Summary
Un modello animale è necessario per decifrare il ruolo di fare circolare le cellule del tumore (CTCs) nel promuovere la colonizzazione del polmone durante la metastasi del cancro. Qui, abbiamo stabilito ed effettuato con successo un in vivo analisi specificamente prova il requisito dell'Assemblea polimerici fibronectina (polyFN) su CTCs per colonizzazione del polmone.
Abstract
La metastasi è la principale causa di morte per cancro. Il ruolo di fare circolare le cellule del tumore (CTCs) nel promuovere la metastasi del cancro, in cui la colonizzazione del polmone da CTCs criticamente contribuisce ai primi processi metastatici del polmone, è stato studiato vigorosamente. Come tale, modelli animali sono l'unico approccio che cattura il processo completo sistemico della metastasi. Dato che i problemi si verificano a precedenti progetti sperimentali per l'esame i contributi di CTCs allo stravaso del vaso sanguigno, abbiamo stabilito un dosaggio di colonizzazione del polmone in vivo in cui un lungo-termine-fluorescenza cellulare-elemento tracciante, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), è stato utilizzato per marcare le cellule del tumore sospesi e perfusione polmonare è stato effettuato per deselezionare non specifico intrappolati CTCs prima della rimozione del polmone, imaging confocale e quantificazione. Polimerica fibronectina (polyFN) montata su superfici CTC è stata trovata per mediare la colonizzazione del polmone nello stabilimento finale dei tessuti del tumore metastatico. Qui, per verificare in particolare il requisito dell'Assemblea polyFN su CTCs per colonizzazione del polmone e dello stravaso, abbiamo effettuato brevi saggi di colonizzazione del polmone in cui sospensione di cellule di carcinoma del polmone di Lewis (LLC) che esprimono FN-shRNA (shFN) o Scramble-shRNA (shScr) e pre-etichettata con 20 μM di CFSE per via endovenosa sono state inoculate in topi C57BL/6. Abbiamo dimostrato con successo che le abilità delle cellule LLC shFN a colonizzare i polmoni del mouse sono state diminuite significativamente rispetto alle cellule LLC di shScr. Pertanto, questa metodologia a breve termine può essere ampiamente applicata per specificamente dimostrare la capacità di CTCs all'interno la circolazione di colonizzare i polmoni.
Introduction
La metastasi è la causa principale di cancro morte1,2. Le cellule tumorali derivate da tessuti primari entrano nella circolazione in sospensione e sopravvivono varie sfide ematogena, ad es., anoikis, immuni assalti e danni dovuti a sollecitazione di taglio da pressione sanguigna o vincoli geometrici, prima che siano in grado di colonizzare organi distanti, un passo fondamentale dettare il successo di metastasi3,4,5,6. Pertanto, attualmente sono stati compiuti sforzi vigorosi nella caratterizzazione di cellule tumorali circolanti (CTC) e la correlazione di queste caratteristiche con malignità del tumore, metastasi e tassi di sopravvivenza del cancro pazienti7,8 , 9. dal momento che il processo della metastasi del cancro in particolare rappresenta un evento in vivo , modelli animali sono l'unico approccio che cattura il processo completo sistemico di metastasi10,11,12 .
CTCs diventano tessuti del tumore metastatico attraverso molteplici eventi cellulari tra cui la colonizzazione di organi distanti1,2. Tuttavia, le metastasi più comunemente utilizzati saggi13,14,15 non forniscono un modo per osservare la colonizzazione di CTC di organi distanti. Pertanto, un progetto di assay in vivo per la visualizzazione di colonizzazione del CTC è urgentemente necessaria. Sebbene diversi in vivo ed ex vivo breve svantaggi, problemi e colonizzazione del polmone di termine sono state progettate le analisi rimangono. Per esempio, mentre la proteina fluorescenza verde (GFP)-overesprimenti tumore le cellule sono state utilizzate in questi saggi22,23, ci vuole tempo per stabile transfect e clonare le cellule del tumore con sufficiente intensità di fluorescenza di GFP sotto il microscopio. Allo stesso modo, anche se transitoria macchiatura delle cellule del tumore con il tracciante di cella di lungo termine CFSE è stata impiegata per sostituire le cellule del tumore che esprimono GFP, rimane difficile giudicare se le cellule del tumore con etichetta CFSE sono allegate o semplicemente presente all'interno del vascolarizzazione del asportato organi distanti16,17.
Polimerica fibronectina (polyFN) montata su superfici di CTCs è stata trovata per contribuire criticamente alla creazione finale di tumore metastatico tessuti18,19,20,21,22 . Qui, abbiamo effettuato brevi saggi di colonizzazione del polmone in cui cellule di carcinoma del polmone (LLC) Lewis sospese stabilmente esprimendo FN-shRNA (shFN) o scramble-shRNA (shScr) e pre-etichettata con CFSE per via endovenosa sono state inoculate in topi C57BL/6. Dopo 2-3 giorni, i polmoni del mouse in primo luogo sono stati irrorati con tamponato fosfato salino (PBS) per rimuovere completamente slegato CTCs all'interno del vasculature prima di essere sottoposto a microscopia confocal e quantificazione di colonizzazione del polmone LLCs. Abbiamo chiaramente dimostrato che i numeri di colonizzazione del polmone shFN LLCs e noduli del tumore sono stati ridotti significativamente in confronto con shScr LLCs, sostanzialmente che confermano il ruolo dell'Assemblea polyFN su CTCs nel facilitare la colonizzazione e la crescita di CTCs nella polmoni. Il nostro studio necessita di ulteriore indagine per il ruolo di polyFN nella metastasi del cancro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti sui topi sono stati eseguiti secondo le linee guida del nostro Istituto (la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, NCKU Medical College).
1. preparazione di strumenti, mezzi di coltura e piatti
- Prima di iniziare i protocolli sperimentali, ottenere le suture chirurgiche sterili, siringhe da 1 mL con ago 26G/0,5 cm (per l'iniezione della vena della coda), 3 mL siringhe con ago 24G/3 cm (per perfusione polmonare), per volta Eagle Media (DMEM di Dulbecco), soluzione di tripsina-EDTA (5 g/L tripsina e 0,53 mM), siero bovino fetale (FBS), 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na2PHO4e 1,8 mM KH2PO4) e piastre di coltura di 6 cm.
2. preparazione e recupero delle cellule del tumore in sospensione
- Preparare per volta Eagle Media (DMEM di Dulbecco sterile) contenente 10% o 20% FBS e aggiungere appena 2 mM L-Glutammina, 1x PBS e 0.05% tripsina-EDTA.
- Coltura le cellule in DMEM supplementato con 10% FBS a 37 ° C e farle crescere fino a quando c'è il 70-80% confluenza nella piastra di coltura.
- Rimuovere il supporto di cultura (DMEM) dai piatti, seguiti da due lavaggi con 2 mL di PBS 1X sterile.
- Aggiungere 1 mL di 0.05% tripsina-EDTA nei piatti per coprire completamente tutte le celle. Immediatamente rimuovere 800 μL di soluzione e lasciare solo 200 μL nei piatti. Incubare le piastre a 37 ° C per 30 s a 1 min (a seconda del tipo di cella) e attendere che la maggioranza delle cellule è in stato di sospensione.
- Aggiungere 1 mL di fresco DMEM contenente 10% FBS direttamente nei piatti per interrompere l'attività enzimatica della tripsina e vigorosamente pipetta la sospensione cellulare su e giù con una pipetta di 1000 µ l per preparare una sospensione di singola cellula.
- Trasferire le cellule dal piatto una microcentrifuga da 1,5 mL e rotazione verso il basso le celle a temperatura ambiente a 162 x g per 3 min.
- Aspirare il supernatante e risospendere le cellule del tumore in 1,5 mL DMEM contenente 20% FBS e over fine ruotare le cellule in sospensione a 37 ° C per 2 h.
Nota: Se il mezzo diventa giallo durante il recupero, scambiare il vecchio mezzo con medium fresco contenente 20% FBS.
3. fluorescenza macchiatura e l'analisi delle cellule del tumore in sospensione con Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)
- Dopo il recupero delle cellule in sospensione, contare il numero di cellule vitali appropriato con Trypan Blue in un Neubauer camera per titolazione fluorescenza macchiatura dosi di conteggio e per coda venosa iniezione.
- Rotazione verso il basso le cellule a 162 x g a temperatura ambiente per 3 min e risospendere che le cellule pellettate in 1 mL di sterilizzato 1X PBS, seguita da centrifugazione di temperatura ambiente a 162 x g per 3 min.
- Risospendere le cellule pellettate in 500 µ l di 1X PBS contenente 10% FBS e 0, 5, 10, 20 o 40 µM CFSE per titolazione della dose e incubare la sospensione cellulare a 37 oC per 10 min al buio.
- Rotazione verso il basso le cellule a 162 x g a temperatura ambiente per 3 min e risospendere le cellule pellettate con 4 mL di DMEM contenente 1% FBS. Ripetere questo passaggio di lavaggio tre volte di più. Risospendere le cellule pellettate con 4 mL di DMEM da solo per il lavaggio finale.
- Le cellule di CFSE-etichettato ad fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento analisi (FACS) per quantificare l'intensità di fluorescenza di una singola cella o iniezione della vena della coda.
Nota: Mantenere le cellule sul ghiaccio prima di eseguire le iniezioni di vena FACS analisi o coda.
4. polmone colonizzazione Assay
- Preparare le cellule identificate con 20 µM CFSE (vedere 3.1 passaggi attraverso 3.4).
Nota: Decidere la dose di lavoro di CFSE per l'etichettatura di cellule del tumore, sulla base dei risultati di titolazione dall'analisi FACS (Vedi punto 3.3). - Scaldare le code di 4-6 settimana-vecchi topi C57BL/6 maschi (6 topi) con una lampada ad alogenuri per 5-10 min su una base di mouse-di-mouse per dilatare le vene di coda di topo.
- Mischiare attentamente ed aspirare le cellule del tumore CFSE-etichettati con una siringa da 1 mL (26Gx1/2), evitando qualsiasi bolle in sospensione delle cellule (con una densità di cella finale di 5 x 106 cellule/mL).
- Attentamente iniettare 1 x106 di cellule tumorali con etichetta CFSE 200 µ l di DMEM nella vena della coda del mouse, che dovrebbe essere presentata in un dispositivo di ritenuta del mouse.
Nota: Durante l'iniezione, se l'ago viene inserito direttamente nel lume della vena della coda, le cellule del tumore dovrebbero essere facilmente consegnate nella circolazione senza la necessità di spingere forte sulla siringa. Se è difficile spingere le cellule del tumore attraverso, esse sono state iniettate molto probabilmente di fuori della vena caudale, nello spazio sottocutaneo. - Dividere i topi che per via endovenosa hanno ricevuto le cellule del tumore con etichetta CFSE in due gruppi: un gruppo subirà perfusione polmonare seguita mediante microscopia confocale e quantificazione di ImageJ nel dosaggio di colonizzazione del polmone e l'altro sarà lasciato da solo per 4-5 analisi di settimane nella colonizzazione del polmone di lungo termine.
- 20, 38 o 45 h e con le cellule del tumore di 1 x 106 iniettate per via endovenosa durante una titolazione del corso - e dose-dipendente di tempo, anestetizzare i topi del tumore-cuscinetto con zoletil 50-75 mg/kg 50, che è un anesthetizer ben accettato e corretto23.
Nota: Unguento uso veterinario sugli occhi di topi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. - Tagliare longitudinalmente la pelle ed i tessuti sottocutanei dall'addome alla regione toracica con forbici chirurgiche. Aprire la cavità pleurica con forbici e pinze per esporre completamente il cuore ed i polmoni.
Nota: Fare attenzione a evitare il taglio dei vasi sanguigni. - Legare la vena cava superiore (SVC) e la vena cava inferiore (IVC) con punti di sutura chirurgici sterili per evitare il riflusso della soluzione di perfusione durante la perfusione polmonare.
- Tagliare la parete del ventricolo di sinistra con forbici chirurgiche per aprire una fessura (circa 2-4 mm) per drenare la soluzione di perfusione dai polmoni.
- Iniettare 1X PBS nel ventricolo di destra con una siringa da 3 mL e rimuovere la soluzione drenata con aspirazione costante durante la perfusione polmonare fino a quando i polmoni girare da un colore rossastro a completamente pallido.
5. confocale Imaging microscopica e l'analisi delle cellule del tumore del polmone-colonizzato
- Rimuovere i polmoni ora-pale dalla cavità pleurica e separare i cinque lobi tagliando via i legamenti trachea e tessuto connettivo con forbici e pinze chirurgiche24.
- Preparare un supporto barella-come polmone come illustrato in Figura 3B avvolgendo una sutura in nylon attorno a due aste metalliche per produrre una struttura reticolata con uno spazio tra le due barre per il posizionamento dei lobi del polmone. Impostare titolare del polmone in un piatto di 6 cm.
Nota: Il titolare del polmone verrà essere utilizzato per stabilizzare i lobi del polmone sotto la lente dell'obiettivo di un microscopio confocale. - Lodge e difficoltà i lobi del polmone sulla trama reticolata del titolare del polmone. Coprire e inumidire i lobi del polmone con 1x PBS.
- Soggetto il piatto di cultura di 6 cm che harboring i lobi del polmone sul titolare del polmone alla microscopia confocale per catturare le immagini di fluorescenza registrazione le cellule del tumore del polmone-colonizzazione.
- Per l'imaging, utilizzare lenti dell'obiettivo (5 X, MPLN, NA: 0.1, WD: 20, aria).
- Girare la manopola del filtro di NIBA (eccitazione/emissione; 470-495 nm/510-550 nm) e utilizzare un laser a 488 nm per eccitare CFSE, chiaramente visualizzare immagini di puntini di fluorescenza nei lobi del polmone.
- Ruotare la ruota portafiltri per R690 (per MaiTai HP Bosumtwi laser) per eseguire la scansione con 2.0 µs/pixel di scansione veloce e ottimizzate l'HV, guadagno e offset livelli.
- Catturare immagini di fluorescenza (512 x 512 pixel) utilizzando il software di microscopio con un 10 µs/pixel velocità di scansione.
- Quantificare e analizzare statisticamente le immagini al microscopio usando ImageJ e GraphPad software come descritto in precedenza21.
6. lungo termine saggi di colonizzazione del polmone
Nota: Ripetere i passaggi da 4.1 a 4.5.
- Sacrificare i topi dopo l'inoculazione delle cellule del tumore per 4-5 settimane e fissare i loro polmoni con liquido di Bouin25 per 1-2 giorni.
- Quantificare e analizzare statisticamente i noduli del tumore dai polmoni di topi con software21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prima dell'esecuzione del saggio di colonizzazione del polmone in vivo come illustrato in Figura 1A per verificare se polyFN sulle cellule del tumore sospensione media la colonizzazione del polmone e/o stravaso nel facilitare la metastasi, abbiamo prima titolato diversi concentrazioni di CFSE, un composto fluorescente che è cellula permeabile e legame covalente coniugati intracellulari contenenti molecole26,27 in cellule del tumore sospesi e rimane nelle cellule per un lungo periodo di tempo. Abbiamo trovato quel tumore cellule efficacemente sono state etichettate con CFSE in maniera dose-dipendente, come illustrato in Figura 1B. Il CFSE-etichettatura in 6 x105 LLC cellule/mL quasi raggiunto un plateau a 20 µM come illustrato in Figura 1.
A causa del sistema capillare ristretto abbondante che potrebbe impedire fisicamente il flusso di CTCs all'interno del vasculature polmonare, abbiamo effettuato il polmone aspersione in topi iniettato per via endovenosa con etichetta CFSE LLC cellule per deselezionare non specifico CTCs intrappolati, come illustrato in Figura 1A prima della rimozione del polmone in ciascun punto di tempo, come illustrato nella Figura 4. Prima di perfusione, i polmoni erano chiaramente rossastri dovuta alla presenza di sangue, come illustrato nella Pannello di sinistra della Figura 2. I polmoni sono diventato pallidi dopo perfusione con 10-15 mL di 1X PBS, come illustrato nel riquadro di destra della Figura 2.
Immediatamente dopo i polmoni irrorato del mouse sono stati rimossi dallo spazio pleurico, i lobi del polmone sono stati separati e montati sul titolare del polmone collocato in piatti come illustrato nella Figura 3A con 1x PBS accuratamente che coprono i lobi del polmone. I lobi del polmone montati sul titolare del polmone come illustrato in Figura 3B sono stati sottoposti a microscopia di fluorescenza confocale come illustrato nella Figura 3A. Le cellule del tumore con etichetta CFSE colonizzando i polmoni erano imaged come illustrato nella Pannello superiore della Figura 3 e trasformate in immagini in bianco e nero, come illustrato nella Pannello inferiore di Figura 3 per facilitare la quantificazione della colonizzazione del polmone con software Image J.
Abbiamo iniettato per via endovenosa o shScr o shFN cellule LLC che sono state etichettate con 20 µM CFSE e abbiamo aspettate per un corso a tempo da 24-72 h prima di eseguire le aspersioni di polmone e imaging al microscopio confocale. Quantificazione del tumore del polmone-colonizzare cellule in 6 topi come illustrato in Figura 4A con software ImageJ ha rivelato che significativamente meno cellule LLC shFN che shScr le cellule LLC sono stati contati al 38H e punti di tempo di 45 h, come illustrato in Figura 4B . Il motivo per cui i numeri di shScr polmone-colonizzato e di cellule LLC shFN diminuite gradualmente erano molto probabilmente dovuto la citotossicità continua esercitata dall'immunità di circolazione anche contro le cellule LLC già colonizzate. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che polyFN montati su CTCs è infatti necessaria nella mediazione della colonizzazione del polmone da cellule LLC, che conduce alla completa metastasi nei polmoni, come rivelato dai risultati in cui alcuni topi per via endovenosa che ricevono le aliquote della Cellule con etichetta CFSE shScr e shFN LLC per i saggi di colonizzazione del polmone come illustrato nella Figura 4 sono state lasciate aloneuntil tumore del polmone noduli sono stati sviluppati nell'analisi della metastasi del tumore sperimentale, come illustrato in Figura 5A e 5B.
Figura 1: titolazione delle concentrazioni CFSE per etichettare le cellule del tumore nell'analisi della colonizzazione del polmone. (A) illustrazione schematica delle procedure per il dosaggio di colonizzazione del polmone ed il dosaggio di metastasi sperimentale come dettagliato nella sezione protocolli. (B) analisi al FACS per le intensità di fluorescenza di CFSE delle cellule LLC che erano macchiate con varie concentrazioni di CFSE. (C) intensità di fluorescenza sono state tracciate come funzioni di varie concentrazioni di CFSE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: polmoni prima e dopo aspersione. Immagini rappresentative dei polmoni prima (unperfused; Unperf.) e dopo (irrorati; Perf.) esecuzione di perfusione polmonare. Stella d'oro: cuore. Freccia bianca: la cravatta che chiuso il IVC/SVC. Frecce rosse: i polmoni del mouse stesso prima e dopo aspersione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: montaggio dei lobi polmonari irrorati sul titolare del polmone per microscopia confocale a fluorescenza. (A) schema del polmone-montaggio del supporto del polmone per la microscopia confocale. (B) un'immagine rappresentativa dei 3 lobi del polmone irrorato il titolare del polmone. (C) immagini rappresentative del polmone-colonizzare le cellule LLC con fluorescenza CFSE per quantificazione da software di Image J. Pannello superiore: regular imaging. Pannello inferiore: invertito la formazione immagine in bianco e nero. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: tempo corso imaging, quantificazione e analisi statistica per il polmone colonizzato le cellule LLC di shScr e shFN dopo perfusione polmonare nell'analisi della colonizzazione del polmone. (A) in bianco e nero immagini rappresentative (convertiti da immagini di fluorescenza) delle cellule LLC di shScr e shFN che sono state colonizzate nel vasculature polmonare a vari tempi come raffigurato dopo perfusione polmonare estesa. Linee tratteggiate indicano il bordo delle zone del tessuto polmonare confocal di messa a fuoco. (B) quantificazione e analisi statistica per le cellule LLC di colonizzazione del polmone come visualizzato in (A) da una media di 5 assoluto rappresentante immagini/polmone lobo/mouse. Nota: Ogni barra indica l'intensità di fluorescenza media di ogni area di confocal di messa a fuoco. I dati erano statisticamente analizzati da 6 topi e segnalati come media ± deviazione standard; n.s. significa non significativa; * significa p < 0,05; e * * significa p < 0.01; ANOVA a due vie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: silenziamento espressione FN in cellule di LLC con etichetta CFSE diminuisce noduli del tumore nei polmoni a lungo termine in vivo analisi di colonizzazione CTC. Polmoni del mouse fluido-fisso di (A) Bouin cuscinetto noduli del tumore derivano dalle cellule di CFSE-etichetta shScr o shFN LLC. (B) quantificazione e analisi statistiche per i noduli del tumore nei polmoni. I dati sono riportati come media ± deviazione standard; : p < 0,001; n = 6 per ogni gruppo; Test t spaiato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Insieme con le analisi colonizzazione polmonare a lungo termine, breve termine metodologia qui abbiamo impiegato per valutare in vivo la colonizzazione del polmone da CTCs in organi distanti chiaramente svelato e differenziato il ruolo specifico di polyFN montato su CTCs nella colonizzazione i polmoni, che poi ha portato alla stravaso e processi metastatici18,19,20,21. Anche se etichettatura cellule con tracker di lungo termine delle cellule CFSE ci ha permesso di rintracciare il CTCs iniettato per via endovenosa fino a tre giorni prima la perfusione polmonare e mantenere sufficiente fluorescenza verde per scopi quantitativi, era impossibile determinare direttamente Se le cellule del tumore sono state situate all'interno del lume del vaso o avevano già extravasated dai vasi sanguigni. Per risolvere questo fluorescenti problema, rosso rodamina-coniugato destrano, che è in grado di non-specificamente legati alle lectine espresse su endoteli può essere usato per etichettare il vasculature polmonare durante del polmone di aspersione28,29, 30. nonostante il fatto che CFSE è un tracker cellulare a lungo termine, l'intensità di fluorescenza è dimezzato ogni divisione cellulare27, limitando la possibilità di usarlo in tecniche di etichettatura. Per aggirare questo problema, deve essere accertato che il dosaggio di etichettatura di CFSE è sufficiente affinchè le cellule rimangono rilevabili per tutta la durata di in vivo esperimenti e che qualsiasi trattamento applicato alle celle non ha alcun effetto sulla cella proliferazione. Perché il confronto e la quantificazione della colonizzazione del polmone shScr e shFN CTCs sono stati fatti in topi separati, si potrebbe sostenere che le differenze tra i due gruppi erano dovuti a variazioni individuali. Per escludere tale variazione, una miscela di due tipi di tumore cellule identificate con la clausola distinct reagiscono in coloranti (ad es., CFSE/CM-diI) o trasfettata stabilmente con GFP/dsRed può essere simultaneamente per via endovenosa iniettata nello stesso animale nella colonizzazione del polmone analisi di31,32,33. Vale la pena notare che clonazione effetti derivanti dalla cella tecnologia che si è tentata di risolvere stabilmente la clonazione delle cellule trasfettate con proteine fluorescenti cloni con sufficientemente forte fluorescenza34,35, 36 , 37 può rendere le cellule clonate non rappresentativi per rappresentare le intere popolazioni eterogenee38,39,40. Volendo una trasfezione stabile di qualsiasi proteina fluorescente nelle cellule del tumore per i saggi di colonizzazione del polmone, elevando l'efficienza di trasfezione delle cellule del tumore nel suo complesso dovrebbe meglio conservare le caratteristiche originarie della clonazione della cella popolazioni con sufficiente fluorescenza41,42.
La perfusione polmonare passi nella colonizzazione del polmone, le analisi sono necessarie in quanto alcune cellule del tumore per via endovenosa iniettato, invece di arrestare specificamente al sistema capillare polmonare, tendono ad essere meccanicamente intrappolati e inceppata all'interno delle reti capillari del polmone tessuti a causa della mediamente più grandi diametri di CTCs rispetto alla larghezza del polmone lumen capillare43,44. Quantificazione delle cellule del tumore del polmone-colonizzazione senza che irrora i polmoni può provocare una sovrastima erroneamente contando le cellule meccanicamente inceppata45,46,47. Anche se i polmoni sono stati irrorati, ulteriori problemi rimangono. Per esempio, è ancora difficile distinguere se le cellule del tumore del polmone-colonizzazione sono situate l'endoteli lumenal o hanno già extravasated dai vasi sanguigni. Per risolvere questo problema, i vasi sanguigni con destrano rodamina-coniugato come sopraccennato di colorazione può essere utile30,48,49. In alternativa, se si desidera la quantificazione di stravaso del tumore, calcio-chelante EDTA/EGTA o tripsina, una proteasi non specifiche, può essere utilizzata nel buffer di aspersione per impedire calcio-dipendente e - indipendenti del tumore delle cellule adesione eventi50 , 51 , 52. così, le cellule del tumore residuo nei tessuti del polmone possono essere considerate come extravasated.
Per la quantificazione delle cellule del tumore del polmone-colonizzazione, i polmoni irrorati sono spesso sottoposti a microscopia confocale tradizionale. Tuttavia, la misurabilità della profondità dei tessuti è limitato dovuto in parte al tessuto autofluorescenza ed effetti di dispersione di fluorescenza, resa più profonda tessuti inosservabile53,54. Un microscopio a due fotoni con maggiore sensibilità rispetto a un tradizionale microscopio confocale è adatto per risolvere tali problemi, in quanto le radiazioni del vicino infrarosso usato nell'eccitazione del due-fotone con significativamente meno assorbimento dai campioni biologici di UV o luce blu-verde rende la tecnica più appropriata per l'imaging di esemplari spessore55,56,57. Le cellule del tumore del polmone-colonizzazione sono contati facendo la media dei numeri delle cellule del tumore in diverse immagini confocal rappresentativi, che non includono l'intero numero di cellule di tumore del polmone-colonizzazione nei polmoni tutto di un singolo animale. Per quantificare i polmoni tutto nei saggi di colonizzazione del polmone, le cellule del tumore trasfettate stabilmente con luciferasi potrebbero essere impiegate e irrorati polmoni potrebbero quindi essere sottoposti a IVIS imaging dopo l'inoculazione endovenosa delle cellule del tumore sospesa in presenza di luciferina46,58,59. In alternativa, i polmoni irrorati potrebbero essere tritati in pezzi e sottoposti a digestione enzimatica con proteasi, ad es., collagenasi, rilasciando singole cellule in sospensione60,61. Il tumore delle cellule con fluorescenza coloranti o trasfettata stabilmente con fluorescenza proteine potrebbero quindi essere quantificate con fluorescenza-attivato delle cellule (FACS) analisi56,62di ordinamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Dr. Ming-Min Chang e MS. Cheng Ya-Hsin per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal Ministero della scienza e della tecnologia di Taiwan (la maggior parte-103-2325-B-006-009, la maggior parte-104-2325-B-006-001, la maggior parte-105-2325-B-006-001 e MOST-106-2320-B-006-068-MY3) e il Ministero della salute e benessere (MOHW106-TDU-B-211-144004). Inoltre siamo grati per il sostegno dal Core Research Laboratory dell'Università di medicina, National Cheng Kung University, per loro multi-fotone al microscopio confocale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-9048-46-8 | |
| Bouin's Fluid | MCC(medical chemical corporation)/POISON | 456-A-1GL | |
| CFSE Proliferation Dye | ebiosciences | 65-0850-85 | Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 12100-061 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-6381-92-6 | For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) |
| Fetal bovine serum (FBS) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 10437-028 | |
| Lewis lung carcinoma (LLC) | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-1642 | |
| L-Glutamine, USP | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 21051-024 | |
| Potassium chloride (KCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7447-40-7 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM ) |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7778-77-0 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM ) |
| Sodium chloride (NaCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7647-14-5 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM ) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-10039-32-4 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM ) |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T6146 | 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T4799 | For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L ) |
| Zoletil 50 | Virbac | To dilute with 1X PBS | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Compact Tabletop Centrifuge 2420 | KUBOTA Co. | 2420 | |
| Culture dish (6cm) | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 705001 | |
| Disposable syringe (with needle) | Perfect Medical Industry Co. | 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml | |
| End over end mixer | C.T.I YOUNG CHENN | TS-20 | For suspended cells recovery |
| FACSCalibur (FACS) | BD biosciences | ||
| Forceps | Dimeda | 10.102.14 | |
| Forma Direct Heat CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc. | HEPA CLASS 100 | |
| Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) | Stoelting | 51338 | |
| Multiphoton Confocal Microscope BX61WI | Olympus | FV1000MPE | |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld-Superior | 640010 | |
| Surgical scissor | Dimeda | 08.370.11 | |
| Surgical sutures | UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. | NO. 0034 | Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0) |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | |
| 15 mL Greiner tube | Greiner bio-one | 188271 |
References
- Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A.
- Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells - mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
- Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687 (2017).
- Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
- Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
- Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44 (2016).
- Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
- Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
- Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
- Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680 (2016).
- van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
- Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
- Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
- von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
- Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
- Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
- Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
- Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72 (2017).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
- Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
- Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162 (2012).
- Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
- Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
- Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344 (2017).
- Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152 (2016).
- Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555 (2016).
- Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
- Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W.
- Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30 (2014).
- Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
- Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678 (2015).
- Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
- Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
- Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
- Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796 (2015).
- Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
- Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
- Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
- Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
- Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
- Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
- Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18 (2012).
