Summary
需要一个动物模型来破译循环肿瘤细胞 (CTCs) 在肿瘤转移过程中促进肺定植的作用。在这里, 我们建立并成功地进行了体内检测, 专门测试了高分子纤维连接蛋白 (polyFN) 组装对 CTCs 肺定植的要求。
Abstract
转移是导致癌症死亡的主要原因。研究了循环肿瘤细胞 (CTCs) 在促进肿瘤转移中的作用, 其中 CTCs 肺定植对早期肺转移过程有重要影响。因此, 动物模型是唯一的方法, 捕捉整个系统的转移过程。鉴于以前的实验设计中出现了一些问题, 用于检查 CTCs 对血管渗出的贡献, 我们建立了一种体内肺定植试验, 其中长期荧光细胞示踪剂, 羧基琥珀酰亚胺酯 (CFSE), 用于标记悬浮瘤细胞和肺灌注被执行清除非特别被困的 CTCs 在肺切除之前, 共焦成像和定量。聚合纤维连接蛋白 (polyFN) 组装在反恐委员会的表面已经发现, 以调解肺的殖民化最终建立的转移性肿瘤组织。在这里, 为了具体测试 polyFN 组装对 CTCs 肺定植和渗出的要求, 我们进行了短期肺定植试验, 其中悬浮 Lewis 肺癌细胞 (LLCs) 稳定表达 FN-shRNA (shFN) 或shRNA (shScr) 和预先标记的20微米的 CFSE 被静脉注射注射到 C57BL/6 小鼠。我们成功地证明, 与 shScr 有限责任公司细胞相比, shFN llc 细胞对小鼠肺部的殖民化能力显著降低。因此, 这一短期方法可以广泛应用于具体证明 CTCs 在循环内的能力, 以殖民肺部。
Introduction
转移是癌症死亡的主要原因1,2。从初级组织中获得的肿瘤细胞进入悬浮循环, 并经受了各种血流挑战,例如脱落凋亡、免疫攻击和因血压或几何约束而造成的抗剪应力损伤, 在它们被能够殖民遥远的器官, 一个关键步骤, 成功转移3,4,5,6。因此, 目前正在大力研究循环肿瘤细胞 (CTCs), 并将这些特征与肿瘤恶性肿瘤、转移和癌症患者存活率7、8,9. 由于癌症转移的过程具体描述了活体活动, 动物模型是唯一的方法, 捕捉整个系统过程的转移10,11,12.
CTCs 成为转移性肿瘤组织通过多细胞事件包括1,2遥远的器官的殖民化。然而, 最常用的转移分析13,14,15没有提供一种方法来观察反恐委员会远距离器官的殖民化。因此, 迫切需要对反恐委员会的定植可视化进行体内检测设计。虽然在体内和体外短期肺定植试验的设计, 问题和缺点仍然存在。例如, 虽然绿色荧光蛋白 (GFP)-overexpressing 肿瘤细胞已用于这些化验22,23, 它需要时间稳定染和克隆肿瘤细胞与充分的 GFP 荧光强度下显微镜。同样, 虽然肿瘤细胞的瞬态染色与长期细胞示踪 CFSE 已被用于取代 GFP 表达的肿瘤细胞, 它仍然难以判断是否附有 CFSE 标记的肿瘤细胞或仅仅存在于切除的遥远的器官的脉管16,17。
在 CTCs 表面组装的高分子纤维连接蛋白 (polyFN) 已被发现对转移性肿瘤组织的最终建立有重要贡献18、19、20、21、22.在这里, 我们进行了短期肺定植试验, 其中悬浮 Lewis 肺癌细胞 (LLCs) 稳定表达 FN-shRNA (shFN) 或 shRNA (shScr) 和预先标记 CFSE 被静脉注射到 C57BL/6 小鼠。2-3 天后, 小鼠肺先灌入磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 以完全去除血管内的未连接 CTCs, 然后再进行共焦显微术和定量的肺殖民 LLCs。我们清楚地表明, 与 shScr LLCs 相比, 肺殖民化 shFN LLCs 和肿瘤结节的数量明显减少, 大大证实 polyFN 在 CTCs 中的作用, 促进 CTCs 的殖民化和生长。肺。我们的研究需要进一步研究 polyFN 在肿瘤转移中的作用。
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Protocol
所有老鼠的实验都是按照我研究所的指导方针 (NCKU 医学院的实验室动物护理和使用指南) 进行的。
1. 仪器、文化媒体和菜肴的准备
- 在启动实验协议之前, 获得无菌手术缝合, 1 毫升注射器与26克/0.5 厘米针 (用于尾静脉注射), 3 毫升注射器与24克/3 厘米针 (为肺灌注), Dulbecco 的改良鹰媒体 (DMEM), 胰蛋白酶-EDTA 溶液 (5胰蛋白酶和0.53 毫米), 胎牛血清 (血清), 1x PBS (137 毫米氯化钠, 2.7 毫米氯化钾, 10 毫米 Na2米 4, 和1.8 毫米, 2 米 4),和6厘米的文化菜肴.
2. 悬浮液中肿瘤细胞的制备和恢复
- 准备无菌 Dulbecco 的改良鹰培养基 (DMEM), 含有10% 或20% 的血清和新鲜添加2毫米 l-谷氨酰胺, 1x PBS 和0.05% 胰蛋白酶-EDTA。
- 培养细胞在 DMEM 补充与10% 的血清37摄氏度, 并种植它们, 直到有70-80% 融合在养殖皿。
- 从菜肴中取出培养基 (DMEM), 然后用2毫升无菌 1x PBS 冲洗两次。
- 加入1毫升的0.05% 胰蛋白酶-EDTA 进入菜肴, 彻底覆盖所有的细胞。立即删除 800 ul 的解决方案, 只留下 200 ul 在盘子里。在37摄氏度的三十年代至1分钟孵化菜肴 (视细胞类型而定), 等到大多数细胞处于悬浮状态。
- 加入1毫升新鲜 DMEM, 其中10% 只血清直接进入菜肴, 以停止胰蛋白酶的酶活性, 并大力用1000µL 吸管将细胞悬浮在一起, 以制备单个细胞悬浮液。
- 将细胞从盘子转移到一个1.5 毫升的离心管, 并在室温下以 162 x g 为3分钟旋转细胞。
- 在1.5 毫升 DMEM 中吸出上清和并用重悬肿瘤细胞, 其中20% 只血清和端到端将悬浮液中的细胞以37°c 的2小时旋转。
注: 如果培养基在恢复过程中变黄, 则用含有20% 血清的新鲜培养基交换旧培养基。
3. 羧基琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 悬浮液中肿瘤细胞的荧光染色和分析
- 在悬浮细胞恢复后, 在 Neubauer 计数室中, 用台盼蓝计数合适的存活细胞数, 用于滴定荧光染色剂量和尾静脉注射。
- 在室温下将 162 x g 的细胞向下旋转3分钟, 并用重悬1毫升灭菌的 1x PBS 中的颗粒细胞, 其次是室温离心, 162 x g 为3分钟。
- 并用重悬500µL 中的颗粒细胞, 含有10% 的血清和 0, 5, 10, 20, 或40µM CFSE 剂量滴定, 并孵化细胞悬浮在 37 oC 10 分钟在黑暗中。
- 在室温下将 162 x g 的细胞向下旋转3分钟, 并用重悬 DMEM 4 毫升的颗粒细胞, 含有1% 的血清。重复这洗涤步骤三次。并用重悬的颗粒细胞与4毫升的 DMEM 单独为最终洗涤。
- CFSE 标记细胞进行荧光活化细胞分选 () 分析, 以量化单个细胞或尾静脉注射的荧光强度。
注: 在进行药物分析或尾静脉注射之前, 请将细胞放在冰上。
4. 肺定植试验
- 准备标记有20µM CFSE 的单元格 (请参阅步骤3.1 到 3.4)。
注: 根据 CFSE 的滴定结果, 确定肿瘤细胞标签的工作剂量 (参照步骤 3.3)。 - 在老鼠的基础上, 用一只小鼠的 C57BL/6, 用一盏卤素灯为5-10 分钟预热4-6 周大的雄性小鼠 (6 只老鼠) 的尾巴, 以扩张老鼠的尾脉。
- 彻底混合和吸入 CFSE 标记的肿瘤细胞与1毫升 (26Gx1/2) 注射器, 避免任何气泡在细胞悬浮 (与最终细胞密度 5 x 106细胞/毫升)。
- 仔细注射 1 x106 CFSE 标记肿瘤细胞200µL DMEM 到鼠标尾静脉, 应在鼠标抑制剂。
注: 在注射过程中, 如果针头直接放在尾静脉的腔内, 肿瘤细胞就应该很容易地传递到循环中, 而不需要用力推动注射器。如果很难推动肿瘤细胞通过, 它们很可能被注射到尾静脉外, 进入皮下空间。 - 将静脉接受 CFSE 标记肿瘤细胞的小鼠分为两组: 一组在肺定植试验中采用共聚焦显微术和 ImageJ 定量法进行肺灌注, 另外一个将单独留在4-5周的长期肺定植试验。
- 在 20, 38, 或 45 h 和与 1x 106肿瘤细胞静脉注射在时间路线-和剂量依赖性滴定, 麻醉瘤小鼠与50-75 毫克/千克 zoletil 50, 这是一个公认的和适当的 anesthetizer23。
注意: 在小鼠眼中使用兽医软膏, 以防止麻醉时的干燥。 - 用手术剪刀从腹部纵向切开皮肤和皮下组织。用手术剪刀和镊子打开胸腔, 充分暴露心脏和肺部。
注意: 小心避免切断血管。 - 用无菌手术缝线系上腔静脉 (SVC) 和下腔静脉, 防止肺灌注时灌注液回流。
- 用手术剪刀切开左心室壁, 打开裂缝 (约2-4 毫米), 从肺部排出灌注液。
- 用3毫升注射器将 1x PBS 注入右心室, 并在肺灌注过程中取出持续吸入的排泄液, 直到肺部从红色变为完全苍白。
5. 肺定植肿瘤细胞的共焦显微成像与分析
- 从胸腔中取出现在苍白的肺部, 用手术剪刀和钳24切除气管和结缔组织韧带, 将五裂片分开。
- 准备一个担架状的肺支架, 如图 3B所示, 通过围绕两个金属棒缠绕尼龙缝合, 以产生网状纹理, 在两个杆之间放置肺裂片的空间。把肺支架放在6厘米的盘子里。
注: 肺支架将用于稳定的肺裂片下方的目标透镜的共聚焦显微镜。 - 将肺叶固定在肺支架的网状纹理上。用 1x PBS 覆盖并滋润肺裂片。
- 主题的6厘米培养皿窝藏肺瓣在肺部持有者共聚焦显微镜捕捉荧光图像记录肺殖民肿瘤细胞。
- 对于成像, 使用物镜 (5X, MPLN, NA: 0.1, WD:20, 空气)。
- 旋转过滤轮到 NIBA (激发/发射; 470-495 nm/510-550 nm), 并使用 488 nm 激光激发 CFSE, 以清晰地可视化的荧光点图像的肺裂片。
- 将过滤轮旋转到 R690 (用于埋汰 HP DeepSee 激光器) 以2.0 µs/像素扫描速度扫描, 并优化高压、增益和偏移电平。
- 使用具有10µs/像素扫描速度的显微镜软件捕获荧光图像 (512 x 512 像素)。
- 使用 ImageJ 和 GraphPad 软件对显微图像进行量化和统计分析, 如前所述21。
6. 长期肺定植测定
注意: 重复步骤4.1 到4.5。
- 在肿瘤细胞接种4-5 周后牺牲老鼠, 用 Bouin 的液体25 1 到2天来修复肺部。
- 用软件21对小鼠肺部肿瘤结节进行定量分析和统计分析。
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Representative Results
在进行体内肺定植试验之前, 如图 1A所示, 以测试悬浮肿瘤细胞的 polyFN 是否介导肺定植和/或渗出在促进转移, 我们首先滴定不同的CFSE 的浓度, 一种荧光化合物, 它是细胞渗透性和共价键结合胞内胺的分子26,27在悬浮肿瘤细胞, 并保持在细胞相当长一段时间。我们发现肿瘤细胞以剂量依赖性的方式有效地标记了 CFSE, 如图 1B所示。CFSE 标记在 6 x105有限责任公司细胞/mL 几乎达到了一个高原20µM 如图 1C所示。
由于大量狭窄的毛细管系统可能会物理上阻碍肺血管内 CTCs 的流动, 我们在小鼠体内进行肺灌注 CFSE 标记的有限责任公司细胞, 以清除非特定的被困 CTCs, 作为如图 4所示, 在每个时间点进行肺切除之前,图 1A中所示。在灌注前, 由于血液的存在, 肺部明显呈红色, 如 图 2左面板所示。肺部变得苍白后, 灌注10-15 毫升 1x PBS, 如图 2的右面板所示。
在将灌注后的小鼠肺部从胸膜腔中取出后, 肺叶被分离并安装在盘子中的肺支架上, 如图 3A所示, 1x PBS 彻底覆盖了肺裂片。如图 3B所示, 肺瓣安装在肺部支架上, 如图 3A所示, 受共焦荧光显微镜的影响。CFSE 标记的肿瘤细胞对肺部进行了殖民化成像,图 3C 的上部面板中显示了图像, 并将其变成黑白影像, 如图3C 的下面板所示. 以图像 J 软件促进肺定植的量化.
我们静脉注射的 shScr 或 shFN 有限责任公司的细胞被标记为20µM CFSE, 等待一段时间的过程从24-72 小时之前执行肺显影和共焦显微成像。6只小鼠肺殖民肿瘤细胞的定量研究如图 4A所示, ImageJ 软件显示, 在38小时和 45 h 时间点上, shFN 有限元 shScr 有限元电池的数量明显减少, 如图4B 所示。.肺殖民 shScr 和 shFN 有限责任公司细胞数量逐渐减少的原因很可能是由于循环免疫对已经被殖民的 LLC 细胞的持续细胞毒性。总的来说, 这些结果表明, polyFN 组装在 CTCs 确实需要在调解肺殖民化有限责任公司细胞, 导致完全转移在肺部的结果显示, 一些小鼠静脉注射接受整除数CFSE 标记的 shScr 和 shFN 有限责任公司细胞为肺的殖民化化验, 如图 4所示左 aloneuntil 肺肿瘤结节是在实验性肿瘤转移试验中, 如图 5A 和 5B所示。
图 1: 在肺定植试验中标记肿瘤细胞的 CFSE 浓度滴定法.(A) 《议定书》一节详细说明了肺定植试验和实验性转移化验程序的示意图。(B)对 CFSE 各种浓度的有限责任公司细胞的 CFSE 荧光强度进行了资产管制分析。(C)荧光强度被绘制为各种 CFSE 浓度的函数。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 灌注前后肺部.肺部代表性图像 (unperfused;Unperf)后 (灌流;性能)执行肺灌注。金星: 心。白色箭头: 闭合静脉/SVC 的领带。红色箭头: 在灌注前后同一只老鼠的肺部。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 在肺部支架上灌注的肺叶的安装, 用于荧光共聚焦显微镜.(A)肺支架的肺固定方案, 用于共聚焦显微术。(B)有代表性的图像, 3 肺叶在肺支架上灌注。(C)具有 CFSE 荧光的肺殖民化有限责任公司细胞的代表性图像 J 软件量化。上面板: 常规成像。下面板: 反向黑白成像。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 肺部殖民化试验肺灌注后肺 shScr 和 shFN 有限责任公司细胞的时间路线成像、定量和统计分析.(A)有代表性的黑白图像 (从荧光图像中转换) shScr 和 shFN 有限责任公司细胞在肺血管中被殖民在不同的时间点, 在广泛的肺灌注后描述。虚线表示焦点聚焦的肺组织区域的边缘。( B)通过平均5个绝对代表性的图像/肺叶/老鼠, 对肺殖民化有限责任公司细胞进行量化和统计分析。注: 每个条形指示每个聚焦聚焦区域的平均荧光强度。对6只小鼠的数据进行统计学分析, 并报告为均值 SD;生理盐水指显著;* 指 p < 0.05;和 ** 指 p < 0.01;双向方差分析。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 在 CFSE 标记的有限责任公司细胞中, 沉默 FN 表达减少了肺中肿瘤结节的长期体内反殖试验.(A) Bouin 的液体固定小鼠肺部, 其肿瘤结节来源于 CFSE 标记的 shScr 或 shFN 有限责任公司细胞。(B)对肺部肿瘤结节进行量化和统计分析。数据被报告为平均值 * SD;: p < 0.001;每组 n=6;不配对 t 检验。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
结合长期的肺定植试验, 我们在这里使用的短期方法, 以评估在体肺殖民化的 CTCs 在遥远的器官清楚地揭示和区分 polyFN 的具体作用聚集在 CTCs 的殖民肺, 然后导致渗出和转移的过程18,19,20,21。虽然标记细胞与长期细胞追踪器 CFSE 允许我们跟踪静脉注射注射 CTCs 在肺灌注前长达三天, 并保留足够的绿色荧光定量的目的, 这是不可能直接确定肿瘤细胞是否位于血管腔内或已经淤血血管。为了解决这一问题, 红荧光罗丹明-共轭葡聚糖, 可以不专门绑定到凝集素表达在内皮可以用来标记肺血管在肺灌注28,29,30. 尽管 CFSE 是一个长期的细胞追踪器, 但它的荧光强度被减半, 每细胞分裂27, 限制了在标记技术中使用它的潜力。为了规避这一问题, 应确定 CFSE 的标记剂量足以使细胞在体内实验的整个持续时间内保持可检测性, 任何应用于细胞的治疗都不会对细胞产生影响。增殖。由于 shScr 和 shFN CTCs 在分离小鼠中的比较和定量, 可以认为两组之间的差异是由个体变异引起的。为了排除这种变异, 两种类型的肿瘤细胞的混合物, 标记为不同的荧光染料 (例如, CFSE/CM-diI) 或稳定地转染 GFP/dsRed 可以同时静脉注射到同一动物的肺部殖民化化验31,32,33。值得注意的是, 克隆的效果是由细胞克隆技术, 试图解决稳定的荧光蛋白转染细胞克隆与足够强的荧光34,35,36,37可使克隆细胞不具代表性, 代表整个异质种群38、39、40。如果将任何荧光蛋白的稳定转染成肿瘤细胞是理想的肺定植检测, 提高转染效率的肿瘤细胞作为一个整体应该更好地保留原有的特征比克隆细胞人口以充足的荧光41,42。
在肺的定植试验中, 肺灌注步骤是必要的, 因为有些静脉注射的肿瘤细胞, 而不是专门逮捕肺毛细血管系统, 往往被机械地困和堵塞在毛细血管网络肺组织由于 CTCs 的平均直径大于肺毛细血管流明的宽度43,44。无灌注肺殖民肿瘤细胞的定量化可能导致高估, 错误计数机械卡住的细胞45,46,47。即使肺部已经灌注, 其他问题仍然存在。例如, 仍然很难区分肺殖民化肿瘤细胞是否位于食管腔内皮, 或者已经淤血血管。为了解决这个问题, 用罗丹明共轭葡聚糖染色血管, 可能有用30,48,49。或者, 如果需要量化肿瘤渗出量, 钙离子螯合剂 EDTA/EGTA 或胰蛋白酶, 一种非特异蛋白酶, 可用于灌注缓冲, 以阻止钙依赖性和-独立的肿瘤细胞黏附事件50,51,52. 因此, 留在肺组织中的肿瘤细胞可视为淤血。
为定量的肺殖民肿瘤细胞, 灌注肺部往往受到传统的共焦显微镜。然而, 组织深度的可测性有限, 部分原因是组织荧光和荧光散射效应, 使更深的组织无法探测到53,54。二光子显微镜具有比传统共焦显微镜更高的灵敏度, 适用于解决这种问题, 即近红外辐射用于双光子激发, 而生物标本的吸收明显小于紫外线或蓝绿光使该技术更适合成像厚标本55,56,57。肺殖民肿瘤细胞计数的平均肿瘤细胞数在几个代表性的共焦图像, 其中不包括整个数量的肺殖民肿瘤细胞在整个肺部的单个动物。为了量化肺定植检测中的全肺, 可以使用稳定转染荧光素酶的肿瘤细胞, 并在静脉接种悬浮肿瘤细胞后 IVIS 成像, 在存在荧光素46,58,59。另外, 灌流的肺部可以被切成块, 并接受酶消化蛋白酶,例如, 胶原酶, 释放单个细胞到悬浮60,61。荧光染料或稳定转染荧光蛋白的肿瘤细胞可以用荧光活化细胞分选 (56,62) 进行量化。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢明敏博士和雅安女士的技术支持。这项工作得到了台湾科技部 (103-2325-006-009, 最 104-2325 b-006-001, 最 105-2325-006-001, MOST-106-2320-B-006-068-MY3) 和卫生部 (MOHW106-TDU-B-211-144004) 的支持。我们也感谢国立中诚大学医学院核心研究实验室对其多光子共聚焦显微镜的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-9048-46-8 | |
| Bouin's Fluid | MCC(medical chemical corporation)/POISON | 456-A-1GL | |
| CFSE Proliferation Dye | ebiosciences | 65-0850-85 | Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 12100-061 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-6381-92-6 | For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) |
| Fetal bovine serum (FBS) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 10437-028 | |
| Lewis lung carcinoma (LLC) | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-1642 | |
| L-Glutamine, USP | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 21051-024 | |
| Potassium chloride (KCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7447-40-7 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM ) |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7778-77-0 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM ) |
| Sodium chloride (NaCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7647-14-5 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM ) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-10039-32-4 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM ) |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T6146 | 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T4799 | For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L ) |
| Zoletil 50 | Virbac | To dilute with 1X PBS | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Compact Tabletop Centrifuge 2420 | KUBOTA Co. | 2420 | |
| Culture dish (6cm) | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 705001 | |
| Disposable syringe (with needle) | Perfect Medical Industry Co. | 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml | |
| End over end mixer | C.T.I YOUNG CHENN | TS-20 | For suspended cells recovery |
| FACSCalibur (FACS) | BD biosciences | ||
| Forceps | Dimeda | 10.102.14 | |
| Forma Direct Heat CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc. | HEPA CLASS 100 | |
| Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) | Stoelting | 51338 | |
| Multiphoton Confocal Microscope BX61WI | Olympus | FV1000MPE | |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld-Superior | 640010 | |
| Surgical scissor | Dimeda | 08.370.11 | |
| Surgical sutures | UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. | NO. 0034 | Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0) |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | |
| 15 mL Greiner tube | Greiner bio-one | 188271 |
References
- Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A.
- Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells - mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
- Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687 (2017).
- Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
- Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
- Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44 (2016).
- Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
- Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
- Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
- Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680 (2016).
- van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
- Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
- Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
- von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
- Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
- Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
- Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
- Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72 (2017).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
- Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
- Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162 (2012).
- Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
- Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
- Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344 (2017).
- Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152 (2016).
- Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555 (2016).
- Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
- Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W.
- Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30 (2014).
- Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
- Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678 (2015).
- Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
- Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
- Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
- Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796 (2015).
- Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
- Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
- Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
- Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
- Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
- Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
- Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18 (2012).
