Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Etablering af en lunge kolonisering Assay for Cirkulerende Tumor Cell visualisering i lungevæv

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/56761
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1, 1, 3, 1,2
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Trauma Office, Children's National Health System

Summary

En dyremodel er nødvendig for at dechifrere rollen af cirkulerende tumorceller (CTCs) for at fremme lunge kolonisering under kræft metastaser. Her, vi etableret og med held udført en i vivo assay specifikt prøve kravet om polymere fibronektin (polyFN) forsamling på CTCs for lunge kolonisering.

Abstract

Metastaser er den største årsag til kræftdødsfald. Rolle af cirkulerende tumorceller (CTCs) for at fremme kræft metastaser, hvor lunge kolonisering af CTCs kritisk bidrager til tidlig lunge metastatiske processer, har undersøgt voldsomt. Dyremodeller er den eneste tilgang, der fanger fuld systemisk processen af metastase. Betragtning af, at der opstår problemer i tidligere eksperimentelle design for behandlingen af CTCs bidrag til blodkar ekstravasation, vi etableret en i vivo lunge kolonisering analyse, hvor en lang sigt fluorescens celle-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), blev brugt til at mærke suspenderede tumorceller og lunge perfusion blev udført for at fjerne ikke-specifikt fangne CTCs forud for lunge fjernelse, Konfokal imaging og kvantificering. Polymere fibronektin (polyFN) samlet på CTC overflader er blevet fundet for at mægle lunge kolonisering i den endelige etablering af metastatisk tumor væv. Her, at udtrykkeligt teste kravet om polyFN montage på CTCs til lungen kolonisere og ekstravasation, vi udførte kort sigt lunge kolonisering assays hvor suspenderet Lewis lunge cancer celler (LLCs) stabilt udtrykker FN-shRNA (shFN) eller scramble-shRNA (shScr) og forud mærket med 20 μM af CFSE var intravenøst inokuleres i C57BL/6 mus. Vi vist at shFN LLC celler evner at kolonisere mus lungerne blev betydeligt formindsket i forhold til shScr LLC celler. Derfor, denne kortsigtede metode kan anvendes bredt til at specifikt demonstrere evne til CTCs inden for cirkulationen at kolonisere lungerne.

Introduction

Metastaser er den største årsag til kræft død1,2. Tumorceller, der stammer fra primære væv Angiv cirkulation i suspension og overleve forskellige hæmatogen udfordringer, f.eks., anoikis, immun angreb og skader som følge af shear stress fra blodtryk eller geometriske begrænsninger, før de er stand til at kolonisere fjerntliggende organer, et vigtigt skridt dikterer succes af metastaser3,4,5,6. Derfor, der i øjeblikket har gjort energisk indsats i kendetegner cirkulerende tumorceller (CTCs) og korrelerede disse egenskaber med tumor malignitet, metastaser og overlevelsesprocenten af kræft patienter7,8 , 9. da processen med kræft metastaser skildrer specifikt hændelsen i vivo , dyremodeller er den eneste tilgang, der fanger fuld systemisk processen af metastase10,11,12 .

CTCs blive metastatisk tumor væv gennem flere cellulære begivenheder herunder kolonisering af fjerntliggende organer1,2. De mest almindeligt anvendte metastase assays13,14,15 giver dog ikke en måde at observere CTC kolonisering af fjerntliggende organer. Derfor, en i vivo assay design for CTC kolonisering visualisering er bydende nødvendigt. Selv om flere i vivo og ex vivo kort fortsat sigt lunge kolonisering assays er blevet designet, problemer og ulemper. For eksempel, mens grøn fluorescens protein (NGL)-overekspression tumor celler har været anvendt i disse undersøgelser,22,23, det tager tid at stabilt transfect og klone tumorceller med tilstrækkeligt normal god landbrugspraksis fluorescerende intensitet under mikroskop. Ligeledes, selv om forbigående farvning af tumorceller med lang sigt celle tracer CFSE har været ansat til at erstatte tumorceller udtryk for normal god landbrugspraksis, det stadig vanskeligt at vurdere, om CFSE-mærket tumorceller er knyttet eller blot til stede inden for den Vaskulaturen af skåret fjerntliggende organer16,17.

Polymere fibronektin (polyFN) samles på overfladen af CTCs er blevet fundet at kritisk bidrage til den endelige etablering af metastatisk tumor væv18,19,20,21,22 . Her, udførte vi kort sigt lunge kolonisering assays i hvilke suspenderede Lewis lunge karcinom celler (LLCs) stabilt udtryk for FN-shRNA (shFN) eller scramble-shRNA (shScr) og forud mærket med CFSE var intravenøst inokuleres i C57BL/6 mus. Efter 2-3 dage, var musen lungerne først perfunderet med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) hen til helt ophæve løstliggende CTCs inden for Vaskulaturen før udsættes til Konfokal mikroskopi og kvantificering af lunge-koloniserer LLCs. Vi viste klart, at antallet af lunge-koloniserer shFN LLCs og tumor knuder blev reduceret betydeligt i forhold til shScr LLCs, væsentligt bekræfter polyFN forsamling på CTCs rolle i at lette kolonisering og vækst af CTCs i den lungerne. Vores undersøgelse berettiger yderligere undersøgelse for rollen af polyFN i kræft metastaser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg på mus blev udført efter retningslinjerne i vores Institut (vejledning i pleje og brugen af forsøgsdyr, NCKU Medical College).

1. forberedelse af instrumenter, dyrkningsmedier og retter

  1. Før du starter de eksperimentelle protokoller, få steril kirurgiske suturer, 1 mL sprøjter med 26G/0,5 cm nål (til hale vene injektion), 3 mL sprøjter med 24G/3 cm nål (for lunge perfusion), Dulbeccos modificerede Eagle medier (DMEM), trypsin-EDTA-oploesning (5 g/L trypsin og 0,53 mM), føtal bovint serum (FBS), 1 x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PHO4og 1,8 mM KH2PO4) og 6 cm kultur retter.

2. forberedelse og inddrivelse af tumorceller i Suspension

  1. Forberede sterile Dulbecco ændret Eagle medier (DMEM) som indeholder 10% eller 20% FBS og frisk tilføje 2 mM L-glutamin, 1 x PBS og 0,05% Trypsin-EDTA.
  2. Kultur celler i DMEM suppleret med 10% FBS ved 37 ° C og dyrke dem, indtil der er 70-80% sammenløbet kultur parabol.
  3. Fjern kultur medier (DMEM) fra retter, efterfulgt af to skylninger med 2 mL sterilt 1 x PBS.
  4. Der tilsættes 1 mL 0,05% Trypsin-EDTA i skålene grundigt dækker alle celler. Straks fjerne 800 μL af løsning og efterlade kun 200 μl i opvasken. Inkuber retter ved 37 ° C i 30 s til 1 min. (afhængig af celletype) og vente, indtil fleste celler er afbrudt.
  5. Der tilsættes 1 mL af friske DMEM indeholdende 10% FBS direkte ind i retter til at stoppe den enzymatiske aktivitet af trypsin og energisk afpipetteres cellesuspension op og ned med en 1000 µL pipette til at forberede en enkelt cellesuspension.
  6. Overføre cellerne fra skålen til en 1,5 mL microcentrifuge rør, og spin ned cellerne ved stuetemperatur på 162 x g i 3 min.
  7. Opsug supernatanten og resuspend tumor celler i 1,5 mL DMEM, indeholdende 20% FBS og slut over rotere celler i suspension ved 37 ° C i 2 timer.
    Bemærk: Hvis mediet bliver gul under genopretning, udveksle gamle medium med friske medium indeholdende 20% FBS.

3. fluorescens farvning og analyse af tumorceller i Suspension med Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

  1. Efter celle opsving i suspension, tælle de relevante levedygtige celle numre med Trypan blå i en Neubauer tælle kammer for tilsætningen fluorescens farvning doser og til hale vene injektion.
  2. Spin ned celler på 162 x g ved stuetemperatur i 3 min og resuspend pelleted cellerne i 1 mL steriliseret 1 x PBS, efterfulgt af stuetemperatur centrifugering ved 162 x g i 3 min.
  3. Resuspend pelleted cellerne i 500 µL 1 X PBS, som indeholder 10% FBS og 0, 5, 10, 20 eller 40 µM CFSE for dosis titreres, og Inkuber cellesuspension på 37 oC i 10 min. i mørke.
  4. Spin ned celler på 162 x g ved stuetemperatur i 3 min og resuspend pelleted cellerne med 4 mL af DMEM indeholdende 1% FBS. Gentag trinnet vask tre flere gange. Resuspend pelleted cellerne med 4 mL af DMEM alene for den sidste vask.
  5. Emne CFSE-mærket celler til fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) analyse for at kvantificere fluorescens-intensiteten af en enkelt celle, eller hale vene injektion.
    Bemærk: Hold celler på is inden du udfører de FACS analyse eller hale vene injektioner.

4. lunge kolonisering Assay

  1. Forberede de celler, der er mærket med 20 µM CFSE (Se trin 3.1 gennem 3.4).
    Bemærk: Beslutte arbejde dosis af CFSE for mærkning tumorceller, baseret på titrering resultaterne fra FACS-analyse (Se trin 3.3).
  2. Varm op haler af 4-6 ugers-gamle mandlige C57BL/6 mus (6 mus) med en metalhalogenlamper lampe til 5-10 min mus af musen for at spile mus hale årerne.
  3. Grundigt mix og Opsug CFSE-mærket tumorceller med en 1 mL (26Gx1/2) sprøjte, undgå enhver bobler i cellesuspension (med en afsluttende celle tæthed af 5 x 106 celler/mL).
  4. Omhyggeligt indsprøjtes 1 x106 CFSE-mærket tumorceller i 200 µL af DMEM i mus hale vene, som skal indgives i en mus Tilbageholderen.
    Bemærk: Under injektion, hvis nålen placeres direkte i lumen af hale vene, tumorceller skal nemt leveres i omløb uden at behøve at presse hårdt på sprøjten. Hvis det er svært at skubbe tumorceller gennem, har de højst sandsynligt blevet sprøjtes uden for venen hale ind det subkutane rum.
  5. Opdele musene, som intravenøst modtog CFSE-mærket tumorcellerne i to grupper: en gruppe vil gennemgå lunge perfusion efterfulgt af Konfokal mikroskopi og ImageJ kvantificering i lunge kolonisering analysen og den anden vil blive ladt alene for 4-5 uger i lang sigt lunge kolonisering assay.
  6. På 20, 38 eller 45 h og med 1 x 106 tumorceller injiceres intravenøst under en gang kursus - og dosisafhængig titrering bedøver tumor-bærende mus med 50-75 mg/kg zoletil 50, hvilket er et godt anerkendte og ordentlig anesthetizer23.
    Bemærk: Brug vet salve på den mus øjne til at forhindre tørhed under anæstesi.
  7. På langs skæres hud og subkutane væv fra maven til brystet området med kirurgisk saks. Åbn den pleural hulrum med kirurgisk saks og pincet til fuldt udsætte hjerte og lunger.
    Bemærk: Være omhyggelig med at undgå afskære blodkar.
  8. Binde den overlegne vena cava (SVC) og ringere vena cava (IVC) med steril kirurgiske suturer at forhindre tilbagestrømning af perfusion løsning under lunge perfusion.
  9. Skære den venstre ventrikel væg med kirurgisk saks til at åbne en revne (ca 2-4 mm) for at dræne perfusion løsning fra lungerne.
  10. Indsprøjte 1 x PBS i højre hjertekammer med en 3 mL sprøjte og fjerne den drænede løsning med konstant sug under lunge perfusion indtil lungerne igen fra en rødlig farve til helt blege.

5. Konfokal mikroskopisk billeddannelse og analyse af lunge-koloniserede tumorceller

  1. Fjern nu-bleg lungerne fra den pleural hulrum og adskille de fem lapper ved at skære væk luftrøret og bindevæv ledbåndene med kirurgisk saks og pincet24.
  2. Forberede en båre-lignende lunge holder som vist i figur 3B af snoede en nylon sutur omkring to metal stænger til at producere en reticulate tekstur med et mellemrum mellem to stængerne til placering af lunge fliger. Indstille lunge indehaveren i en 6 cm parabol.
    Bemærk: Lunge indehaveren skal bruges til at stabilisere lunge lapper nedenunder mål linse af en Konfokal mikroskop.
  3. Indgive og løse lunge lapper på reticulate teksturen af indehaveren af lunge. Dække og fugte lunge lapper med 1 x PBS.
  4. Emne 6-cm kultur parabol husly lunge lapper på lunge indehaveren til Konfokal mikroskopi til fange fluorescens billeder optagelse lunge-koloniserer tumorceller.
  5. For billeddannelse, bruge målet linser (5 X, MPLN, NA: 0,1, WD: 20, luft).
  6. Rotere filteret hjulet til NIBA (excitation/emission; 470-495 nm/510-550 nm) og bruge en 488 nm laser til at ophidse CFSE, klart visualisere billeder af fluorescens prikker i lunge fliger.
  7. Rotere filteret hjulet til R690 (for MaiTai HP DeepSee laser) til at scanne med 2.0 µs/pixel scanning hastighed og optimere de HV, gevinst og offset niveauer.
  8. Fange fluorescens billeder (512 x 512 pixel) ved hjælp af mikroskop software med en 10 µs/pixel scanningshastighed.
  9. Kvantificere og analysere statistisk de mikroskopiske billeder ved hjælp af ImageJ og GraphPad software som tidligere beskrevet21.

6. langsigtede lunge kolonisering assays

Bemærk: Gentag trin 4.1 gennem 4.5.

  1. Ofre musene efter tumor celle podning for 4-5 uger og fastsætte deres lunger med Bouins flydende25 for 1 til 2 dage.
  2. Kvantificere og analysere statistisk tumor knuder fra musene lungerne med software21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Inden du udfører i vivo lunge kolonisering assay som illustreret i figur 1A til at teste, om polyFN om suspenderede tumorceller medierer lunge kolonisering og/eller ekstravasation lette metastase, titreres vi først forskellige koncentrationer af CFSE, en fluorescerende stof, der er celle gennemtrængelige og kovalent konjugater intracellulære Amin-holdige molekyler26,27 i suspenderede tumorceller og forbliver i cellerne i en lang periode. Vi fandt at tumor celler var effektivt mærket med CFSE i en dosisafhængig måde, som illustreret i figur 1B. CFSE-mærkning i 6 x105 LLC celler/mL næsten nået et plateau på 20 µM som illustreret i figur 1 c.

På grund af de rigelige indsnævret kapillar system, som fysisk kan hindre flow af CTCs i den lunge Vaskulaturen, udførte vi Lungeceller perfusion i mus forsynet med intravenøst injiceres CFSE-mærket LLC for at rydde ikke-specifikt fangne CTCs, som illustreret i figur 1A forud for lunge fjernelse på hvert tidspunkt som afbilledet i figur 4. Før perfusion, lungerne blev klart rødlige på grund af tilstedeværelsen af blod, som illustreret i de venstre panel i figur 2. Lungerne blev bleg efter perfusion med 10-15 mL 1 x PBS, som illustreret i det højre panel i figur 2.

Umiddelbart efter perfunderet mus lungerne blev fjernet fra pleural rummet, var lunge kamre adskilt og monteret på lunge indehaveren placeret i retter som illustreret i figur 3A med 1 x PBS grundigt dækker lunge fliger. Lunge lapper monteret på lunge indehaveren som illustreret i figur 3B blev udsat for Konfokal Fluorescens mikroskopi som illustreret i figur 3A. CFSE-mærket tumorceller koloniserer lungerne blev afbildet som illustreret i de øverste panel af figur 3 c og forvandlet til sort-hvide billeder som illustreret i de nederste panel af figur 3 c lette kvantificering af lunge kolonisering med billede Jørgensen software.

Vi injiceres intravenøst enten shScr eller shFN LLC celler, der var mærket med 20 µM CFSE og ventede på et tidsforløb fra 24-72 h før du udfører lunge perfusions og konfokal mikroskopisk billeddannelse. Kvantificering af lunge-koloniserer tumor celler i 6 mus som illustreret i figur 4A med ImageJ software afslørede at betydeligt færre shFN LLC celler end shScr LLC celler blev talt på 38 h og 45 h tidspunkter, som illustreret i figur 4B . Grunden til, hvorfor antallet af både lunge-koloniserede shScr og shFN LLC celler gradvist faldet var meget sandsynlig på grund af den kontinuerlige cytotoksicitet udøves af den omsætning immunitet selv mod de allerede koloniseret LLC celler. Helt, disse resultater tyder på, at polyFN samlet på CTCs er faktisk kræves i mægle lunge kolonisering af LLC celler, fører til komplet metastaser i lungerne, som fremgår af resultaterne i hvilke nogle mus intravenøst modtager delprøver af den CFSE-mærket shScr og shFN LLC celler for lunge kolonisering assays som illustreret i figur 4 blev efterladt aloneuntil lunge tumor knuder blev udviklet i eksperimentel tumor metastaser assay som illustreret i figur 5A og 5B.

Figure 1
Figur 1: titreringen af CFSE koncentrationer for mærkning tumorceller i lunge kolonisering assay. (A) skematisk illustration af procedurerne for lunge kolonisering assay og eksperimenterende metastase analyse som beskrevet i afsnittet protokoller. (B) FACS analyse for CFSE fluorescens intensiteter af LLC celler, der var farvet med forskellige koncentrationer af CFSE. (C) fluorescens intensiteter blev afbildet som funktion af forskellige CFSE koncentrationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: lungerne før og efter perfusion. Repræsentative billeder af lungerne før (unperfused; Unperf.) og efter (perfunderet; Perf.) udfører lunge perfusion. Gold star: hjerte. Hvid pil: slips, der lukkede IVC/SVC. Røde pile: lunger af samme musen før og efter perfusion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: montering af perfunderet lunge lapper på lunge indehaveren til fluorescens Konfokal mikroskopi. (A) ordningen af lunge-montering på lunge holderen til den Konfokal mikroskopi. (B) et repræsentativt billede af 3 perfunderet lunge lapper på indehaveren af lunge. (C) repræsentative billeder af lunge-koloniserer LLC celler med CFSE fluorescens for kvantificering af billedet J software. Øverste panel: regelmæssig imaging. Nederste panel: vendt sort-hvide billeddannelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: tid kursus imaging, kvantificering og statistisk analyse for lungerne koloniseret shScr og shFN LLC celler efter lunge perfusion i lunge kolonisering assay. (A) repræsentative sort-hvide billeder (konverteret fra fluorescens billeder) af shScr og shFN LLC celler, der blev koloniseret i lunge Vaskulaturen på forskellige tidspunkter, som afbildet efter omfattende lunge perfusion. Stiplede linjer angiver kanten af områderne i fokus Konfokal lunge væv. (B) kvantificering og statistisk analyse for lunge-koloniserer LLC celler som visualiseret i (A) af gennemsnit 5 absolut repræsentative billeder/lunge lap/mus. Bemærk: Hver søjle angiver gennemsnit fluorescens-intensiteten af hvert i-fokus Konfokal område. Data blev statistisk analyseret fra 6 mus og rapporteret som betyder ± SD; n.s. betyder ubetydelige; * betyder p < 0,05; og ** betyder p < 0,01; To-vejs ANOVA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Silencing FN udtryk i CFSE-mærket LLC celler mindsker tumor knuder i lungerne på lang sigt i vivo CTC kolonisering assay. (A) Bouin væske-fast mus lungerne forsynet med tumor knuder stammer fra CFSE-mærket shScr eller shFN LLC celler. (B) kvantificering og statistisk analyse for tumor knuder i lungerne. Data rapporteres som betyder ± SD; : p < 0,001; n = 6 pr. gruppe; Uparret t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammen med lang sigt lunge kolonisering assays, kortsigtede metode vi ansat her for at evaluere på vivo lunge kolonisering af CTCs i fjerntliggende organer klart afsløret og differentieret polyFN samlet på CTCs i koloniserer specifikke rolle lungerne, som derefter førte til ekstravasation og metastatiske processer18,19,20,21. Selv om mærkning celler med lang sigt celle tracker CFSE tillod os at spore de intravenøst indplantede CTCs i op til tre dage før lunge perfusion og fastholde tilstrækkelige grønne fluorescens til kvantitative formål, var det umuligt at afgøre, direkte om tumorcellerne var placeret inden for fartøjet lumen eller havde allerede behovet fra blodkarrene. For at løse dette problem, rødt fluorescerende kan rodamin-konjugeret dextran, som er i stand til ikke-specifikt binder sig til lektiner udtrykt på endothelia bruges til at mærke lunge Vaskulaturen under lunge perfusion28,29, 30. trods det faktum, at CFSE er en langsigtet celle tracker, fluorescens intensiteten er halveret hver celledeling27, begrænser mulighederne for at bruge det i mærkningen teknikker. For at omgå dette problem, bør det fastslås, at den mærkning dosering af CFSE er tilstrækkeligt for celler, der fortsat kan påvises for hele varigheden af in vivo forsøg og at enhver behandling anvendt på cellerne har ingen effekt på celle spredning. Fordi sammenligningen og kvantificering af lunge-koloniserer shScr og shFN CTCs blev gjort i separate mus, kan det hævdes, at forskellene mellem de to grupper var på grund af individuel variation. For at udelukke sådanne variation, kan en blanding af to typer af tumor celler mærket med særskilte fluorescerer farvestoffer (f.eks. CFSE/CM-diI) eller stabilt transfekteret med normal god landbrugspraksis/dsRed samtidig intravenøst injiceres i de samme dyr i lunge kolonisering analysen31,32,33. Det er værd at bemærke, at kloning virkninger som følge af cellen kloning teknologi, der er forsøgt at sortere stabilt fluorescerende proteiner-transfekteret celle kloner med tilstrækkelig stærk fluorescens34,35, 36 , 37 kan gøre de klonede celler repræsentative til at repræsentere hele heterogene befolkninger38,39,40. Hvis en stabil Transfektion af enhver fluorescerende proteiner i tumorceller ønskes for lunge kolonisering assays, bør Højdeindstillelige Transfektion effektiviteten af tumorcellerne som helhed bedre bevare de oprindelige egenskaber end kloning cellen populationer med tilstrækkelig fluorescens41,42.

Lunge perfusion trin i lunge kolonisering assays er nødvendige i, at visse intravenøst indplantede tumorceller, i stedet for specielt arrestere lunge kapillar system, har tendens til at være mekanisk fanget og fastklemt i de kapillære netværk af lunge væv på grund af CTCs gennemsnitligt større diameter end bredden af lunge kapillær lumen43,44. Kvantificering af de lunge-koloniserer tumorceller uden perfusing i lungerne kan resultere i en overvurdering af fejlagtigt tælle mekanisk fastklemte celler45,46,47. Selv om lungerne har været perfunderet, stadig flere problemer. For eksempel, er det stadig vanskeligt at skelne de lunge-koloniserer tumorceller er placeret på de lumenal endothelia eller har allerede behovet fra blodkarrene. Du kan løse dette problem ved farvning blodkar med rodamin-konjugeret dextran som ovennævnte kan være nyttig30,48,49. Alternativt, hvis kvantificering af tumor ekstravasation ønskes, calcium-chelator EDTA/EGTA eller trypsin, en ikke-specifik protease, kan bruges i perfusion buffer til at hindre calcium-afhængig og -uafhængig tumor celle vedhæftning begivenheder50 , 51 , 52. således tumorceller tilbage i lungevæv kan betragtes som behovet.

Til kvantificering af tumorceller lunge-koloniserer, er perfused lungerne ofte udsat for traditionelle Konfokal mikroskopi. Målelighed af væv dybde er dog begrænset til væv autofluorescence og fluorescens spredning effekter, rendering dybere væv målbart53,54. To photon mikroskop med højere følsomhed end en traditionel Konfokal mikroskop er egnet til at løse sådanne problemer i den nær-infrarød stråling anvendes i to-foton excitation med betydeligt mindre absorption af biologiske prøver end UV eller blå-grønt lys gør teknikken mere egnet til imaging tyk prøver55,56,57. Lunge-koloniserer tumorceller tælles efter gennemsnit tumor celle numre i flere repræsentative Konfokal billeder, der ikke omfatter hele antallet af lunge-koloniserer tumorceller i hele lungerne af enkelte dyr. For at kvantificere de hele lungerne i lunge kolonisering assays, tumorceller stabilt transfekteret med luciferase kunne være ansat og perfused lungerne kunne derefter underkastes IVIS imaging efter intravenøs podning af suspenderede tumorceller i luciferin46,58,59. Alternativt kan perfused lungerne hakket i stykker og underkastes Enzymatisk nedbrydning med proteaser, fx, collagenase, frigiver enkelt celler i suspension60,61. Tumor celler med fluorescens farvestoffer eller transfekteret stabilt med fluorescens proteiner kan derefter kvantificeres med fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) analyse56,62.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Ming-Min Chang og Ms. Ya-Hsin Cheng for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af Taiwans ministerium for videnskab og teknologi (de fleste-103-2325-B-006-009, de fleste-104-2325-B-006-001, de fleste-105-2325-B-006-001, og MOST-106-2320-B-006-068-MY3) og ministeriet for sundhed og velfærd (MOHW106-TDU-B-211-144004). Vi er også taknemmelige for støtten fra Core Research Laboratory af College of Medicine, National Cheng Kung University, for deres multi photon Konfokal mikroskop.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Bovine Serum Albumin (BSA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-9048-46-8
Bouin's Fluid MCC(medical chemical corporation)/POISON 456-A-1GL
CFSE Proliferation Dye ebiosciences 65-0850-85 Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)  (Gibco)ThermoFisher Scientific 12100-061
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-6381-92-6 For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) 
Fetal bovine serum (FBS) (Gibco)ThermoFisher Scientific 10437-028
Lewis lung carcinoma (LLC) ATCC, Manassas, VA, USA CRL-1642
L-Glutamine, USP  (Gibco)ThermoFisher Scientific 21051-024
Potassium chloride (KCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7447-40-7 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM )
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7778-77-0 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM )
Sodium chloride (NaCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7647-14-5 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM )
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-10039-32-4 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM )
Trypan Blue Sigma Aldrich T6146 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS
Trypsin Sigma Aldrich T4799 For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L )
Zoletil 50 Virbac To dilute with 1X PBS 
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Compact Tabletop Centrifuge 2420 KUBOTA Co. 2420
Culture dish (6cm) Wuxi NEST Biotechnology Co. 705001
Disposable syringe (with needle) Perfect Medical Industry Co. 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml
End over end mixer C.T.I YOUNG CHENN TS-20 For suspended cells recovery 
FACSCalibur (FACS) BD biosciences
Forceps Dimeda 10.102.14
Forma Direct Heat CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Inc. HEPA CLASS 100
Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) Stoelting 51338
Multiphoton Confocal Microscope BX61WI Olympus FV1000MPE
Neubauer counting chamber Marienfeld-Superior 640010
Surgical scissor Dimeda 08.370.11
Surgical sutures  UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. NO. 0034 Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0)
1.5 mL microcentrifuge tube Wuxi NEST Biotechnology Co. 615001
15 mL Greiner tube Greiner bio-one 188271

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells - mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
  4. Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  5. Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687 (2017).
  6. Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
  7. Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  8. Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44 (2016).
  9. Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
  10. Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
  11. Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
  12. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680 (2016).
  13. van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
  14. Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
  15. Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
  16. von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
  17. Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
  18. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
  19. Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
  20. Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
  21. Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72 (2017).
  22. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
  23. Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
  24. Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162 (2012).
  25. Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
  26. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  27. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  28. Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
  29. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  30. Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
  31. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
  32. Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344 (2017).
  33. Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152 (2016).
  34. Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555 (2016).
  35. Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
  36. Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
  37. Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  38. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  39. Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
  40. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  41. Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
  42. Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
  43. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  44. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  45. Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30 (2014).
  46. Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
  47. Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678 (2015).
  48. Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
  49. Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
  50. Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
  51. Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796 (2015).
  52. Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
  53. Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
  54. Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
  55. Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
  56. Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
  57. Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
  58. Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
  59. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  60. Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
  61. Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
  62. Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18 (2012).

Tags

Kræftforskning sag 136 metastase lunge kolonisering Assays lunge Perfusion cirkulerende tumorceller Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester polymere fibronektin ekstravasation
Etablering af en lunge kolonisering Assay for Cirkulerende Tumor Cell visualisering i lungevæv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, T. C., Liao, Y. C., Chang, W.… More

Lin, T. C., Liao, Y. C., Chang, W. T., Yang, C. H., Cheng, L. H., Cheng, M., Cheng, H. C. The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues. J. Vis. Exp. (136), e56761, doi:10.3791/56761 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter