Здесь мы представляем собой протокол для выявления и количественной оценки Plasmodium falciparum в зараженных водный красных кровяных клеток, используя аттенуированные полного отражения инфракрасного спектрометра и анализа многомерных данных.
Мы демонстрируем метод количественной оценки и выявления паразитов в водный красных кровяных телец (эритроцитов), используя простой benchtop ослабленных общее отражение Фурье преобразование инфракрасного (ATR-FTIR) спектрометра в сочетании с (многомерный анализ данных MVDA). 3D 7 P. falciparum были культивировали 10% паразитемии кольцо стадии паразитов и используется для всплеска эритроциты свежие доноров изолированы для создания разрежения серии между 0-1%. 10 мкл каждого образца были помещены на центр ATR алмазов окна для получения спектра. Образец данных лечился улучшить соотношение сигнал-шум и для удаления воды, и затем вторая производная был применен для решения спектральной функции. Данные затем были проанализированы с использованием двух типов MVDA: первый анализ главных компонент (PCA) чтобы определить любые промахи и затем частичной регрессии методом наименьших квадратов (PLS-R) построить модель количественной оценки.
Малярия является одним самых разрушительных болезней нашего времени; более половины населения живет на риск в эндемичных регионах и он непропорционально бремя бедных1,2,3,4. Большая часть этого вопроса является бессимптомных носителей и ранней стадии пациентов, которые выступают в качестве резервуаров для комаров векторов5, вызывая пики инфекции во влажных сезонов и позволяет ему сохранять в общинах. Малярия вызывается пять Plasmodium паразитов, наиболее смертоносной из которых является P. falciparum , который приводит к наиболее тяжелая форма болезни2.
В настоящее время методов для диагностики малярии менее совершенны. Оптическая микроскопия, текущего золотого стандарта, может определять только 62-88 паразитов/мкл в зависимости от используемого метода6. Кроме того, из-за интенсивность и высокие навыки, необходимые, в многих регионах микроскопия misdiagnoses > 50% случаев, особенно с низкой паразитемии уровней2, которые можно непосредственно отнести отсутствие ресурсов в этом районе и результаты в злоупотребление противомалярийных препаратов. Другие 2 основные диагностические методы являются диагностические экспресс-тесты (БДТ), которые используют антитела для обнаружения и анализы полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые являются дискриминационными и количественно паразитов из ДНК. В настоящее время БДТ только способны обнаруживать P. falciparum и P. vivax по крайней мере 100 паразитов/мкл крови, что приводит к редких форм этого заболевания лечить. 7 , 8 в отличие от этого, анализы ПЦР дискриминацию и количественно разных видов плазмодия чувствительность 0.0004-5 паразитов/мкл крови. Однако он требует дорогостоящих реагентов, оборудования и технических навыков и таким образом не подходит для области применения.
Очень чувствительной, надежной и доступной техника имеет важное значение для улучшения диагностики раз и таким образом улучшение результатов лечения пациентов и возможность ликвидации болезни. Ослабленная общее отражение Фурье-спектроскопии преобразования (ATR-FTIR) предлагает потенциальным решением этой проблемы. Предыдущие работы показал, что возможности для выявления и количественной оценки P. falciparum в метаноле фиксированной мазков крови, достижение пределов обнаружения из < 1 паразитов/мкл крови (< 0,0002% паразитемии)9, которая сопоставима с методами ПЦР. Недавние исследования показали, что это возможно для выявления и количественной оценки паразитов водных проб и таким образом устранить на этапе фиксации. Однако такие факторы, как водяной пар, спектральные шума и обработки данных необходимо принимать во внимание для достижения оптимальных результатов10.
Этот протокол имеет целью показать новых пользователей как приобрести ATR-FTIR спектры и подготовить модель регрессии для обнаружения P. falciparum от водных проб эритроцитов (РБК)10.
PLS-R модель находится под наблюдением многомерный метод, который находит линейную связь, Y = bX + E, между прогнозирования переменными X (здесь, поглощения на каждом волновое) и непрерывной переменной Y (здесь, на уровень паразитемии). Короче говоря, модель сочетает в себе переменные в X, чтобы ?…
The authors have nothing to disclose.
Финансирование авторам было предоставлено Австралийский исследовательский совет (стипендий FT120100926 будущее в BRW), национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (Грант программы и старший стипендий для ИГБ; Начале карьеры стипендии JSR; Инфраструктуры для научно-исследовательских институтов поддержки схемы Грант института Burnet), и оперативной инфраструктуры правительство викторианской государственной поддержки Грант института Burnet. Мы признаем, что г-н Финлей хвостовик для инструментальной поддержки.
Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |