Summary
Kapillär isoelektrisk fokusering är en antikroppsbaserade, ultrasensitive, hög genomströmning teknik, möjliggör detaljerad karakterisering av proteiner och deras isoformer från extremt små biologiska prover. Nedan beskrivs ett protokoll för detektion och kvantifiering av specifika proteiner och deras isoformer på ett automatiserat och robotiserade sätt.
Abstract
Immunoblotting har blivit en rutin teknik i många laboratorier för protein karakterisering från biologiska prover. Följande protokoll ger en alternativ strategi, kapillär isoelektrisk fokusering (cIEF), med många fördelar jämfört med konventionella immunoblotting. Detta är en antikroppsbaserade, automatisk, snabb och kvantitativa metod där ett komplett western blotting förfarande äger rum inuti en ultrathin kapillär. Denna teknik inte kräver en gel att överföra till ett membran, strippning av blotting, eller Röntga filmar, som vanligtvis krävs för konventionella immunoblotting. Här, proteiner är separerade enligt sin laddning (isoelektrisk punkt, pI), med mindre än en mikroliter (400 nL) av totalt protein lysate. Efter elektrofores, proteiner är orörlig på kapillär väggarna av ultraviolett ljus behandling, följt av primära och sekundära (pepparrotsperoxidas (HRP) konjugerade) antikropp inkubation, vars bindande upptäcks genom förbättrad chemiluminescence (ECL), genererar en ljussignal som kan fångas och inspelad av en avgift – tillsammans enhet (CCD) kamera. Den digitala bilden kan analyseras och kvantifieras (topparea) med hjälp av programvara. Proceduren hög genomströmning kan hantera 96 prover på en gång; är mycket känslig, med protein upptäckt i intervallet pikogram; och producerar mycket reproducerbara resultat på grund av automatisering. Alla dessa aspekter är ytterst värdefulla när kvantiteten av prover (t.ex., vävnadsprover och biopsier) är en begränsande faktor. Tekniken har bredare program, inklusive screening för droger eller antikroppar, biomarkör identifiering och diagnostiska ändamål.
Introduction
Kapillär isoelektrisk fokusering (cIEF) är en automatiserad, kapillär-baserad immunoassay som löser proteiner på grundval av deras avgift1,2,3. Det är mycket reproducerbara och kan lösa proteiner och deras post-translationally modifierade isoformer snabbt och kvantitativt. Den presenterar ett alternativ till konventionella metoder såsom western blotting. Även western blotting är mycket bra för att bekräfta förekomsten av rikliga proteiner i lättillgängliga prover; variabilitet, tidsförbrukning och noggrann kvantitering alla närvarande utmaningar, i synnerhet när man undersöker biologiska vävnadsprover. Indeed, variabilitet är ett inneboende problem i western blotting, så finns det flera steg inblandade, såsom lastning och körning av SDS-PAGE geler, överföring av proteiner på membran, inkubation med olika reagens (t.ex., primära och sekundära antikroppar, ECL), och utvecklingen på röntgen film4. För närvarande, förbättras western blotting tekniken med genomförandet av digital inspelning av Kemiluminiscens signaler (digitala västernfilmer). Nyligen, ett automatiserat western blotting system har utvecklats, nämligen kapillären västra, som är ett handsfree- och gel-fria system. Hela analysen är automatiserad efter inläsningen av en prov tallrik (prover med alla nödvändiga reagens) i system3,4. Instrumentet kommer att utföra alla steg såsom protein separation, immobilisering av proteiner på kapillär vägg, antikropp inkubationer, tvättar mellan olika steg, och utveckling och kvantifiering av Kemiluminiscens signalerna. CIEF proceduren presenteras här ger således högre upplösning och känslighet.
Denna metod är känslig, som signaler kan genereras och kvantifieras från pikogram proteiner1. Hög känslighet med utmärkt reproducerbarhet gör denna teknik mycket användbar för analys av kliniska prover. Det kan upptäcka samt skilja post translationell modifiering (t.ex. olika fosforyleras protein isoformer) av proteiner. Denna teknik har använts framgångsrikt att dissekera olika signalering vägar4,5 i kliniska studier som syftar till att utveckla nya therapeutics i cancer3, och det har stor potential för protein biomarkör och drug discovery .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cell kultur, stimulering och Lysis
Obs: Denna metod kan användas med många celltyper. För att illustrera metoden, beskrivs ett exempel som använder mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs).
- Kultur HUVECs på gelatin-belagd, 10 cm petriskålar i endotelceller basala medium med lämpligt tillskott (se Tabell för material), och som också innehåller 5% FCS, epidermal tillväxtfaktor (5 ng/mL), vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF: 0,5 ng/mL), grundläggande FGF (10 ng/mL), insulin-liknande tillväxtfaktor (20 ng/mL), hydrokortison (0,2 µg/mL) och askorbinsyra (1 µg/mL).
- Svälta celler över natten med endotelceller basala medium kompletteras med 1% FCS och inget tillväxtfaktor tillägg.
- Aspirera alla medium, tillsätt 2 mL av endotelceller odlingsmedium utan tillväxtfaktorer (svält medium) i en maträtt (kontroll) och sedan lägga till 50 ng/mL VEGF i 2 mL odlingsmedium svält i en andra maträtt för 7 min.
- Sug ut mediet och tvätta cellerna 2 gånger med 10 mL rumstemperatur PBS.
- Säkerställa Petriskålarna på is och behålla dem där från detta steg framåt.
- Tillsätt 250-400 µL is kallt lysis buffert (Bicine/CHAPS, se Tabell för material) innehållande aqueous proteas hämmare mix och DMSO hämmare mix (fosfatas-hämmare, se Tabell för material) i varje 10 cm platta. Snurra på plattan för att säkerställa ordentlig täckning och hålla den i 10 min på is.
Obs: Slutliga koncentration av proteashämmare och DMSO hämmare blandning bör vara 1 x. - Skrapa cellerna från skålen med en cell skrapan och överföring till ett pre kylda mikrofugrör. Pipettera upp och ner 5 gånger för att lysera celler.
- Kort Sonikera cellerna vid 4 ° C. Ange den någon sonikator enligt följande: antal cykler = 5, power = låg, på = 5 SEK, OFF = 30 s. Detta steg ingår att bryta nucleic syror, och inte att lysera celler.
Obs: Ultraljudsbehandling bör vara mild att förhindra denaturering av proteiner. - Vortex röret för 5 s (inte kontinuerligt), 2 s i taget (3 gånger), och hålla på is.
- Klargöra lysate genom centrifugering vid 14 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C och sedan omedelbart överföra supernatanten till en ren före kylda mikrofugrör.
- Mätning av protein koncentrationen med hjälp av en Bicinchoninic syra (BCA) protein assay kit4.
- Gör 10 µL portioner, snap frysa i torris eller flytande kväve, och förvaras vid-80 ° C fram till användning.
2. Blanda Provberedning (beräkning för 150 µL prov Mix)
- Först förbereda ett prov spädningsvätska mix genom att lägga till 1 µL av DMSO hämmare mix (lagerför 50 x) och 2 µL av proteashämmare (lagerför 25 x) till 47 µL prov spädningsvätska (se Tabell för material), så att den slutliga koncentrationen av DMSO-hämmare och proteashämmare blir 1 x. Nästa, späd den protein-lysates som använder provet spädningsvätska mixen för att erhålla önskad koncentrationerna (se steg 2.3).
- Förbereda ampholyte/stege/proteas hämmare/DMSO hämmare mix genom att lägga till 3.325 µL standard stege (se Tabell för material, lager 60 x), 6 µL av proteashämmare (25 x), 3 µL av DMSO (50 x) hämmare till 137.675 µL ampholyte premix (se tabellen Material). Vortex röret minst 15 s totalt, 5 s vid en tid (3 - 4 gånger), och hålla på is.
- Blanda lösningarna från steg 2.1 och 2.2 i förhållandet 1:3, så att de slutliga koncentrationerna av DMSO, proteashämmare och pI standard stegen blir 1 X, och proteinerna i kapillären nå de slutliga önskade koncentrationerna (t.ex., 50 µg/mL används för att (Se figur 2).
Obs: Proteinkoncentration i kapillär och brunn är samma. - Ladda 10 µL prov mix i lämpliga brunnen, enligt mallayouten plattan med 384 brunnar assay (se steg 3 och figur 1) och hålla plattan på is.
- Späd primärt (pERK1/2, 1:50; ERK1/2, 1: 100; HSP 70, 1: 500) och sekundära antikroppar (1:300) med antikropp spädningsvätska (se Tabell av material) och Pipettera 10 µL av primära och 15 µL av sekundära antikroppar i varje brunn.
Anmärkning: I allmänhet högre koncentration av antikroppar behövs för cIEF analyser jämfört med konventionella western blotting. - Blanda urin och peroxid XDR (förhållande 1:1; se Tabell för material) tillsammans och Pipettera 15 µL till varje brunn.
Obs: Blanda dessa lösningar färska varje gång innan användning och hålla på is. - När prover och alla reagenser är pipetteras i plattan, Centrifugera plattan vid 2500 x g i 10 minuter vid 4 ° C att snurra ner vätskan och ta bort bubblorna. Om bubblor fortfarande finns, ta bort dem manuellt med hjälp av en tunn pipettspetsen.
Obs: Fyll inte på mer än 20 µL prov eller reagens per väl; instrumentet pipetten kan inte annars tvättas ordentligt. Se till att följa bruksanvisningen från tillverkaren att förbereda alla reagenser.
3. designa en ny analys mall med systemprogramvara (figur 1)
- Öppna systemets programvara och klicka på 'ny' från menyn Arkiv.
- Gå till panelen layout och tilldela platser för reagenser och prover i en 384 väl-plattan. Använd upp till högst 96 brunnarna per plattan med 384 brunnar.
- Gör en reagens tilldelning genom att klicka på en väl någonstans i blocket. Välj en rad block av 12 brunnar varje. Brunnar, t.ex., från 1-12 eller 13-24, tilldelas som ett block som standard.
- Gå till verktygsfältet layout rutan och infoga antingen en tom rad block eller ett prov, primär, sekundär eller urin rad block. Varje block är tilldelad en annan färg, så de är lätta att skilja.
Obs: När du klickar på en brunn, en svart ram kan ses runt kvarteret där det nya blocket infogas i fönstret. En rad block kan också tas bort. - Gå till fönstret protokoll och väljer en reagens plats i plattan. Sedan, klicka på en cell i kolumnen prov och välj reagenset i listmenyn.
- I denna samma mode, Välj reagens platser för primärt, sekundära, och urin för varje cykel.
- Klicka på cellerna, en i taget, i kolumnen primär eller sekundär antikropp och ändra inkubationstider, om det behövs.
Obs: Posten anteckningar för varje cykel kan också läggas. - Lägga till cykler genom att klicka på knappen 'Lägg till' i avsnittet protokoll. 1 cykel, 4 cykler eller alla cykler (högst 8 cykler kan läggas till protokollet).
Obs: Det är möjligt att kopiera och klistra in cykeln information i det här steget: Välj en cykel, gå till redigera, och kopiera och klistra in. - Ange information som hänför sig till provet, såsom identiteten för de primära och sekundära antikropparna, deras katalognummer och spädningar, etc., i rutan mall. Detta är ett valfritt steg som är användbar under efter köra analysen.
- Spara den nya analys-filen. Innan du klickar på 'start'-knappen, snabbt Kontrollera layout att se till att allt är korrekt.
4. protokoll för cIEF Instrument inställning
- Ställ in isoelektrisk fokusering kapillärelektrofores separationsbetingeiserna. Dessa bör vara 15 000 µW och 40 min, och UV immobilisering tiden ska vara 80 s. Dock UV immobilisering tiden kan ställas inom intervallet 80-140 s, och kan behöva optimeras för proteinet av intresse.
Obs: En tidpunkt för UV immobilisering kan ställas in för varje cykel, men inte för varje kapillär. - Uppsättning tvätta 1 till 2 tvättar, för 150 s varje tvätt (standard) och primär antikropp inkubation i 120 min.
- Uppsättning tvätta 2 till 2 tvättar, för 150 s varje tvätt (standard) och sekundär antikropp inkubation i 60 min.
- Ange tvätta 3, som bör vara 2 tvättar, för 150 s varje tvätta (standard).
- Ställa in exponering gånger när chemiluminescence upptäcks; bör dessa 30, 60, 120, 240, 490 och 960 s. Alla steg (1-8) kommer att utföras i en enda kapillär.
5. kör filen Assay
- När allt är klart, klicka start att börja körningen. Programvaran kommer att uppmana dig att ta bort avfallet, för att fylla på vattnet och rutan kapillär, lägga till Anolyt och Katolyt till resurs facket, att lägga till tvättbuffert och slutligen att ladda plattan i kyls provet facket.
Obs: Ta bort locket från rutan kapillär, men ta inte bort locket från assay plattan. Locket från plattan kan tas bort automatiskt av instrumentet när nödvändigt. Detta hjälper till att förhindra reagens avdunstning. - Ett par minuter efter körningen har påbörjats, en instrument statusfältet visas på datorskärmen. Statusmeddelanden och förloppsindikatorer kan ses motsvarande instrumentets nuvarande skede.
Obs: Inledningsvis instrumentet kommer att kontrollera om allt är korrekt innan du fortsätter att Pipettera den Anolyt och Katolyt i separation facket, plocka det första blocket av 12 kapillärer, ta bort locket på plattan och placera proverna från provet plattan in i kapillärerna, och sedan slutligen in separation kammare för elektrofores. - Klicka på Kör Sammanfattning skärmen att se två rutor: status och separation. Användare kan visa kör förloppet och filmer av separation (12 kapillärerna i varje cykel) kan lagras när steget elektrofores av varje cykel är klar. För att observera en kapillär elektrofores avskiljandet, spela separation filmen för att kapillär genom att klicka på önskad cykeln och sedan på uppspelningsknappen i Kontrollpanelen.
- Kör filen kan lagras automatiskt när körningen har slutförts.
6. analysera Data (figur S1)
- Öppna kör filen och välj fliken analys skärmen. I Figur S1Aär de data som visas (toppar) i figuren prov från valda kapillären (dvs, 4th kapillär från cykel 1).
- Klicka på Redigera och sedan analys (Figur S1B). I detta skede, kan användare ändra intervallet pI, tillämpa lämpliga pI standarden för en given experiment, lägga till en toppen passform och lägga till en topp namn.
Obs: När du använder en pH 5-8 ampholyte premix (vilket är fallet här), den rekommenderade standard stegen att använda är en med fluorescently märkta peptider med pIs 4,9 6,0, 6.4, 7.0 och 7,3, och när du använder en pH 3-10 premix, rekommenderade stegen är en med pIs 4,0 , 4.9, 6.0, 6.4 och 7,3. 2 - Resultaten visas i fliken toppar; värdena som visas för proverna är Position, pI, peak höjd och område, % område, topp bredd och signal-brus (S/N) (Figur S1C). Välj vilka data som ska använda och exportera data för vidare analys.
Obs: Data kan endast exporteras efter märkning toppen (Figur S1C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Design av en ny analys: En assay plattan layout visas i figur 1A. Maximally, kan 96 brunnarna användas från 384-väl plattan i block av 12 brunnar för varje villkor (antikropp). Varje block av 12 brunnar kan starta antingen från A1-A12 eller A13-A24. Färgkodade rader tillåter en att skilja prover eller reagenser från varandra. I mallen assay (figur 1B), relevant information för att kan särskilda analys lagras, som kan användas i senare stadier av resultatanalys. Figur 1 c visas en sammanfattning av protokollet.
Detektering av fosforyleras och unphosphorylated extracellulära reglerade Kinas (pERK1/2 och ERK1/2) protein i HUVEC lysate stimuleras med VEGF: I allmänhet är inlägget translationally modifierade proteiner, såsom phosphoproteins, svåra att upptäcka på grund av deras låga kvantitet och övergående natur, och en brist på specifika antikroppar. Vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) stimulering efter serum svält aktiverar receptor tyrosinkinas (VEGFR2) som leder till aktivera den MAPK-signalvägen och resulterar i ERK fosforylering. För experiment med HUVECs, kan lysates från celler stimuleras med eller utan VEGF för 7 min användas, som visas i figur 2. Figur 2A visar elektroferogram pERK1/2 från ± VEGF-stimulerad lysates. Det är uppenbart med VEGF mycket hög induktion av fosforyleras proteiner (toppar rödmarkerade). Infällt visar kontrollen endogena lastning HSP 70 (figur 2A infälld), som visar liknande lastning av prover för både obehandlade och behandlade prover. I konventionella immunoblot (figur 2 cvänstra panelen) bara två band var upptäckt (phosphoERK1; pERK1 och pERK2). Dock löstes pERK1/2 proteiner in 4 toppar för ppERK2, pERK2, ppERK1 och pERK1 av cIEF analys (figur 2A). Likaså visar figur 2B elektroferogram ERK1/2 från ± VEGF-stimulerad lysates. Infällt visar samma lastning kontroll används parallellt. En konventionell immunoblot visar bara två band motsvarar ERK1 och ERK2 fosforyleras (figur 2 chögra panelen) medan med cIEF, den pERK1/ERK2 löstes in 6 toppar (figur 2B) motsvarar alla 4 olika toppar och 2 unphosphorylated toppar, ERK1 och ERK2. Detta visar en av fördelarna med cIEF, nämligen att protein isoformer kan lösas och bedömas både kvalitativt och kvantitativt. Det är dessutom möjligt att få kvantitativa information av fosforylerade isoformer från en antikropp riktad till protein kärnan, i stället för posttranslationell modifiering.
Figur 1 : Projektering av assay plattan layout i programvara. (A) plattan med 384 brunnar layout definiera positionen för alla reagenser. Färgkodade 12 väl rader visar platsen för prover, antikroppar och kemiluminiscerande reagens. (B), ett test mall visar relevant information med enskilda brunn. (C) protokollet visar all relevant information för cykel 1 och 2. I cykel 1 (12 kapillärerna som visas i färgad ruta), instrumentet tar prov från A1 (brunnar från A1-A12) följt av primär antikropp från B1 (brunnar från B1-B12), sekundär antikropp från D1 (brunnar från D1-D12), och slutligen luminol:peroxide XDR från J1 (brunnar från J1-J12). I 2: acykel, allt är samma som den första cykeln, förutom det tar primär antikropp från C1 (brunnar från C1-C12). Denna siffra har ändrats med tillstånd från Aspinall-O'Dea et al. 20152. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Detektering av fosforyleras och totala Mitogen-Activated proteinkinas (ERK 1/2) proteiner av cIEF assay och traditionella immunoblot analys. (A) Representant elektroferogram för pERK1/2 och proteiner i HUVECs behandlade ±VEGFA följt av cIEF assay, probed för pERK1/2-antikroppar. Blå linjen (ostimulerade) och röda linjen (stimuleras). Toppar visar de annorlunda fosforyleras pERK/2 isoformerna separeras på grundval av deras isoelektriska punkter. Infällt visar endogen kontroll HSP70 parallellt med samma lysate. ()B) representant elektroferogram visar ERK1/2 ± VEGFA-stimulerad lysate. Infällt visar den endogena kontroll HSP70 som kördes parallellt. För elektroferogram, 50 µg/mL lysat koncentrationer användes, vilket motsvarar 20 ng av totala proteiner i kapillären. (C) konventionell immunoblotting för pERK1/2 och ERK1/2 proteiner på ±VEGFA (50 ng/mL) stimuleras HUVEC cell lysate. 10 µg av Summa lysate per körfält användes för immunoblotting. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Bild S1: stadier av resultatanalys
(A) Visa resultaten från en kapillär av intresse. (B) Redigera/Lägg till olika parametrar till filen assay. (C) Är det möjligt att lägga till topp namn till topparna innan du exporterar data för vidare analys. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Känslighet och upplösning av proteiner är avgörande för proteomiska forskning om biologiska prover. Det är stort värde i att kunna identifiera proteiner som finns i minuten mängder i celler. cIEF kan erbjuda förbättrad känslighet och upplösning för påvisande av proteiner och deras isoformer4.
Denna teknik har använts framgångsrikt i många proteomiska forskning rapporter5,6,7. Flera begränsningar är fortfarande, associerade med det, såsom det faktum att inte alla primära antikroppar kan ge en signal även om de fungerar fint i konventionella immunoblots. Det finns ännu ingen förteckning över validerade antikroppar visat sig fungera i cIEF, eftersom denna teknik är helt nytt. Slutligen kan inte instrumentet hantera färre än 12 prover eller fler än 96 prover på en gång.
cIEF är en alternativ teknik för konventionella immunoblotting, men det kanske inte ger identiska resultat. cIEF har visat sig vara vida överlägsen konventionella immunoblotting när det gäller känslighet och upplösning. Dessutom cIEF är hög genomströmning, robust, automatisk, robotiserad, och mycket känsliga, ger signaler från färre än 25 celler beroende på proteinet analyseras1. Det är kvantitativa och mycket reproducerbara, eftersom hanteringen minimeras. Detektion av olika protein isoformer av liknande storlekar kan enkelt lösas. Således kan samma antikropp ge kvantitativa uppgifter om fosforyleras och unphosphorylated protein former från nanogram mängder prov4. Även om både konventionella immunoblot och cIEF åberopa antikropp baserat kemiluminiscent detektion, det finns några viktiga skillnader, såsom i konventionella immunoblotting, proteiner avgränsas på grundval av deras molekylvikt medan i cIEF, separation är baserad på protein laddning. Slutligen är proteiner denatureras i immunoblot, medan de är bevarade i deras infödda tillstånd i cIEF. Denna sista punkt är anledningen varför samma antikropp kanske eller kanske inte fungerar i båda metoderna.
Många olika studier har visat att cIEF att studera protein fosforylering från mänskliga patientprover3, mänskliga kolon cancer prover4,8, mus tumör vävnad9eller olika cellinjer 10. antagandet av denna metod skulle kunna främja snabba framsteg i proteomiska forskning inom många områden såsom läkemedelsutveckling, diagnostiska ändamål, biomarkörer upptäckten och signalering studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inga upplysningar.
Acknowledgments
Författaren tack Prof. Lena Claesson-Welsh, Uppsala universitet för hennes stöd för att utveckla detta projekt. Dessutom tack författaren Ross Smith och Lena Claesson-Welsh, Uppsala universitet för deras kritisk läsning och förslag för att förbättra manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoPro 1000 | ProteinSimple | ||
| Premix G2, pH 5–8 (nested) separation gradient, pH 2–4 plug | ProteinSimple | 040-972 | Ampholyte premix |
| DMSO inhibitor mix | ProteinSimple | 040-510 | Phosphatase inhibitors; for cIEF 1:50 dilution used |
| Aqueous Inhibitor Mix | ProteinSimple | 040-482 | Protease inhibitor; for cIEF 1:25 dilution used |
| pI standard ladder 3 | ProteinSimple | 040-646 | For cIEF 1:60 dilution used |
| Sample diluent | ProteinSimple | 040-649 | |
| Antibody diluent | ProteinSimple | 040-309 | |
| Wash concentrate | ProteinSimple | 041-108 | |
| Anolyte Refill | ProteinSimple | 040-337 | |
| Catholyte Refill | ProteinSimple | 040-338 | |
| Peroxide XDR | ProteinSimple | 041-084 | |
| Luminol | ProteinSimple | 040-652 | |
| Bicine/CHAPS Lysis Buffer | ProteinSimple | 040-764 | |
| Capillaries-Charge Separation (1 pack) for | ProteinSimple | CBS700 | |
| Assay Plate/Lid Kit | ProteinSimple | 040-663 | |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | For cIEF used (1: 300) |
| Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For cIEF used (1: 300) |
| Phospho-Erk 1/2 Primary Antibody | Cell Signaling | 9101 | For cIEF used (1: 50) |
| Pan Erk Primary Antibody | Cell Signaling | 9102 | For cIEF used (1: 100) |
| Compass software | ProteinSimple | ||
| HUVEC | ATCC | PCS-100-010 | |
| MV2 (EBM-2) | PromoCell | C-22221 | Endothelia cell basal medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV2 SupplementPack | PromoCell | C-39221 | Supplementation to MV2 above |
| VEGFA | PeproTech | 100-20 | |
| Long R3 IGF | Sigma-Aldrich | 85580C/I1146 | Insulin-like growth factor |
| Bioruptor (Sonicator) | Diagenode | B01020001 | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fischer Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fischer Scientific | NP0322BOX | |
| NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X) | Thermo Fischer Scientific | NP0006 | |
| Immobilon PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Microfuge tube vortexer | |||
| Centrifuge | |||
| Microtiter plate adapter for centrifuge | |||
| Pipettors | |||
| Tips | |||
| Ice |
References
- O'Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
- Aspinall-O'Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
- Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
- Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683 (2016).
- Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
- Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6 (2016).
- Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994 (2016).
- Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).
