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Chemistry

衰减全反射红外光谱和多变量数据分析检测和定量水红血球中恶性疟原虫

doi: 10.3791/56797 Published: November 2, 2018

Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 检测和定量恶性疟原虫在受感染的水红血球使用衰减总反射红外光谱仪和多变量数据分析。

Abstract

我们演示了一种利用简单的台式衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪与多元数据分析 (mvda)。对 10%的寄生虫血症环状寄生虫进行了 3d7 p. 恶性疟原虫培养, 用于穗生分离的红细胞, 形成0–1% 之间的稀释序列。每个样品的10μl 被放置在 atr 金刚石窗口的中心, 以获得光谱。对样本数据进行了处理, 提高了信噪比, 消除了水的贡献, 然后应用二阶导数来求解光谱特征。然后使用两种类型的 mvda 对数据进行分析: 第一种主成分分析 (pca) 用于确定任何异常值, 然后是偏最小二乘回归 (pls-r) 来建立量化模型。

Introduction

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疟疾是我们时代最具破坏性的疾病之一;在流行地区, 一半以上的人口生活在危险之中, 这给 1234 的穷人带来了不成比例的负担。问题的很大一部分是无症状携带者和早期患者, 他们是蚊虫媒介5的宿主,在雨季造成感染激增, 并使其在社区持续存在。疟疾是由五种疟原虫引起的, 其中最致命的是恶性疟原虫, 它导致了这种疾病的最严重的形式2。

目前, 疟疾诊断技术还不尽如人意。光学显微镜, 目前的黄金标准, 只能检测62-88 寄生虫μμl 取决于所使用的方法6。此外, 由于强度和所需技能较高, 在许多地区, 显微镜诊断和 gt;50% 的病例, 特别是2级低寄生虫血症病例,这可直接归因于该地区缺乏资源, 其结果是:滥用抗疟疾药物。其他两种主要诊断方法是利用抗体进行检测的快速诊断测试 (rdt) 和聚合酶链反应 (pcr) 检测, 后者区分和量化 dna 中的寄生虫。目前, rdt 只能检测到至少100种寄生虫的恶性疟原虫vivax,导致这种疾病的罕见形式得不到治疗。7.,8相反, pcr 检测在血液的 0.04-5-μμμμl 的敏感性下, 对不同种类的疟原虫进行了鉴别和量化。然而, 它需要昂贵的试剂、设备和技术技能, 因此不适合现场应用。

高度敏感、可靠和经济实惠的技术对于缩短诊断时间, 从而改善患者结果并使疾病消除成为可能至关重要。衰减全反射傅里叶变换 (atr-ftir) 光谱为这一问题提供了一个潜在的解决方案。先前的研究表明, 有可能检测和量化甲醇固定血膜中的恶性疟原虫, 达到 lt;1 血液寄生虫 (& lt;0.0002% 寄生虫血症)9的检出限, 这与 pcr 方法相当。最近的研究表明, 有可能检测和量化水样中的寄生虫, 从而消除固定步骤。然而, 为了取得最佳结果, 需要考虑水汽、光谱噪声和数据处理等因素.

该协议旨在向新用户展示如何获取 atr-ftir 光谱, 并为从红血球 (rbc) 水溶液样本10中检测恶性疟原虫建立回归模型。

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Protocol

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请查阅适当的材料安全数据表 (msds), 并寻求适当的生物安全 2级 (bsl-2) 培训。所有培养步骤都必须在使用无菌技术的 bsl-2 机柜中进行, 这意味着如果寄生虫培养, 则有可能受到有害紫外线辐射的影响, 这些都是由去污步骤、针棒损伤以及潜在的生物暴露和感染造成的进入任何伤害。此外, 血液库中的库存血液只对某些疾病进行筛查, 传播血液传播疾病的可能性是潜在的风险。在发生伤害时立即寻求医疗救助。

1. 3d7 恶性疟原虫副胜稀释系列的制备与测定

注:培养的疟原虫是高度敏感的。使用新鲜的未过期试剂, 并通过改变培养基定期喂养寄生虫。饲料培养低于5% 的寄生虫血症每两天;饲料培养6-10 寄生虫血症之间, 每天一两次;和饲料培养之间的 11%-20%, 每天多达4次。开始挨饿的寄生虫将失去形状, 开始收缩。在这种情况下, 通过改变培养基和添加库存 rbc 来立即进食和稀释, 将献血者的血液收集在含有肝素作为抗凝剂的血液收集管中, 并在前6小时内测量。

  1. 根据标准协议培养3d7 型恶性疟原虫寄生虫30毫升, 直到寄生虫血症达到10% 环。
  2. 寄生虫的同步
    1. 11小时后, 进入寄生虫的生命周期, 重新悬浮培养, 并转移到一个50毫升锥形管使用自动移液器。
    2. 以 300–400 x g 离心培养, 标准实验室条件 (25°C 和100千帕) 离心5分钟。
    3. 通过用移液器绘制上清纳剂或使用连接到真空的巴斯德移液器, 而不干扰颗粒, 将其取出。将废介质丢弃到10% 的漂白剂溶液中。
    4. 慢慢添加 12-15 ml 的4% 山梨醇溶液的颗粒使用自动移液器和混合培养通过封盖和倒置管, 直到培养均匀。
    5. 在37°c 下培养15分钟。
    6. 以 300–400 x g 的速度离心培养, 并在标准实验室条件下离心5分钟。
    7. 按照步骤1.2.3 中的说明取出上清液。
    8. 在颗粒中加入10-15 毫升的0.9% 盐水, 并通过封盖和倒置管混合溶液, 直到培养均匀。
    9. 重复这些步骤 1.2.6-1.2.8 两次, 以清洗所有残留的山梨醇。
  3. 寄生虫血症稀释系列的研制
    1. 在1.2.6 的步骤中清洗库存红细胞数量–1.2.9。
    2. 在标准实验室条件下离心培养, 以 300–400 x 克的速度储存 rbc 5分钟, 并按照1.2.3 的步骤丢弃上清液。
    3. 标签微型离心管为 0%, 0.010、0.010、0.010、0.100、0.250%、0.750% 和 1.000, 并分别使用 0.2μ-20 l 的培养物添加0μl、1μl、2.5μl、7.5μl、10μl、25μl、75μl 和100μl 培养。
    4. 在标记 0%、0.100、0.010、0.100、0.100、0.100、0.100、0.100% 和 1.000% 的管中加入100μl、99μl、92.5μl、92.5μl、80μl、80μl、80μl、80μl、80μl、80μl、80μl、80μl、80-l。
    5. 以 1200 x 克的速度离心在抗凝管中采集的新鲜献血者血液, 并在标准实验室条件下进行10分钟的离心。
    6. 按照步骤1.2.3 中的描述, 用移液器绘制并丢弃等离子体, 从而将其取出。
    7. 在每个微离心管中加入900μl 的隔离 rbc, 并通过倒置10倍进行彻底混合。
  4. 光谱采集
    1. 使用随附的光谱采集程序, 点击 "仪器设置", 将数据采集参数设置如下: 128次背景扫描;32个样本扫描;在仪器的最大样品范围内的分辨率为 8/厘米。
    2. 根据制造商的建议或隔夜设置 atr-ftir 光谱仪的温度。
    3. 用用超纯水浸湿的无皮棉湿巾, 以圆周运动轻轻擦洗水晶。然后使用另一个无皮棉擦拭彻底干燥。
    4. 点击 "背景测量" 对空气进行背景测量。每20分钟清洁一次水晶, 以便步调一致1.4.3 并重复测量。
    5. 点击 "预览" 打开实时视图。观察一个平坦的水平基线, 表明晶体是干净的。
    6. 将去离子水直接放在晶体中央, 然后点击 "测量样品"。在每五个样本之后重复一次水测量。
    7. 使用无皮棉擦拭和温和的圆周运动擦干晶体。
    8. 移液器10μl 的样品, 然后点击 "测量样品"。
    9. 按照步骤1.4.3 清洁样品之间的晶体。
    10. 重复3次复制, 直到获得3个复制, 确保随机抽取样本和复制的顺序。

2. 多元数据分析 (mvda)

注: 必须在整个数据集上进行数据处理, 以避免噪音和非生物来源峰值的增加。相反, 分析在生物相关地区: 2980-2800/厘米和 1750-850/厘米。

  1. 数据处理
    注: 两个软件,例如 matlab (以下简称软件 1) 和解码器 x (下称软件 2) 用作 mvda 的示例。软件1具有在不添加图形用户界面 (gui) 的情况下执行 mvda 的能力。但是, 建议购买 gui (材料表)。在引用软件 1时, 以下说明将假定与商业上可用的 gui 工具箱结合使用, 并附加了示例数据处理脚本。
    1. 打开相应的多变量数据分析软件, 单击 "导入数据", 然后选择要分析的文件类型。
      1. 在软件1中, 在命令窗口中输入 "分析" 以打开 gui。右键单击 x 框以查找 "导入数据"。
      2. 在软件2中, 单击 "文件" 选项卡以查找 "导入"。
    2. 通过分别选择每个数据集中的所有光谱并单击 "open", 将样品、水和基线光谱作为数据集导入工作空间, 并为每个集指定一个简短名称,例如,用于水谱数据集的 "wat"。
    3. 通过单击 "new matrixsector" 选择新的 table·matlemesp", 并生成一个 n×1向量, 其中 n 是样本数。输入每个样本的寄生虫血症, 并给病媒命名为 "寄生虫血症"。
      1. 在软件1中, 单击命令窗口中的 "新变量"。
      2. 在软件2中, 单击图标 "新矩阵"。
    4. 通过单击 "绘制数据图标" 来绘制数据。点击 "缩放" 并放大 800-1400/厘米, 检查水蒸气影响的光谱;最清楚的是沿酰胺 i 和酰胺 ii 带的斜坡的短峰、尖峰和窄峰。
    5. 在极端水蒸气的情况下, 打开编辑/预处理数据选项卡, 然后选择 "平滑"。通过使用多达25个点的平滑或水蒸气校正方法平滑样品和水谱, 减少噪音和/或强水蒸气的贡献。
    6. 在步骤2.1.4 中相同的编辑/预处理数据选项卡下, 使用基线校正算法 (如果合适) 使用基线校正算法来校正非水平基线。
    7. 平均水谱, 并将行复制到相当于样本数据集的 nxm 矩阵中, 并将其乘以 0.7, 将其降低到70% 的强度。
      1. 在软件1中, 通过输入以下脚本 "averagewater = 平均值 (waterdataset)" 在命令窗口中执行此操作。然后复制粘贴行以匹配示例数据集。要降低强度, 请输入 "平均水排放 70 = AverageWater*0.70"。
    8. 从每个样本谱中减去平均水谱。
      1. 在软件1中, 通过输入以下脚本 "应水洗数据 = samplatataset-averagew40", 在命令窗口中执行此操作。
    9. 打开 edit\ 预处理前数据选项卡以应用二阶导数函数, 然后通过选择单个正态变量 (snv) 函数和平均中心数据对数据进行规范化。
      1. 在软件1中, 一次执行此操作。首先选择 "导数", 并使用25个平滑点和 savitzki-golay 函数在样本集中输入25个平滑点、3的多项式阶数和导数顺序。然后选择 "snv" 和 "均值中心"。点击 "okay-spot"。
    10. 打开 "编辑" 预处理数据 "选项卡, 在" 列变量 "中, 选择2,980–2,800/cm 并通过确保只对其框进行标记来1,750–850/cm。
  2. 数据分析
    1. 主成分分析 (pca)
      1. 点击 "分析"分解 ", 然后选择 pca。
        1. 在软件1中, 单击 "生成模型"。
        2. 在软件2中, 输入 pca 方法。在此工作中输入最佳数量的主组件 (pc)、7个-最多100次迭代, 并为验证方法选择交叉验证。点击 "运行"。
      2. 在 pc1 和 pc2 之间的得分图上, 观察95% 的置信区间, 虚线环。
      3. 使用 "选择光谱工具" 将样品谱标记为超出限制的分数, 作为潜在的异常值。
      4. 如果标记的光谱具有较高的热插拔t2值和较高的 q 残差, 则会将其排除在进一步分析之外。
    2. 偏最小二乘回归 (pls-r)
      1. 点击 "分析"回归 ", 然后选择" pls-r "。
        1. 在软件1中, 右键单击 y 块并选择向量 "寄生虫血症"生成模型 "。
        2. 在软件2中, 输入 pls-r 方法。选择向量 "寄生虫血症" 作为 "y 参考", 选择样本数据集作为 "x 数据集", 并选择交叉验证作为验证方法。点击 "运行"。
      2. 分析回归模型。r2值超过 0.80, 交叉验证 (rmsecv) 值小于0.1% 的根均方误差是可接受的模型。
      3. 分析回归向量, 识别生物带。

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Representative Results

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偏最小二乘 (pls-r) 图及其相关回归向量 (图 1a1a)显示, 寄生虫发出的信号与 rbc 有足够的区别, 可以用来形成线性回归模型, 用于预测未来数据集中的寄生虫。

生成了一个鲁棒的线性 pls-r 模型, r 平方值为 0.87, 根平均平方交叉验证误差 (rmsecv) 为0.87 的寄生虫血症,图 1a.寄生虫血症水平的增加主要与核酸带有关, 特别是1042、1042和1226厘米, 它们被分配给 rna 核糖群的 (c = o), 分别为 (po4-) 和 (po4--) 和形式回归向量的主要负部分。这是因为 rbc 缺乏细胞核, 因此核酸是寄生虫的强大指标。此外, 1226 厘米带表明该结构具有 b-dna 形式, 这突出了在水状态 12中测量的重要性。相反, 寄生虫消耗红细胞成分, 主要是血红蛋白, 因此, 在未感染的红细胞中, 蛋白质与脂质的比率可能会更高, 这表现在2913、2879和1397厘米- 1 和1631和1555厘米-1从酰胺 i 和酰胺 ii模式12,13

不同的波段清楚地表明, 这些信号是真正的生物带, 而不是基于非生物来源的虚假波段的分化, 例如水蒸气, 这些条带呈现为狭窄和强烈的波段。具体而言, dna 带的存在,表 1, 可直接归因于寄生虫11,12,13。一般情况下, 回归向量可以用类似于 pca 中的负载的方式来解释。带应该与原始光谱的波段和移动很好地关联。

Figure 1
图 1:pls-r 回归图, (a) , rbc 激增在0-1% 的寄生虫血症和相关回归系数之间, (b)。回归图显示了模型预测每个样本中寄生虫血症的能力, 已知的寄生血症在 x 轴上, 预测的寄生虫血症在 y 轴上。回归系数描述了每个波段对模型预测能力的贡献, 越强烈的波段对模型的贡献就越大, 从而使寄生虫如何改变血液的化学成分。由 martin, m. 等人复制和修改.1 0日, 经皇家化学学会许可。请点击这里查看此图的较大版本.

回归系数带 (厘米-1) 任务25-27
2929 来自脂质、寄生虫的 ch2
2913 血脂、红细胞
2879 血脂、红细胞中的 ch3
2861 来自脂质、寄生虫的 ch2
1707年 b-dnaa/dna 碱基对振动 c = o & amp; o. c = n, 寄生虫
1652年 α螺旋蛋白、寄生虫中的酰胺 i
1631年 酰胺 i 从β褶皱片状蛋白, 红细胞
1584年 在核酸、寄生虫中, 从咪唑中含有 n
1555年 蛋白质、红细胞中的酰胺 ii
1530 酰胺 ii, 寄生虫
1423 b-脱氧核糖核酸, 寄生虫
1397 (coo-) 从脂质, 红细胞
1226 从 b-dna, 寄生虫
1184 b-脱氧核糖核酸, 寄生虫
1083 从 dna、寄生虫中提取的
1042 来自 rna 核糖、寄生虫的 o

表 1: pls-r 回归系数带对疟疾刺储 rbc 光谱的分配。在 plsr 中, 通过将预处理的光谱乘以回归向量来计算与光谱相关的寄生虫血症值。因此, 回归向量描述了回归中红外波段的重要性和方向。由于光谱是使用二阶导数进行预处理的, 因此负带与较高的寄生虫血症相关, 而正带与低寄生虫血症相关。由 martin, m. 等人复制和修改.1 0日, 经皇家化学学会许可。

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Discussion

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pls-r 模型是一种受监督的多变量方法, 它查找预测变量 x (此处为每个波数的吸收率) 和连续变量 y (此处为寄生虫血症水平) 之间的线性关系, y = bx + e。简而言之, 该模型结合 x 中的变量来创建一组新的潜在变量 (lv), 以捕获与 y 相关的 x 上的方差, 并计算一个回归向量 (b), 该向量乘以一个新的频谱结果, 从而导致 y 值的估计。模型的强度可以从两个值中提取: r2 值和交叉验证的根均方误差 (rmsecv) 值。前者描述了模型的线性度, 因此鲁棒性 (越接近1越好), 对于 r2 值小于0.8 的模型, 必须仔细审查异常值和噪声数据。rmsecv 值描述了可以进行预测的错误。最好是尽可能地尽量减少这个数字, 方法是确保排除异常值, 仔细处理数据, 并确保有尽可能多的生物复制。

因此, 必须获得高质量的数据, 以建立模型。稀释系列的制备至关重要;特别是要确保每个 rbc 样本都尽可能均匀。通过使用移液器在旋转或轻轻闪烁微离心管末端5-10 次时绘制和弹出 rbc 几次, 可以避免不一致。在类似的情况下, 清洁每个样品之间的晶体以防止污染也是至关重要的。使用超纯水和无皮棉湿巾清洁晶体, 并检查基线是否平坦, 确保没有残留物会污染下一次样品测量。

适用于该领域的模型所需的生物样本数量至少为 30个, 每个条件都使用类似数字的数据集进行验证。这个相当大的量需要大量的生成, 因此这就是技术的局限性。然而, 随着对更多样本的正确分析, 它们可以添加到预测模型中并予以加强。因此, 一旦建立, 模型可以变得更加准确, 并可以证明建立模型所需的努力是合理的。

根据所进行测量的环境和仪器, 可能会出现其他几个问题。如果波束线没有完全封闭在仪器中, 这意味着接头不是密闭的, 或者 atr 窗口可与其他样品隔间互换, 则乙醇和水蒸气可能会污染光谱。乙醇出现作为一个强有力的锋利的带在 1, 070/cm 14附近。这可以通过在没有乙醇的空间中进行测量和在所有测量后对仪器进行消毒来避免。水蒸气是由大气中的变化引起的, 在1400–1800厘米和3,200–3,600/cm 处出现小的尖锐正负峰。这可以通过增加背景测量的频率和用氮气清除仪器来解决。在无法进行清洗和水汽仍然相当强大的情况下, 可以在数据预处理中添加平滑算法和水汽补偿来去除它们。

这项技术为未来的诊断和患者结果带来了很大的希望。首先, 该方法总体上很简单, 因为样品只需在 atr 晶体上进行管道处理, 然后就可以直接测量并输入模型, 从而降低用户错误的可能性。这将消除对高技能光镜的需求, 而非洲一些地区目前缺乏2。由于简单, 昂贵的试剂和设备的需求也被消除, 因此诊断对患者来说几乎是免费的, 这是 pcr 的主要限制。这种结合将导致更多的患者更快进入诊断, 从而改善患者的结果。该技术具有极高的灵敏度潜力, 可以克服 rdt 的低灵敏度, 能够更早地检测到无症状的载体, 从而可作为筛选技术。此外, 该技术有可能用于其他疾病, 血液传播或其他疾病, 其中一些微升或微克可以应用于晶体。

但是, 在示例模型中, 在将其应用于字段之前, 需要解决许多问题。交叉验证是由于生物复制数量少, 这并不理想;相反, 有一个单独的验证集来测试模型要好得多。此外, rmsecv 在这里相当高, 使得较低的量化水平不可靠。增加复制的数量将提高此值, 必须在字段中使用此方法之前完成。这一点在实验室试验9中得到了证实, 因为样本量较大, rmsecv 的数量要低得多。除此之外, 增加间隔范围和点也将提高此值。为了进一步提高诊断能力, 应使用恶性疟原虫野生菌株, 因为 3d7恶性疟原虫菌株是实验室菌株, 由于表型的变化, 可能会呈现不同的化学成分。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

澳大利亚研究理事会 (未来研究金 ft120100926 至 brw)、澳大利亚国家卫生和医学研究理事会 (jgb 的方案赠款和高级研究金) 向提交人提供了资金;早期职业研究金向伯内特研究所提供的研究所基础设施支助计划赠款), 以及维多利亚州政府向伯内特研究所提供的业务基础设施支助赠款。我们感谢芬雷·尚克斯先生的有力支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Donor blood - - Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood Australian Red Cross` -
3D7 Plasmodium falciparum The Burnet Institute - Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich R6504
Albumax (Gibco) Thermofisher E003000PJ Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Giemsa Stain Sigma Aldrich 48900
Sorbitol Sigma Aldrich S1876 Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers) Becton, Dickonson and Company 367671
Immersion Oil Thermofisher M3004
50 mL culture dishes Falcon 353025
25mL pipette tips Falcon 357515
10mL pipette tips Falcon 357530
Microscope Slides Sigma Aldrich S8902
Centrifuge tubes 50 mL Sigma Aldrich T2318
Automated pipette controller Integra-biosciences 155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge Thermofisher 75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators Thermofisher 310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope Nikon Instruments E100_2CE-MRTK-1 When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment Bruker 9308-3700 Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab Mathworks Inc Multivariate data analysis software
The Unscrambler X CAMO Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox Mathworks, Inc. GUI for Matlab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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衰减全反射红外光谱和多变量数据分析检测和定量水红血球中恶性<em>疟原虫</em>
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Cite this Article

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).More

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).

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