечены 20 мкм CFSE (см. шаги 3.1 через 3.4).
Примечание: Решить рабочую дозу CFSE для маркировки опухолевых клеток, основываясь на результатах титрование анализ СУИМ (обратитесь к шагу 3.3). - Разминка хвосты 4-6 недели-старых самцов мышей C57BL/6 (6 мышей) с лампа для 5-10 мин на основе мышь для расширения вен хвост мыши.
- Тщательно перемешайте и аспирационная CFSE-меченых опухолевых клеток с шприц 1 мл (26Gx1/2), избегая любой пузыри в суспензии клеток (с плотностью окончательный клеток 5 х 106 клеток/мл).
- Тщательно вставки 1 x106 CFSE-меченых опухолевых клеток в 200 мкл DMEM в Вену хвост мыши, которая должна быть подана в мыши фиксатор.
Примечание: Во время инъекции, если иглы помещается непосредственно в просвете Вены хвост, опухолевые клетки должен быть легко доставлены в оборот без необходимости нажать трудно на шприц. Если это трудно толкать опухолевых клеток путем, они скорее были введены вне Вены хвост, в подкожной пространство. - Разделите мышей, которые внутривенно получил CFSE-меченых опухолевые клетки на две группы: одна группа претерпит легких перфузии, следуют confocal микроскопии и ImageJ квантификация assay колонизации легких и другой останется только для 4-5 недель в долгосрочной перспективе легких колонизации assay.
- На 20, 38 или 45 h и с 1 x 10-6 опухолевых клеток, внутривенно вводят во время курс и дозозависимый титрования анестезировать опухоль подшипник мышей с zoletil 50-75 мг/кг 50, который является широко признанным и надлежащего anesthetizer23.
Примечание: Использование ветеринар мазь на мышей глаза для предотвращения сухости под наркозом. - Ножницы хирургические продольно режут кожи и подкожной ткани из брюшной полости в область грудной клетки. Откройте плевральной полости с Ножницы хирургические и щипцы для полностью разоблачить сердца и легких.
Примечание: Будьте осторожны избежать отсечения кровеносных сосудов. - Галстук верхней полой вены (SVC) и нижней полой вены (IVC) с стерильные хирургические шовные материалы для предотвращения обратного потока раствора перфузии во время легких перфузии.
- Вырежьте стенке левого желудочка с Ножницы хирургические открыть щели (около 2-4 мм) для слива перфузии решение из легких.
- Придать ПБС в правый желудочек с 3 мл шприц и удалить слить раствор с постоянным всасывания во время легких перфузии, до тех пор, пока легкие превратить из красноватый цвет полностью бледно.
5. конфокальный микроскопических изображений и анализ колонизировали легкого опухолевые клетки
- Удаление легких теперь Пале из плевральной полости и отделить пять лепестков, убирания трахеи и соединительной ткани связок с хирургические ножницы и щипцы24.
- Подготовьте легких носилки как держатель, как показано на рисунке 3B методом намотки нейлон накладывать шов вокруг двух металлических стержней производить сетчатые текстуру с пробелом между двух стержней для размещения долей легких. Установите держатель легких в 6 см блюдо.
Примечание: Держатель легких будет использоваться для стабилизации долях легких под объектив конфокального микроскопа. - Подать и исправить долях легких на сетчатые текстуру держателя легких. Обложка и смачивают долях легких с ПБС.
- Тема 6-см культуры блюдо, укрывательство долях легких на держателе легких для confocal микроскопии для захвата изображений флуоресценции запись колонизировать легкого опухолевые клетки.
- Для изображений, используйте объективов (5 X, MPLN, НС: 0.1, WD: 20, воздуха).
- Вращайте колесо фильтров для NIBA (возбуждения/выбросов; 470-495 нм/510-550 Нм) и использовать 488 нм лазер для возбуждения CFSE, четко визуализировать изображения точек флуоресценции в долях легких.
- Вращайте колесо фильтра для СМ690 (для лазерной MaiTai HP DeepSee) для сканирования с 2.0 МКС/пиксель сканирования ускорить и оптимизировать HV, усиление и смещение уровнях.
- Захватить флуоресценции изображения (512 x 512 пикселей) с помощью программного обеспечения микроскоп с 10 мкс/пиксель скорость сканирования.
- Количественно и статистически анализа микроскопических изображений с помощью программного обеспечения ImageJ и GraphPad как описано выше21.
6. долгосрочное легких колонизации анализов
Примечание: Повторите шаги 4.1 через 4.5.
- Пожертвовать мышей после инокуляции опухолевых клеток для 4-5 недель и исправить их легкие с Буэна в жидкости25 за 1-2 дней.
- Количественно и статистически анализируем узелки опухоли из легких мышей с программного обеспечения21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Перед выполнением assay колонизации в естественных условиях легких как показано на рисунке 1A для проверки ли polyFN на взвешенных опухолевые клетки опосредует легких колонизации и/или кровоподтек в содействии метастазов, мы сначала титруют различных концентрации CFSE, флуоресцентный соединение, которое является проницаемой и ковалентно конъюгатов внутриклеточных Амин содержащих молекул26,27 в подвесных опухолевых клеток и остается в клетках в течение довольно длительного периода времени. Мы обнаружили, что опухоль, которую клетки эффективно были помечены CFSE в зависимости от дозы, как показано на рисунке 1B. CFSE-маркировка в 6 x105 ООО клеток/мл почти достигли плато в 20 мкм, как показано на рисунке 1 c.
Результате обильные суженных капиллярной системы, которые физически могут помешать потока CTCs внутри легких сосудистую мы провели клеток CFSE-меченых ООО перфузии в мышах с учетом внутривенно вводят легкого очистить неспецифически захваченных ЦОК, как показано на рисунке 1A до легкого удаления в каждый момент времени, как показано на рисунке 4. До перфузии, легкие были явно красноватый вследствие наличия крови, как показано в левой панели Рисунок 2. Легкие стал бледно после перфузии с 10-15 мл 1 x PBS, как показано в правой панели Рисунок 2.
Сразу же после того, как легкие перфузии мыши были удалены из плевральной полости, долях легких были отделены и монтируется на держателе легких, помещены в блюда, как показано на рисунке 3A с ПБС тщательно покрытие долей легких. Монтируется на легких держатель, как показано на рисунке 3B долей легких были подвергнуты конфокальный флуоресцентной микроскопии, как показано на рисунке 3A. CFSE-меченых опухолевых клеток, колонизируя легких были образы, как показано в верхней панели Рисунок 3 c и превратился в черно-белых изображений, как показано в нижней панели Рисунок 3 c для облегчения количественной оценки легких колонизации с J образ программного обеспечения.
Мы вводили внутривенно или shScr, или shFN ООО клетки, которые были помечены с 20 мкм CFSE и ждали времени курс от 24-72 ч перед выполнением легких орошений и конфокальный микроскопических изображений. Количественная оценка опухоли легких колонизировать клетках 6 мышей, как показано на рисунке 4A с ImageJ программного обеспечения показал, что значительно меньше shFN ООО клетки чем shScr ООО клетки были подсчитаны на 38 h и 45 h время точки, как показано в Рисунок 4B . Причина, почему число колонизировали легких shScr и shFN ООО клетки постепенно ослабляется был весьма вероятно из-за непрерывного цитотоксичность, оказываемое циркуляции иммунитет даже против уже колонизированных ООО клеток. Вообще, эти результаты показывают, что polyFN, собрал на CTCs действительно требуется в посредничестве легких колонизации ООО клетки, приводит к полной метастазы в легких, как свидетельствуют результаты в которой некоторые мышей, внутривенно получения аликвоты из CFSE-меченых shScr и shFN ООО клетки для легких колонизации анализов, как показано на рисунке 4 остались aloneuntil опухоли легких конкреций были разработаны в assay метастазов экспериментальной опухоли, как показано на рисунке 5А и 5B.
Рисунок 1: титрования концентрации CFSE для маркировки опухолевые клетки в легких колонизации assay. (A) схематическая иллюстрация процедур для assay колонизации легких и экспериментальной метастазов assay как описано в разделе протоколы. (B) анализ СУИМ за интенсивностью флюоресценции CFSE ООО клеток, которые были окрашены с различных концентраций CFSE. (C) интенсивностью флюоресценции были построены как функции различных концентраций CFSE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: легкие до и после перфузии. Представитель изображения легких до (unperfused; Unperf.) и после (увлажненную; Perf.) выполнение легких перфузии. Золотая звезда: сердце. Белая стрелка: галстук, который закрыл IVC/SVC. Красные стрелки: легкие же мыши до и после перфузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Монтаж перфузии легких лопастями на держателе легких для confocal микроскопии флуоресцирования. (A) схема легкого монтажа на легких держатель для confocal микроскопии. (B) представитель изображение 3 лопастями перфузии легких на держателе легких. (C) представитель изображения легких колонизировать ООО клеток с CFSE флуоресценции для квантификации J образа программного обеспечения. Верхняя панель: регулярные изображений. Нижняя панель: вспять черно-белых изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: время курс изображений, количественной оценки и статистического анализа для легких колонизировали клетки ООО shScr и shFN после легких перфузии в легких колонизации assay. (A) представитель черно-белые изображения (преобразован из изображений флуоресценции) shScr и shFN ООО клеток, которые были колонизированы в сосудистую легких в различные моменты времени как изображен после обширных легких перфузии. Пунктирные линии обозначают края областей в фокусе конфокальный легких тканей. (B) количественной оценки и статистического анализа, для легких колонизировать ООО клетки как визуализирована в (A) путем усреднения 5 абсолютной представитель изображения/легких доли/мыши. Примечание: Каждый бар показывает интенсивность усредненной флуоресценции каждой области конфокальной в фокус. Данные были статистически проанализированы от 6 мышей и сообщили как означает ± SD; н.с. означает незначимые; * означает p < 0,05; и ** означает p < 0,01; Двусторонний ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: глушителей FN выражение в CFSE-меченых ООО клеток уменьшается узелки опухоли в легких в долгосрочной перспективе в vivo КТК колонизации assay. (A) Буэна жидкости Исправлена мыши легких с учетом узелки опухоли производным от CFSE-меченых shScr или shFN ООО клеток. (B) количественной оценки и статистический анализ узелки опухоли в легких. Данные представляются как означает ± SD; : p < 0,001; n = 6 для каждой группы; Непарные t теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наряду с давно термин легких колонизации анализов, короткий срок методологии мы здесь оценить в естественных условиях легких колонизации ЦОК в отдаленных органах явно обнародовал и дифференцированной конкретная роль polyFN, собрал на ЦОК в колонизации легких, которые затем привели к кровоподтек и метастатических процессов18,19,,2021. Хотя маркировки клетки с долгосрочной перспективе клеток трекер CFSE, позволил нам проследить внутривенно вводят CTCs на срок до трех дней до легких перфузии и сохранить достаточно зеленый флуоресценции для количественных целей, было невозможно определить, непосредственно ли опухолевые клетки были расположены в пределах просвета сосуда или уже extravasated из кровеносных сосудов. Для решения этой проблемы, красных флуоресцентных родамин конъюгированных декстрана, который способен неспецифически привязать к лектинов, выраженные на endothelia может использоваться для ярлык сосудистую легких во время легких перфузии28,29, 30. Несмотря на тот факт, что CFSE является долгосрочной перспективе трекер ячейки, его интенсивность флуоресценции вдвое каждые клеточного деления27, ограничивая потенциал использования в маркировке методов. Чтобы обойти эту проблему, следует выяснять, что маркировка дозировка CFSE достаточно для клеток остаются обнаруживаемыми для экспериментов на весь срок в естественных условиях , и что любое лечение применяется к клеткам не оказывает влияния на клетки распространение. Потому что сравнение и количественной оценки колонизировать легких shScr и shFN ЦОК были сделаны в отдельных мышей, можно утверждать, что различия между двумя группами были вызваны индивидуальные вариации. Чтобы исключить такие вариации, смесь двух типов опухолевых клеток, помечены собственный флуоресцировать красители (например, CFSE/см дии) или стабильно transfected с GFP/dsRed может сопутствующе обстоятельств внутривенно вводят в то же самое животное в легких колонизации пробирного31,32,33. Стоит отметить, что клонирование эффектов, вызываемых клетки, клонирование технологии, является попытка разобраться в стабильно флуоресцентный белок transfected клеток клоны с достаточно сильная флуоресценция34,35, 36 , 37 может сделать клонированных клеток непредставительным представлять весь разнородных популяций38,,3940. Если стабильной трансфекции любой флуоресцирующего белка в опухолевые клетки для легких колонизации анализов, повышать эффективность трансфекции опухолевых клеток в целом должны лучше сохранить оригинальные характеристики чем клонирование клетки население с достаточной флуоресценции41,42.
Перфузии легких шагов в легких колонизации, что анализы необходимы в том, что некоторые внутривенно вводят опухолевые клетки, вместо специально ареста капиллярной системы легких, клонат быть механически ловушке и застряла в капиллярной сети легких Ткани из-за среднем больших диаметров CTCs чем ширина легких капиллярного люмен43,44. Количественная оценка колонизировать легкого опухолевые клетки без perfusing легких может привести к завышению, ошибочно считая механически застрявшую клетки45,46,47. Даже если были увлажненную легких, дополнительные проблемы остаются. Например до сих пор трудно дифференцировать ли колонизировать легкого опухолевые клетки расположены на lumenal endothelia или уже extravasated из кровеносных сосудов. Для решения этой проблемы, окрашивание кровеносных сосудов с родамин конъюгированных декстрана как выше может быть полезным30,48,49. В качестве альтернативы, если количественная оценка опухоли кровоподтек, кальций хелатором ЭДТА/EGTA или трипсина, неспецифичный протеазы, может использоваться в буфере перфузии препятствует кальций зависимых и - независимый опухолевых клеток Адгезия события50 , 51 , 52. Таким образом, опухолевые клетки, остающиеся в тканях легких может рассматриваться как extravasated.
Для количественного определения опухолевых клеток легких колонизации перфузии легких часто подвергаются традиционной confocal микроскопии. Однако измеримости тканей Глубина ограничена частично объясняется аутофлюоресценция ткани и флуоресценции рассеяния эффекты, рендеринга более глубоких тканях обнаружить53,54. Микроскопом два фотона с высокой чувствительностью, чем традиционные Конфокальный микроскоп подходит для решения таких проблем, в том, что вблизи инфракрасного излучения используется в двух Фотон возбуждения с значительно меньше поглощение биологических образцов чем УФ или сине зеленый свет делает техника более подходящим для визуализации толщиной образцов55,56,57. Колонизируя легкого опухолевые клетки, учитываются путем усреднения числа клеток опухоли в нескольких представитель конфокальный изображения, которые не включают весь количество легких колонизировать опухолевых клеток в целом легких индивидуального животного. Для количественной оценки всей легких в легких колонизации анализов, стабильно transfected с Люцифераза опухолевые клетки могут быть использованы и перфузии легких может затем подвергаться ИВИС изображений после внутривенного введения прививок взвешенных опухолевых клеток в присутствии о Люциферин46,,5859. Кроме того перфузии легких может фарш на куски и подвергается ферментативного пищеварения с протеаз, например, коллагеназа, выпуская единичных клеток в подвеска,6061. Опухоли клеток флуоресцентным красителями или стабильно transfected с флуоресценцией, что белки затем может быть количественно с активированной флуоресценции клеток, сортировка (FACS) анализ56,62.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Чан Минь-мин и г-жа Ya-синь Чэн за их техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня (большинство-103-2325-B-006-009, большинство-104-2325-B-006-001, большинство-105-2325-B-006-001 и MOST-106-2320-B-006-068-MY3) и Министерство здравоохранения и социального обеспечения (MOHW106-TDU-B-211-144004). Мы признательны также за поддержку от основной научно-исследовательской лаборатории колледжа медицины, Национальный университет Ченг Кунг, за их участием Фотон конфокального микроскопа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-9048-46-8 | |
| Bouin's Fluid | MCC(medical chemical corporation)/POISON | 456-A-1GL | |
| CFSE Proliferation Dye | ebiosciences | 65-0850-85 | Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 12100-061 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-6381-92-6 | For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) |
| Fetal bovine serum (FBS) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 10437-028 | |
| Lewis lung carcinoma (LLC) | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-1642 | |
| L-Glutamine, USP | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 21051-024 | |
| Potassium chloride (KCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7447-40-7 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM ) |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7778-77-0 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM ) |
| Sodium chloride (NaCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7647-14-5 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM ) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-10039-32-4 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM ) |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T6146 | 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T4799 | For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L ) |
| Zoletil 50 | Virbac | To dilute with 1X PBS | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Compact Tabletop Centrifuge 2420 | KUBOTA Co. | 2420 | |
| Culture dish (6cm) | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 705001 | |
| Disposable syringe (with needle) | Perfect Medical Industry Co. | 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml | |
| End over end mixer | C.T.I YOUNG CHENN | TS-20 | For suspended cells recovery |
| FACSCalibur (FACS) | BD biosciences | ||
| Forceps | Dimeda | 10.102.14 | |
| Forma Direct Heat CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc. | HEPA CLASS 100 | |
| Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) | Stoelting | 51338 | |
| Multiphoton Confocal Microscope BX61WI | Olympus | FV1000MPE | |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld-Superior | 640010 | |
| Surgical scissor | Dimeda | 08.370.11 | |
| Surgical sutures | UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. | NO. 0034 | Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0) |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | |
| 15 mL Greiner tube | Greiner bio-one | 188271 |
References
- Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A.
- Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells - mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
- Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687 (2017).
- Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
- Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
- Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44 (2016).
- Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
- Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
- Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
- Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680 (2016).
- van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
- Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
- Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
- von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
- Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
- Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
- Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
- Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72 (2017).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
- Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
- Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162 (2012).
- Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
- Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
- Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344 (2017).
- Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152 (2016).
- Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555 (2016).
- Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
- Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W.
- Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30 (2014).
- Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
- Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678 (2015).
- Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
- Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
- Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
- Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796 (2015).
- Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
- Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
- Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
- Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
- Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
- Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
- Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18 (2012).
