Summary
Een dierlijk model is nodig om het ontcijferen van de rol van circulerende tumorcellen (CTCs) bij de bevordering van longkanker kolonisatie tijdens kanker uitzaaiingen. Hier, we vastgesteld en met succes uitgevoerd een in vivo assay op specifiek proef de eis van polymere fibronectine (polyFN) vergadering over CTCs voor longkanker kolonisatie.
Abstract
Metastase is de belangrijke doodsoorzaak kanker. De rol van circulerende tumorcellen (CTCs) biij van uitzaaiing van de kanker, waarin Long kolonisatie door CTCs kritisch aan de vroege Long metastatische processen bijdraagt, heeft krachtig onderzocht. Als zodanig, zijn dierlijke modellen de enige aanpak die de volledige systemische proces van metastase vangt. Gezien het feit dat er zich problemen in eerdere experimentele designs voordoen voor de behandeling van de bijdragen voor CTCs aan bloedvat extravasation, we een in vivo -bepaling van het Long-kolonisatie vastgesteld waarin een lange-termijn-fluorescentie cel-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), werd gebruikt voor het label van de geschorste tumorcellen en longkanker perfusie Schakel niet-specifiek gevangen CTCs voorafgaand aan longkanker verwijdering, confocal imaging en kwantificering werd uitgevoerd. Polymere fibronectine (polyFN) is geassembleerd op CTC oppervlakken is gebleken te bemiddelen Long kolonisatie in de uiteindelijke oprichting van uitgezaaide tumor weefsels. Hier, als u wilt specifiek testen de eis van polyFN vergadering op CTCs voor longkanker kolonisatie en extravasation, we korte termijn uitgevoerd Long kolonisatie testen waarin geschorst Lewis lung carcinoma cellen (LLCs) stabiel uiten FN-shRNA (shFN) of Scramble-shRNA (shScr) en vooraf gelabeld met 20 μM van CFSE waren intraveneus geënt in C57BL/6 muizen. Wij succesvol gebleken dat de capaciteiten van shFN LLC cellen te koloniseren de muis longen werden aanzienlijk verminderd ten opzichte van shScr LLC cellen. Daarom kan dit op korte termijn methodologie algemeen worden toegepast om aan te tonen specifiek de mogelijkheid voor CTCs binnen het verkeer om te koloniseren de longen.
Introduction
Metastase is de belangrijkste oorzaak van kanker overlijden1,2. Tumorcellen uit primaire weefsels verkregen Voer het verkeer in suspensie en overleven van verschillende hematogene uitdagingen, bijvoorbeeld, anoikis, immuun aanvallen en schade als gevolg van de shear stress van bloeddruk of geometrische beperkingen, voordat ze zijn kundig voor koloniseren verre organen, een belangrijke stap die het succes van metastase3,,4,,5,6te dicteren. Daarom, krachtige inspanningen momenteel gedaan in karakterisering van circulerende tumorcellen (CTCs) en het correleren van deze kenmerken met maligniteit van de tumor, uitzaaiingen en overlevingskansen bij kanker patiënten7,8 , 9. aangezien het proces van uitzaaiing van kanker specifiek een in vivo -evenement toont, dierlijke modellen zijn de enige aanpak die de volledige systemische proces van metastase10,11,12 vangt .
CTCs geworden uitgezaaide tumor weefsels via meerdere cellulaire gebeurtenissen met inbegrip van de kolonisatie van verre organen1,2. Echter, de meest gebruikte metastase assays13,14,15 bieden niet een manier om het observeren van CTC kolonisatie van verre organen. Een in vivo test ontwerp voor CTC kolonisatie visualisatie is daarom dringend noodzakelijk. Hoewel verschillende in vivo en ex vivo korte blijven termijn Long kolonisatie testen zijn ontworpen, problemen en nadelen. Bijvoorbeeld, terwijl groene fluorescentie proteïne (GFP)-overexpressing tumor cellen zijn gebruikt in deze testen22,23, het kost tijd om stabiel transfect en kloon van tumorcellen met voldoende GFP fluorescerende intensiteit onder de Microscoop. Evenzo, voorbijgaande kleuring van tumorcellen met de lange termijn cel tracer CFSE is werkzaam ter vervanging van de tumorcellen GFP-uitdrukken, maar nog steeds moeilijk te beoordelen of de CFSE-geëtiketteerden tumorcellen zijn gekoppeld of alleen aanwezig binnen de therapieën voor de verwijderde verre organen16,17.
Polymere fibronectine (polyFN) is geassembleerd op oppervlakken voor CTCs is gebleken dat kritisch bijdragen tot de uiteindelijke oprichting van uitgezaaide tumor weefsels18,19,20,21,22 . Hier, we uitgevoerd korte termijn Long kolonisatie testen die in zwevende Lewis lung carcinoma cellen (LLCs) stabiel uiting van FN-shRNA (shFN) of scramble-shRNA (shScr) en vooraf gemarkeerd met CFSE intraveneus in C57BL/6 muizen geënt werden. Na 2-3 dagen, werden muis longen eerst geperfundeerd met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor het verwijderen van niet-vastgemaakte CTCs binnen de therapieën alvorens te worden onderworpen aan confocale microscopie en kwantificering van LLCs Long-koloniseren. We toonden duidelijk dat het aantal Long-koloniseren shFN LLCs en tumor knobbeltjes aanzienlijk werden verminderd in vergelijking met shScr LLCs, aanzienlijk ondersteunend de rol van polyFN vergadering op CTCs in het vergemakkelijken van de kolonisatie en de groei van CTCs in de longen. Onze studie nog verdere onderzoek voor de rol van polyFN in kanker uitzaaiingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten op muizen werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van ons Instituut (de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, NCKU Medical College).
1. voorbereiding van de instrumenten, cultuurmedia en gerechten
- Voordat u begint de experimentele protocollen, verkrijgen steriele chirurgische hechtingen, 1 mL spuiten met 26G/0,5 cm naald (voor staart-veneuze injectie), 3 mL spuiten met 24G/3 cm naald (voor longkanker perfusie), Dulbecco van bewerkt Eagle Media (DMEM), trypsine-EDTA-oplossing (5 g/L trypsine en 0.53 mM), foetale runderserum (FBS), 1 x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM nb2PHO4en 1,8 mM KH2PO4) en 6 cm cultuur gerechten.
2. voorbereiding en herstel van tumorcellen in suspensie
- Bereiden van steriele Dulbecco bewerkt Eagle Media (DMEM) bevattende 10% of 20% FBS en 2 mM L-glutamine, 1 x PBS en 0,05% vers toevoegen trypsine-EDTA.
- Cultuur van de cellen in de DMEM aangevuld met 10% FBS bij 37 ° C en ze groeien zolang er geen samenvloeiing van 70-80% in de cultuur-schotel.
- Verwijder het medium van de cultuur (DMEM) van de gerechten, gevolgd door twee wasbeurten met 2 mL steriele 1 x PBS.
- Voeg vervolgens 1 mL van 0,05% trypsine-EDTA in de gerechten ter grondig dekking van alle cellen. Onmiddellijk verwijderen van 800 μL van de oplossing en laat slechts 200 μl in de gerechten. Incubeer de gerechten bij 37 ° C gedurende 30 s naar 1 min (afhankelijk van het celtype) en wachten totdat de meerderheid van de cellen in de onderbroken toestand.
- Voeg 1 mL verse DMEM met 10% FBS rechtstreeks in de gerechten om te stoppen met de enzymatische activiteit van trypsine en krachtig Pipetteer de celsuspensie het op en neer met een pipet 1000 µL ter voorbereiding van de schorsing van een enkele cel.
- Overdracht van de cellen van de schotel naar een 1,5 mL microcentrifuge buis, en spin down de cellen bij kamertemperatuur op 162 x g gedurende 3 minuten.
- Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen van de tumor in 1,5 mL DMEM met 20% FBS en eind over de cellen in suspensie bij 37 ° C gedurende 2 uur roteren.
Opmerking: Als het medium geel tijdens het herstel, wisselen de oud medium met verse medium dat 20% FBS.
3. fluorescentie kleuring en analyse van tumorcellen in suspensie met Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)
- Na herstel van de cel in suspensie, de juiste levensvatbare cellen getallen tellen met Trypan blauw in een kamer voor de titrating van de fluorescentie kleuring doses tellen Neubauer en voor staart veneuze injectie.
- Spin down de cellen bij 162 x g bij kamertemperatuur voor 3 min en resuspendeer die de Ingehuld cellen in 1 mL gesteriliseerd 1 x PBS, gevolgd door de kamertemperatuur centrifugeren op 162 x g gedurende 3 minuten.
- Resuspendeer de Ingehuld cellen in 500 µL van 1 X PBS met 10% FBS en 0, 5, 10, 20 of 40 µM CFSE voor dosistitraties, en de celsuspensie bij 37 oC gedurende 10 minuten in het donker uit te broeden.
- Spin down de cellen bij 162 x g bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten en resuspendeer de Ingehuld cellen met 4 mL DMEM met 1% FBS. Herhaal deze stap van wassen drie keer. Resuspendeer de Ingehuld cellen met 4 mL DMEM alleen voor de laatste wasbeurt.
- De cellen van CFSE-label onverminderd fluorescentie-activated cell sorting (FACS) analyse om te kwantificeren van de intensiteit van de fluorescentie van een enkele cel of staart veneuze injectie.
Opmerking: Houd de cellen op ijs voordat de FACS analyse of staart ader injecties wordt uitgevoerd.
4. lung kolonisatie Assay
- De cellen met het label met 20 µM CFSE bereiden (verwijs naar stap 3.1 via 3.4).
Opmerking: Etikettering van tumorcellen, gebaseerd op de resultaten van de titratie van de analyse van FACS beslissen de dosis van de werken van CFSE (zie stap 3.3). - Opwarmen van de staarten van 4-6 week-oude mannelijke C57BL/6 muizen (6 muizen) met een HQI-lamp voor 5-10 min op basis van muis-door-mouse muis staart aderen verwijden.
- Grondig meng en CFSE-geëtiketteerden tumorcellen gecombineerd met een spuit van 1 mL (26Gx1/2), het vermijden van alle bubbels in de celsuspensie (met een definitieve celdichtheid van 5 x 106 cellen/mL).
- Zorgvuldig injecteren 1 x106 CFSE-geëtiketteerden tumorcellen in 200 µL van DMEM in de muis staart ader, die moet worden ingediend in de afdekking van een muis.
Opmerking: Tijdens de injectie, als de naald direct in het lumen van de ader van de staart geplaatst wordt, tumorcellen moeten gemakkelijk zonder worden geleverd in de circulatie moeten duwen hard op de spuit. Als het is moeilijk te duwen de tumorcellen via, zijn ze waarschijnlijk ingespoten buiten de staart ader, in de subcutane ruimte. - Verdeel de muizen die intraveneus de CFSE-geëtiketteerden tumorcellen in twee groepen ontvangen: één groep zal ondergaan Long perfusie gevolgd door confocale microscopie en ImageJ kwantificering in de bepaling van de kolonisatie longkanker en de andere blijft alleen voor 4-5 weken in de lange termijn Long kolonisatie assay.
- Op 20, 38 of 45 h en 1 x 106 tumorcellen intraveneus geïnjecteerd tijdens een tijd cursus - en dosisafhankelijk titratie, anesthetize tumor-dragende muizen met 50-75 mg/kg zoletil 50, dat een goed aanvaard en goede anesthetizer23 is.
Opmerking: Gebruik dierenarts zalf op de muizen van ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving. - Overlangs snijden de huid en de subcutane weefsels uit de buik naar de regio van de borst met een chirurgische schaar. Open de pleurale holte met een chirurgische schaar en pincet volledig bloot het hart en de longen.
Opmerking: Wees voorzichtig om te voorkomen dat afsnijden van bloedvaten. - Stropdas de superieure vena cava (SVC) en de vena cava inferior (IVC) met steriele chirurgische hechtingen om te voorkomen dat de terugvoer van de oplossing van de perfusie tijdens Long perfusie.
- Snijd de wand van de linkerventrikel met een chirurgische schaar te openen een horizontalis (ongeveer 2-4 mm) om de afvoer van de perfusie-oplossing van de longen.
- 1 x PBS injecteren in het rechterventrikel met een spuit met 3 mL en verwijder de gedraineerde oplossing met constante zuigkracht tijdens Long perfusie totdat de longen van een roodachtige kleur tot volledig bleke wenden.
5. confocal microscopische beeldvorming en analyse van Long-gekoloniseerd tumorcellen
- Verwijder de nu-pale longen uit de pleurale Holte en de vijf lobben scheiden door het weg te snijden van de ligamenten van de luchtpijp en bindweefsel met chirurgische schaar en pincet24.
- Bereiden een brancard-achtige Long houder zoals weergegeven in figuur 3B door wikkelen van een nylon hechtdraad rond twee metalen staven om te produceren een reticulate textuur met een spatie tussen de twee staven voor de plaatsing van longkanker lobben. Stel de Long houder in een 6 cm schotel.
Opmerking: De houder van de Long wordt gebruikt om te stabiliseren van de Long lobben onder het objectief van een confocal microscoop. - Indienen en monteren van de Long lobben op de reticulate textuur van de houder van de longen. Cover en Bevochtig de lobben van de Long met 1 x PBS.
- Onder voorbehoud van de cultuur van de 6-cm schotel herbergen de lobben van de longen op de Long houder confocale microscopie fluorescentie beelden opnemen van de tumorcellen Long-koloniseren.
- Gebruik voor imaging, objectieven (5 X, MPLN, NB: 0.1, WD: 20, lucht).
- Draai het wieltje van de filter aan NIBA (excitatie/emissie; 470-495 nm/510-550 nm) en gebruik een 488 nm laser te wekken CFSE, duidelijk visualiseren beelden van fluorescentie stippen in de lobben van de longen.
- Draai het wieltje van de filter te R690 (voor MaiTai HP Mussel laser) om te scannen met 2.0 µs/pixel scannen vaart en optimaliseren van de HV, Gain naam module en verschuiving niveaus.
- Fotograferen fluorescentie (512 x 512 pixels) met behulp van de Microscoop software met een 10 µs/pixel scansnelheid.
- Kwantificeren en de microscopische beelden met behulp van ImageJ en GraphPad software als eerder beschreven21statistisch te analyseren.
6. lange termijn Long kolonisatie testen
Let op: Herhaal stap 4.1 tot 4.5.
- De muizen offeren na tumor cel inoculatie voor 4-5 weken en monteren van hun longen met Bouin van vloeibare25 voor 1 tot 2 dagen.
- Kwantificeren en de knobbeltjes van de tumor uit de longen van de muizen met software21statistisch te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voordat u de in-vivo -bepaling van het Long-kolonisatie uitvoert zoals wordt geïllustreerd in figuur 1A om te testen of polyFN op zwevende tumorcellen bemiddelt Long kolonisatie en/of extravasation bij het vergemakkelijken van metastase, we eerst getitreerd verschillende concentraties van CFSE, een fluorescerende stof die cel permeabele covalent conjugaten van intracellulaire amine-bevattende moleculen26,27 in zwevende tumorcellen en gedurende een lange periode van tijd in de cellen. We vonden dat tumor cellen waren effectief gelabeld met CFSE op een dosis-afhankelijke manier, zoals geïllustreerd in figuur 1B. De CFSE-labeling in 6 x105 LLC cellen/mL bijna een plateau op 20 µM als bereikt geïllustreerd in Figuur 1 c.
Ten gevolge van de overvloedige vernauwde capillaire systeem dat fysiek de stroom van CTCs binnen de longen therapieën kan belemmeren, we Long perfusie in muizen die intraveneus geïnjecteerd CFSE-geëtiketteerden LLC cellen als u wilt wissen van niet-specifiek gevangen CTCs, als uitgevoerd geïllustreerd in figuur 1A voorafgaand aan longkanker verwijderen op elk punt van de tijd zoals afgebeeld in Figuur 4. Vóór perfusie, de longen waren duidelijk roodachtig als gevolg van de aanwezigheid van bloed, zoals geïllustreerd in de linkerdeel van Figuur 2. De longen werd bleek na perfusie met 10-15 mL 1 x PBS, zoals geïllustreerd in het rechterpaneel van Figuur 2.
Onmiddellijk na de geperfundeerd muis longen werden verwijderd uit de pleurale ruimte, waren de Long lobben gescheiden en gemonteerd op de Long houder geplaatst in gerechten, zoals geïllustreerd in figuur 3A met 1 x PBS grondig over de longen lobben. De lobben van de Long gemonteerd op de houder van de longen zoals geïllustreerd in figuur 3B werden onderworpen aan confocal fluorescentie microscopie zoals geïllustreerd in figuur 3A. De CFSE-geëtiketteerden tumorcellen koloniseren de longen werden beeld zoals geïllustreerd in de bovenste paneel van Figuur 3 c en omgezet in zwart-wit beelden, zoals geïllustreerd in de lagere paneel van Figuur 3 c ter vergemakkelijking van de kwantificering van longkanker kolonisatie met afbeelding J software.
We intraveneus ingespoten met shScr of shFN LLC cellen die zijn gemarkeerd met 20 µM CFSE en wachtte op een tijdsverloop van 24-72 uur vóór het uitvoeren van de Long perfusions en confocal microscopische beeldvorming. Kwantificering van de Long-koloniseren tumor cellen in 6 muizen zoals geïllustreerd in figuur 4A met ImageJ software onthuld dat aanzienlijk minder shFN LLC cellen dan shScr LLC cellen werden geteld op de 38 h en 45 h tijd punten, zoals geïllustreerd in figuur 4B . De reden waarom het aantal zowel Long-gekoloniseerd shScr en shFN LLC cellen geleidelijk verminderd zeer waarschijnlijk te wijten aan de continue cytotoxiciteit uitgeoefend door de circulatie van immuniteit zelfs tegen de al gekoloniseerde LLC-cellen was. Over het geheel genomen deze resultaten suggereren dat polyFN gemonteerd op CTCs inderdaad nodig is in het bemiddelen van kolonisatie van de longen door LLC cellen, wat leidt tot volledige uitzaaiingen in de longen zoals geopenbaard door de resultaten in welke sommige muizen intraveneus ontvangen aliquots van het CFSE-label shScr shFN LLC cellen en voor de Long kolonisatie assays zoals geïllustreerd in Figuur 4 bleven aloneuntil Long tumor knobbeltjes in de experimentele tumor metastase assay werden ontwikkeld, zoals geïllustreerd in figuur 5A en 5B.
Figuur 1: titratie van de concentraties van de CFSE voor het labelen van tumorcellen in de Long kolonisatie assay. (A) Schematische illustratie van procedures voor de bepaling van de kolonisatie longkanker en de bepaling van de experimentele metastase zoals beschreven in de sectie protocollen. (B) FACS analyse voor de CFSE fluorescentie intensiteiten van LLC cellen die werden gekleurd met verschillende concentraties van CFSE. (C) fluorescentie intensiteiten werden uitgezet als functies van de verschillende concentraties van de CFSE. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: longen vóór en na de perfusie. Representatieve beelden van longen vóór (unperfused; Unperf.) en na (geperfundeerd; Perf.) het uitvoeren van longkanker perfusie. Gouden ster: hart. Witte pijl: de band die de IVC/SVC gesloten. Rode pijlen: de longen van de dezelfde muis vóór en na de perfusie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: montage van de geperfundeerd Long lobben van de Long-houder voor fluorescentie confocale microscopie. (A) schema van de Long-montage op de Long-houder voor de confocal microscopie. (B) een representatief beeld van 3 geperfundeerd Long lobben van de Long-houder. (C) representatieve beelden van Long-koloniseren LLC cellen met CFSE fluorescentie voor kwantificering van Image J software. Bovenste deelvenster: regular imaging. Lagere paneel: zwart-wit beeldvorming omgekeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: tijd cursus beeldbewerking, kwantificering en statistische analyse voor de Long gekoloniseerd shScr en shFN LLC cellen na longkanker perfusie in de Long kolonisatie assay. (A) representatieve zwart-witafbeeldingen (geconverteerd van fluorescentie afbeeldingen) shScr en shFN LLC cellen die werden gekoloniseerd in de Long therapieën op verschillende tijdstippen zoals afgebeeld na uitgebreide Long perfusie. Stippellijnen duiden de rand van het gebied van in-focus confocal Long weefsel. (B) kwantificering en statistische analyse voor de Long-koloniseren LLC cellen als gevisualiseerd in (A) door gemiddeld 5 absolute representatieve beelden/Long kwab/muis. Opmerking: Elke staaf geeft de gemiddelde fluorescentie intensiteit van elke in-focus confocal gebied. Gegevens zijn statistisch geanalyseerd van 6 muizen en gemeld zoals bedoel ± SD; n.s. betekent opgave; * betekent p < 0,05; en ** betekent p < 0,01; Two-way ANOVA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: FN expressie in CFSE-geëtiketteerden LLC cellen Silencing tumor knobbeltjes in de longen vermindert op de lange termijn in vivo CTC kolonisatie assay. (A) Bouin van vloeistof-vaste muis longen rekening houdend met tumor knobbeltjes afgeleid van CFSE-label shScr of shFN LLC cellen. (B) kwantificering en statistische analyse voor de knobbeltjes van de tumor in de longen. Gegevens zijn gerapporteerd, zoals bedoel ± SD; : p < 0,001; n = 6 per groep; Ongepaarde t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samen met de lange termijn Long kolonisatie testen, korte termijn methodologie we hier gebruikt om te evalueren in vivo Long kolonisatie door CTCs in verre organen duidelijk onthuld en de specifieke rol van polyFN gemonteerd op CTCs in koloniseren gedifferentieerd de longen, wat vervolgens tot de extravasation en metastatische processen18,19,20,21 leidde. Hoewel cellen met lange termijn cel tracker CFSE konden we sporen de intraveneus ingespoten CTCs voor maximaal drie dagen voorafgaand aan de Long perfusie en voldoende groene fluorescentie behouden voor kwantitatieve doeleinden te labelen, was het onmogelijk om rechtstreeks vast te de tumorcellen zich bevonden binnen het schip lumen of al extravasated van de bloedvaten. Om op te lossen dit probleem, rode fluorescerende kan rhodamine-geconjugeerde dextran wie vermag niet-specifiek binden aan lectines uitgedrukt op endothelia worden gebruikt voor het label van de Long therapieën tijdens Long perfusie28,29, 30. ondanks het feit dat CFSE een lange termijn cel tracker, de intensiteit van de fluorescentie is is gehalveerd elke celdeling27, beperking van de mogelijkheden van het gebruik ervan in de etikettering van technieken. Om dit probleem te omzeilen, moet worden vastgesteld dat de labeling dosering van CFSE voor cellen volstaat blijven aantoonbaar voor de gehele duur van het in vivo experimenten en dat elke behandeling op de cellen toegepast geen effect op de cel heeft proliferatie. Omdat de vergelijking en de kwantificering van de Long-koloniseren shScr en shFN CTCs werden gedaan in aparte muizen, kan worden aangevoerd dat de verschillen tussen de twee groepen als gevolg van individuele variatie werden. Om uit te sluiten dergelijke variatie, kan een mengsel van twee soorten tumor cellen aangeduid met verschillende lichten kleurstoffen (bijvoorbeeld CFSE/CM-diI) of stabiel transfected met GFP/dsRed gelijktijdig intraveneus worden geïnjecteerd in hetzelfde dier in de Long-kolonisatie assay31,32,33. Het is vermeldenswaard dat klonen effecten als gevolg van de cel van klonen van technologie die wordt geprobeerd om stabiel uitzoeken fluorescent proteïne-transfected cel met voldoende sterke fluorescentie34,35, klonen 36 , 37 kan maken de gekloonde cellen niet representatief voor de hele heterogene populaties38,39,40. Indien een stabiele transfectie van elke fluorescent proteïne in tumorcellen is gewenst voor het testen van de kolonisatie Long, moet verheffen van de efficiëntie van de transfectie van de tumorcellen als geheel beter behouden de oorspronkelijke kenmerken dan het klonen van de cel populaties met voldoende fluorescentie41,42.
De Long-perfusie stappen in de kolonisatie van de Long tests nodig zijn, in die zin dat sommige intraveneus ingespoten tumorcellen, in plaats van specifiek arresteren aan de Long capillaire systeem, de neiging om mechanisch worden gevangen en vastgelopen binnen de capillaire netwerken van Long weefsels als gevolg van de gemiddeld grotere diameters van CTCs dan de breedte van de Long capillaire lumen43,44. Kwantificering van de tumorcellen Long-koloniseren zonder zoogdierlevercellen de longen kan resulteren in een overschatting door het mechanisch geblokkeerde cellen45,46,47per ongeluk te tellen. Zelfs als de longen hebben zijn geperfundeerd, nog steeds extra problemen. Bijvoorbeeld, is het nog steeds moeilijk om te onderscheiden of de tumorcellen Long-koloniseren bevinden zich op de lumenal endothelia hebben al extravasated van de bloedvaten. U kunt dit probleem oplossen, kleuring van de bloedvaten met Rhodamine-geconjugeerde dextran als bovengenoemde wellicht nuttig30,48,49. Als alternatief, indien kwantificering van tumor extravasation is gewenst, calcium-complexvormer EDTA/EGTA of trypsine, een aspecifieke protease, kan worden gebruikt in de perfusie-buffer te belemmeren calcium-afhankelijke en -zelfstandige tumor cel adhesie gebeurtenissen50 , 51 , 52. dus, de tumorcellen nog in de weefsels van de longen kunnen worden beschouwd als extravasated.
Voor de kwantificering van de tumorcellen Long-koloniseren, zijn de perfused longen vaak onderworpen aan traditionele confocale microscopie. De meetbaarheid van de diepte van het weefsel wordt echter gedeeltelijk te danken weefsel autofluorescence en fluorescentie verstrooiing effecten, rendering diepere weefsels niet detecteerbaar53,54beperkt. Een twee-foton microscoop met hogere gevoeligheid dan een traditionele confocal microscoop is geschikt voor het oplossen van dergelijke problemen omdat de nabij-infrarood straling in twee-foton excitatie met aanzienlijk minder absorptie door biologische monsters dan UV gebruikt of blauw-groen licht maakt de techniek meer geschikt voor dikke specimens55,56,,57imaging. Long-koloniseren tumorcellen worden geteld door gemiddeld tumor cel nummers in verschillende representatieve confocal beelden, die neem niet het hele getal van Long-koloniseren tumorcellen in de hele longen van een afzonderlijk dier. Om te kwantificeren van de hele longen in de Long kolonisatie testen, tumorcellen stabiel transfected met luciferase kon worden ingezet en de perfused longen kunnen dan onderhevig zijn aan IVIS imaging na intraveneuze inoculatie van zwevende tumorcellen in aanwezigheid van Luciferine46,58,59. U kunt ook kon de perfused longen worden in stukken gehakt en onderworpen aan enzymatische spijsvertering met proteasen, bijvoorbeeld, collagenase, vrijgeven van afzonderlijke cellen in schorsing60,61. De tumor cellen met fluorescentie kleurstoffen of stabiel transfected met fluorescentie eiwitten kunnen vervolgens worden gekwantificeerd met fluorescentie-activated cell sorting (FACS) analyse56,62.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Dr. Ming-Min Chang en Ms. Ya-Hsin Cheng voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door het ministerie van wetenschap en de technologie van Taiwan (meeste-103-2325-B-006-009, meeste-104-2325-B-006-001, meeste-105-2325-B-006-001 en MOST-106-2320-B-006-068-MY3) en het ministerie van volksgezondheid en welzijn (MOHW106-TDU-B-211-144004). Wij zijn ook dankbaar voor de steun van het onderzoekslaboratorium van de kern van de College of Medicine, National Cheng Kung University, voor hun multi foton confocal microscoop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-9048-46-8 | |
| Bouin's Fluid | MCC(medical chemical corporation)/POISON | 456-A-1GL | |
| CFSE Proliferation Dye | ebiosciences | 65-0850-85 | Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 12100-061 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-6381-92-6 | For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) |
| Fetal bovine serum (FBS) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 10437-028 | |
| Lewis lung carcinoma (LLC) | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-1642 | |
| L-Glutamine, USP | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 21051-024 | |
| Potassium chloride (KCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7447-40-7 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM ) |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7778-77-0 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM ) |
| Sodium chloride (NaCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7647-14-5 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM ) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-10039-32-4 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM ) |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T6146 | 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T4799 | For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L ) |
| Zoletil 50 | Virbac | To dilute with 1X PBS | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Compact Tabletop Centrifuge 2420 | KUBOTA Co. | 2420 | |
| Culture dish (6cm) | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 705001 | |
| Disposable syringe (with needle) | Perfect Medical Industry Co. | 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml | |
| End over end mixer | C.T.I YOUNG CHENN | TS-20 | For suspended cells recovery |
| FACSCalibur (FACS) | BD biosciences | ||
| Forceps | Dimeda | 10.102.14 | |
| Forma Direct Heat CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc. | HEPA CLASS 100 | |
| Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) | Stoelting | 51338 | |
| Multiphoton Confocal Microscope BX61WI | Olympus | FV1000MPE | |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld-Superior | 640010 | |
| Surgical scissor | Dimeda | 08.370.11 | |
| Surgical sutures | UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. | NO. 0034 | Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0) |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | |
| 15 mL Greiner tube | Greiner bio-one | 188271 |
References
- Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A.
- Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells - mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
- Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687 (2017).
- Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
- Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
- Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44 (2016).
- Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
- Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
- Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
- Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680 (2016).
- van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
- Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
- Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
- von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
- Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
- Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
- Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
- Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72 (2017).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
- Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
- Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162 (2012).
- Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
- Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
- Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344 (2017).
- Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152 (2016).
- Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555 (2016).
- Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
- Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W.
- Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30 (2014).
- Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
- Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678 (2015).
- Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
- Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
- Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
- Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796 (2015).
- Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
- Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
- Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
- Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
- Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
- Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
- Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18 (2012).
