Exponering för miljögifter kan akut påverka utveckling med långsiktiga effekter. Detaljerade protokoll tillhandahålls för att illustrera en strategi med en effektiv lab-modellen för att studera effekten av tidig embryonal exponering för bisfenol A. Vi tillhandahåller fruktsamhet och beteendemässiga analyser att övervaka effektiviteten av våra toxiska exponering bio-analyser.
Bisphenols, såsom bisfenol A (BPA) och bisfenol S (BPS) polymeriserande agenter som ofta används i tillverkningen av plaster och många dagligt använda produkter. Baserat på deras kemiska struktur och estradiol-liknande biologiska egenskaper, har de klassificerats som hormonstörande föreningar (EDC). Långvarig exponering för hormonstörande ämnen, även vid låga doser, har kopplats till olika hälsa defekter inklusive cancer, beteendestörningar och infertilitet, med större sårbarhet indicerat under tidig utvecklingsmässiga perioder. Cellulära och molekylära studier med genetiskt eftertraktansvärda nematoder modellen Caenorhabditis elegans har visat att exponering för BPA orsakar apoptos, embryonal dödlighet och störningar i DNA reparation mekanismer. Vi har tidigare rapporterat att exponering av C. elegans embryon att låga doser av olika bisphenols minskar fruktsamhet. Dessutom har vi visat att effekterna av exponering i mycket tidigt skede av utveckling kvarstår in i vuxenlivet som analyseras av kvantifiera tillvänjning beteende, en form av icke-associativ inlärning. Här, tillhandahåller vi detaljerade protokoll för embryonala exponering för hormonstörande ämnen låg dos samt de associerade fruktsamhet och främre rör tillvänjning analyser, tillsammans med representativa resultat.
Exponering för miljögifter, föreningar särskilt de som tenderar att störa utveckling, har varit under noggrann vetenskaplig granskning under de senaste åren. Mer än tusen kemikalier i dagligt bruk klassificeras som hormonstörande föreningar (EDC)1. Perioder av snabb tillväxt och utveckling, bland annat embryonala, spädbarn och barndom stadier, har noterats för att vara särskilt känsliga för de skadliga effekterna att även låg dos EDC. Deras effekt har visat sig orsaka reproduktiva och nervsystemets sjukdomar2. Per US Environmental Protection Agency och oss National Toxicology Program panel riktlinjerna, kan en låg dos definieras som någon dos under nivån för en som har rapporterats orsaka en observerbar biologisk förändring eller skada3. Förutom låg dos effekter av enskilda hormonstörande ämnen har blandningar av olika hormonstörande ämnen hittades vid låga koncentrationer i miljön potential att orsaka materiella kumulativa effekterna4.
Bisphenol A (BPA eller 4,4′-(propane-2,2-diyl)) är en polymeriserande ämne som återfinns i vanliga föremål såsom vattenflaskor, store kvitton, dental tätningsmedel och foder i dryck och mat burkar5. På grund av dess strukturella likheten till 17-beta östradiol (E2) och dess affinitet till ERα och ERβ östrogenreceptorer, har BPA klassificerats som en hormonstörande kemiska (EDC)5,6. Även om det är svagare, har BPAS affinitet till östrogenreceptorer visat sig påverka systemets reproduktion av båda könen och störa neurala funktioner vid doser som anses säkra7,8. Förändringar i DNA-metylering via epigenetiskt reglerade mekanismer har observerats för att orsaka långsiktiga neurologiska defekter hos möss som utsätts för BPA9. Specifikt, har BPA också varit inblandad som en möjlig skyldige för ökad förekomst av hyperaktivitet, brist på uppmärksamhet och ökad känslighet för läkemedel på grund av en ökning ses hos dopaminreceptorerna D1 i mus limbiska framhjärnan efter kronisk exponering 9 , 10. betydande bevis på de skadliga effekterna av hormonstörande ämnen på människors hälsa bygger på korrelation studier fokuserar främst på kronisk exponering av populationer för miljögifter även vid låga doser5; dock har begränsningar i slutsatser från studier på människa och manipulera experimentella kontroller godkänts samtidigt ta itu med kritiken mot ogrundade hype11,12.
På grund av bevarandet av Caenorhabditis elegans’ gener när det gäller däggdjur, inklusive dess steroid hormon-receptor gener, forskare har utnyttjat denna genetiskt eftertraktansvärda lab-modellen för att riva upp de funktionella och mekanistiska effekterna av hormonstörande ämnen 13. experiment med C. elegans har visat att dessa föreningar såsom BPA och BPS kan orsaka apoptos, embryonal dödlighet, störningar i dubbelsträngat DNA paus reparationsmekanismer och neurala funktion14,15 ,16.
Vårt labb har tidigare visat att även låg dos exponering begränsad till tidig embryogenes leder till sänkt fruktsamhet med beteendemässiga underskott i överlevande vuxna15. Tillvänjning till en upprepad stimulans är en form av icke-associativ inlärning i modellsystem, inklusive C. elegans, och vår metodik använder denna form av icke-associativ inlärning som en beteendevetenskaplig utgång till assay långtidseffekterna av embryonala exponering för de gifter17 specifikt, vi tillhandahåller detaljerade protokoll för att studera BPA exponering på C. elegans, inklusive dess omedelbara effekter på embryonal dödlighet och långsiktiga effekter på vuxna beteende, med en övergripande Schematisk som skildras i Figur 1. Representativa resultat från fruktsamhet och icke-associativ lärande analyser ingår för att belysa effektiviteten i vår metodik.
Faser av snabb tillväxt och utveckling såsom embryogenes är särskilt känsliga för de skadliga effekterna av olika hormonstörande substanser, inklusive BPA. Vi tillhandahåller detaljerade protokoll för att studera effekterna av exponering för BPA eller andra gifter i C. elegans ryggradslösa modellen, som möjliggör bekväm titrering av en serie koncentrationer att bedöma dess effekt på embryo livskraft (figur 2) . Följa upp beteende experiment överlevande vuxna som utvecklas från embryon som var utsatta för låga doser av BPA tillåta testmetoder långtidseffekter på nervcellernas funktion (figur 3). Den centrala idén i detta dokument är att ge detaljerade protokoll för utsätta embryon till olika gifter under tidig embryogenes i C. elegans modellen; det första 4 h-fönstret i dess 11,5 timme embryonala utvecklingsperioden (vid 20 ° C) motsvarar perioden spridning, som följs av organogenes. Mot detta syfte har vi tillhandahållit validering slutpunkter genom fruktsamhet och icke-associativ lärande analyser. Medan den mekanistiska grunden för BPA och andra bisphenols åtgärder är den heliga graal som forskning på detta område är att, har vi inte försök att erbjuda en mekanistisk förklaring av BPA åtgärder i denna metodik fokuserad artikel. Vi vill dock påpeka att C. elegans modellen erbjuder ett idealiskt system för att ytterligare dissekera verkningsmekanismen. Till exempel, i framtiden arbeta på dechiffrera BPA verkningsmekanismer, C. elegans mutanter kan genereras och screenas för en motståndskraft mot effekterna av BPA och därmed bana väg för att dechiffrera vägen. Dessutom behandlar våra följeslagare uppsats effekten av BPA på neurala nätverk synchrony nivå hos ryggradsdjur, som tillhandahåller en annan avenue för att förstå grunden för att undersöka potentiella mekanismer för toxiska effekter19.
I den metod som beskrivs i detta papper, några av de kritiska steg som bör utföras extra noggrant omfattar följande: att välja en tallrik med välnärda C. elegans vuxna med mogna ägg synliga under mikroskopet dissektion är avgörande, och underlåtenhet att följa detta steg kommer att resultera i en otillräcklig provstorlek av embryon för EDC exponering experimentet. Det är också viktigt att se till att hypokloritlösning görs färskt att undvika att få en osynkroniserad befolkning som stör förmågan att utföra BPA exponering under tidig embryogenes. Tvätta pellets med M9 (efter hypoklorit exponering) är också ett mycket viktigt steg. Om det inte görs korrekt, kan den höga koncentrationen av blekmedel resultera i döda embryon. Dessutom bör embryon överföras till seedade NGM plattor efter 4 h. Om vänster i BPA lösningen under en längre tid, sannolikt embryona utvecklas till långlivade dauer larverna. Detta kommer att väsentligt störa både fruktsamhet assay och beteendemässiga analyser. Om dessa steg missas, är det lämpligt att starta proceduren från början. Om av någon anledning NGM plattan med maskar är förorenad eller inte har tillräckligt med mat, kommer den lägga stress på maskar därmed skevning insamlade data. Sådana plattor kasseras och användas inte i försöket.
Tidigare använde en anmärkningsvärd studie framgångsrikt C. elegans modellen för att demonstrera att kromosomavvikelser orsakade av BPA resultatet på grund av DNA reparation maskiner i könsceller14. Det är dock anmärkningsvärt att ovanstående studiedesign hade använt kontinuerlig BPA exponering av C. elegans för höga doser av BPA i hela dess livslängd. Vår metodik var avsedd att studera BPA exponering i låga doser under tidig embryogenes, så att assay dess effekter på embryonal livskraft och subtilare långsiktiga effekter på överlevandearna. Till vår kunskap, har ingen metod utvecklats för att avslöja tidiga skede embryon till mycket låga doser av BPA begränsad till en angiven tidsperiod; således presenteras att göra metoden här roman.
Dessutom tillhandahålls protokoll här kan lätt anpassas till studera effekterna av andra hormonstörande ämnen under spridning av embryogenes. Dock behöver för att kunna studera sena embryonala stadier, protokollet viktiga ändringar till fönstret kritisk tid av utveckling under fokus. Dessutom blir våra protokoll inte lämplig för experiment som kräver längre tider av toxiska exponering, eftersom det öppnar upp möjligheten att den alternativa utveckling vägen resulterar i långlivade dauer gripandet vid den andra ömsat cykeln, som är resistent till hårda villkor20. Ytterligare ändringar och förbättringar kommer att behövas för längre exponeringstider genom tillägg med en näringskälla som inte har potential att metabolisera den för människor eller EDC t.ex. Ånghärdad E. coli. Sammanfattningsvis, vår metod kan användas för att bedöma effekterna av olika hormonstörande kemikalier på fruktsamhet och nervcellernas funktion i systemet ryggradslösa modell C. elegans.
The authors have nothing to disclose.
Stöd av NSF (EPSCoR EPS-0814251) och NIH (1P20GM103653-01A1) MKT och HSD, Delaware State Universitys institutionella Studentstöd MDM (avdelning III HBGI) och KRS (NIH-INBRE) är erkänt tacksamt. Tack till C. elegans genetiska Center (stöds av NIH kontoret av forskning infrastruktur program P40 OD010110) för C. elegans vildtyp N2 stam.
NaCl | Fisher | 7647-14-5 | |
Peptone | Fisher | S25761B | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | |
Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
MgSO4 | Fisher | 7487-88-9 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
KH2PO4 | Fisher | P286-1 | |
K2HPO4 | Fisher | 7758-11–4 | |
KOH | Fisher | 1310-58-3 | |
Bleach | Clorox | n/a | |
Na2HPO4 | Fisher | BP332-500 | |
LB | Fisher | BP1426-500 | |
BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
BPS | Sigma-Aldrich | 103039-100g | |
EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
E.coli OP50 | CGC | Repository at U of Minnesota | |
N2 (Wild-type C. elegans) worms | CGC | Repository at U of Minnesota | |
Platinum wire pick | Genesee Scientific | 59-AWP | |
Petri plates | Fisher | 07-202-011 | |
Dissection Microscope | AmScope | SM-2TYY |