Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in waterige rode bloedcellen door verzwakt totale reflectie infraroodspectroscopie en Multivariate Data-analyse

doi: 10.3791/56797 Published: November 2, 2018

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in besmette waterige rode bloedcellen, met behulp van een verzwakte totale reflectie infrared spectrometer en multivariate data-analyse.

Abstract

We tonen een methode voor de kwantificering en opsporing van parasieten in waterige rode bloedcellen (RBC) met behulp van een eenvoudige benchtop verzwakt totale reflectie Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) spectrometer in combinatie met Multivariate Data-analyse ( MVDA). 3D 7 P. falciparum werden gekweekt voor 10% parasitemia ring fase parasieten en gewend spike verse donor geïsoleerd RBC een verdunning als reeks wilt maken tussen 0 – 1%. 10 µL van elk monster werden geplaatst in het midden van het venster van de diamant ATR te verwerven van het spectrum. De sample data werd behandeld om de signaal / ruisverhouding en te verwijderen van de bijdrage van water, en vervolgens de tweede afgeleide werd toegepast om op te lossen van de spectrale eigenschappen. De gegevens werden vervolgens geanalyseerd met behulp van twee soorten MVDA: eerste belangrijkste componenten analyse (PCA) om uitschieters waarna gedeeltelijke regressie met kleinste kwadraten (PLS-R) om te bouwen van het model van de kwantificering.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Malaria is een van de meest verwoestende ziekten van onze tijd; meer dan de helft van de bevolking woont in endemische gebieden in gevaar en het onevenredig jaagt de slechte1,2,3,4. Een groot deel van het probleem is de asymptomatische dragers en vroege fase patiënten die fungeren als reservoirs voor mosquito vectoren5, waardoor pieken van infectie tijdens natte seizoenen en toestaand het om te volharden in gemeenschappen. Malaria wordt veroorzaakt door vijf Plasmodium parasieten, de meest dodelijke daarvan is P. falciparum , waardoor de meest ernstige vorm van de ziekte-2.

Technieken voor de diagnose van malaria zijn op dit moment minder dan perfect. Optische microscopie, de huidige gouden standaard, kan alleen detecteren 62-88 parasieten/µL afhankelijk van de gebruikte methode6. Bovendien, als gevolg van de intensiteit en de hoge vaardigheid vereist, in vele regio's microscopie misdiagnoses > 50% van de gevallen, vooral die met lage parasitemie niveaus2, die rechtstreeks kan worden toegeschreven aan het gebrek aan hulpbronnen in het gebied en de resultaten in het misbruik van anti-malaria drugs. De andere 2 belangrijkste diagnostische methoden zijn snelle Diagnostische Tests (RDTs), die gebruik maken van antilichamen voor de detectie, en Polymerase Chain Reaction (PCR) tests, die discrimineren en kwantificeren van parasieten uit DNA. Momenteel zijn RDTs uitsluitend kundig voor speurder P. falciparum en P. vivax van ten minste 100 parasieten/µL bloed wat resulteert in zeldzamere vormen van de ziekte worden onbehandeld. 7 , 8 daarentegen PCR testen discrimineren en kwantificeren van de verschillende soorten Plasmodium bij een gevoeligheid van 0.0004-5 parasieten/µL bloed. Echter, het dure reagentia, apparatuur en technische vaardigheid vereist, en is dus niet geschikt voor de toepassing van het veld.

Een zeer gevoelige, betrouwbare en betaalbare techniek is essentieel voor het verbeteren van de diagnose tijden, en dus betere geduldige resultaten en ziekteverwijdering mogelijk te maken. Verzwakte totale reflectie Fourier transformatie (ATR-FTIR) spectroscopie biedt een mogelijke oplossing voor dit probleem. Vorige werk heeft aangetoond dat het mogelijk was om detecteren en kwantificeren van P. falciparum in methanol vaste bloedfilms bereiken de detectiegrenzen van < 1 parasiet/µL bloed (< 0.0002% parasitemia)9, die vergelijkbaar met PCR methodes is. Recente studies hebben aangetoond dat het mogelijk is te detecteren en kwantificeren van parasieten in waterige monsters en dus het elimineren van de fixatie stap. Factoren zoals waterdamp, spectrale lawaai en gegevens behandeling moeten echter worden in aanmerking genomen voor optimale resultaten10.

Dit protocol heeft tot doel nieuwe gebruikers leert verwerven ATR-FTIR spectra en een regressiemodel voorbereiden met de opsporing van P. falciparum van waterige rode bloedcellen (RBC) monsters10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Raadpleeg de juiste Material Safety Data Sheets (MSDS) en zoeken passende Biosafety Level 2 (BSL-2) opleiding. Alle kweken stappen moeten worden gedaan in een kast van BSL-2 met behulp van aseptische techniek, wat betekent dat er een risico van blootstelling aan schadelijke UV-straling van de decontaminatie stappen, naald stick verwondingen, en potentiële biologische blootstelling en infectie als de cultuur van de parasiet eventuele verwondingen invoert. Bovendien, voorraad bloed van bloedbanken alleen vertoond voor bepaalde ziekten en de mogelijkheden voor het verspreiden van bloed overgedragen ziekten is een potentieel risico. Zoek onmiddellijk medische hulp in het voorkomen van letsel.

1. voorbereiding en meting van 3D 7 Plasmodium falciparum parasiet verdunningsreeks

Opmerking: Plasmodium sp. cultuur is zeer gevoelig. Gebruik vers/lopende reagentia en voeden van de parasieten regelmatig door het veranderen van de media. Feed culturen onder 5% parasitemia elke tweede dag; feed culturen tussen 6-10% parasitemia of twee keer per dag; en culturen tussen 11-20% tot 4 keer per dag voeden. Parasieten die beginnen te verhongeren zal verliezen hun vorm en beginnen te contracteren. In een dergelijk geval, voeden en Verdun onmiddellijk door het veranderen van de media en voorraad RBC. verzamelen het bloed van de donor in bloed collectie buizen met heparine als antistollingsmiddel en maatregel binnen de eerste 6 uur toe te voegen.

  1. Cultuur totaal 30 ml van 3D 7 stam Plasmodium falciparum parasieten volgens het standaardprotocol totdat de parasitemia bereikt 10% ringen.
  2. Synchronisatie van parasieten
    1. 11 uur na de shizogeny in de levenscyclus van de parasiet, resuspendeer de cultuur en de overdracht in een conische buis van 50 mL, met behulp van een geautomatiseerde precisiepipet.
    2. Centrifugeer de cultuur op 300-400 x g en standaard laboratoriumomstandigheden (25° C en 100 kPa) gedurende 5 minuten.
    3. Verwijder de bovendrijvende vloeistof door het opstellen met een pipet of met behulp van een pipet van Pasteur gekoppeld aan een vacuüm zonder de pellet te verstoren. Gooi afval media in een 10% bleekwater oplossing.
    4. Langzaam toevoegen van 12-15 mL van 4% sorbitol-oplossing aan de pellet met behulp van een geautomatiseerde precisiepipet en meng de cultuur door aftopping en omkeren van de buis totdat de cultuur homogeen is.
    5. Incubeer de cultuur bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
    6. Centrifugeer de cultuur op 300-400 x g en standaard laboratoriumomstandigheden gedurende 5 minuten.
    7. Verwijder het supernatant zoals beschreven in stap 1.2.3.
    8. 10 – 15 mL zoutoplossing 0,9% toevoegen aan de pellet en meng de oplossing door de aftopping en omkeren van de buis totdat de cultuur homogeen is.
    9. Herhaal de stappen 1.2.6–1.2.8 tweemaal meer te wassen van alle resten van sorbitol.
  3. Voorbereiding van de verdunningsreeks van parasitemia
    1. Wassen voorraad RBC zoals in stappen 1.2.6–1.2.9.
    2. Centrifugeer de cultuur op standaard laboratoriumomstandigheden, voorraad RBC bij 300 – 400 x g gedurende 5 min en weggeworpen zoals in stap 1.2.3.
    3. Label microcentrifuge buizen als 0, 0.010%, 0,025%, 0,075%, 0.100%, 0.250%, 0.750% tot 1.000%, en voeg µL van 0, 1 µL, 2.5 µL, 7,5 µL, 10 µL, 25 µL, 75 µL en 100 µL van cultuur respectievelijk met behulp van een pipet 0.2-20 µL.
    4. Voeg 100 µL, 99 µL, 97.5 µL, 92,5 µL, 80 µL, 75 µL, 25 en 0 µL van voorraad RBC buizen gelabelde 0% 0.010%, 0,025%, 0,075%, 0.100%, 0.250%, 0.750%, en 1.000%, respectievelijk.
    5. Centrifugeer het bloed van de vers van de donor verzameld in anticoagulatie buizen op 1.200 x g en standaard laboratoriumomstandigheden gedurende 10 minuten.
    6. Verwijder het plasma door het opstellen met een pipet en zoals beschreven in stap 1.2.3 te verwijderen.
    7. Voeg 900 µL van geïsoleerde RBC in elke buis microcentrifuge en meng door het omkeren van 10 x.
  4. Spectrale overname
    1. De begeleidende spectrale acquisitie-programma gebruikt, klikt u op "Instrument Set-Up" en de parameters-collectie ingesteld op het volgende: 128 scans voor achtergrond; 32 scans voor monster; en resolutie tot 8/cm over het maximale sample-bereik van het instrument.
    2. Stel de temperatuur van de ATR-FTIR spectrometer per fabrikant aanbeveling of 's nachts.
    3. Reinig het kristal door voorzichtig schrobben in een draaiende beweging met behulp van lint gratis doekjes getemperd met ultrazuiver water. Vervolgens grondig droog met behulp van een ander lint gratis veeg.
    4. Neem een meting van de achtergrond van de lucht door te klikken op "Achtergrond Measurement". Iedere 20 min, schoon het kristal zoals in stap 1.4.3 en herhaal deze meting.
    5. De live view openen door te klikken op 'Voorvertoning'. Observeer een platte, horizontale basislijn die aangeeft dat het kristal schoon is.
    6. Pipetteer 10 µL van gedeïoniseerd water rechtstreeks naar het midden van het kristal en klik op "Maatregel voorbeeld". Herhaal deze meting water na elke vijfde sample.
    7. Droog het kristal met behulp van de gratis wissen van een lint en een zachte cirkelmotie.
    8. Pipetteer 10 µL van monster en klik op "Maatregel voorbeeld".
    9. Reinig het kristal tussen monsters zoals in stap 1.4.3.
    10. Herhaal deze stappen totdat 3 replicatieonderzoeken worden overgenomen, ervoor zorgend om de volgorde van zowel de monsters en de replicaten randomize.

2. multivariate Data-analyse (MVDA)

Opmerking: Gegevensverwerking moet worden gedaan over de gehele dataset om te voorkomen dat lawaai en de toevoeging van pieken van niet-biologische oorsprong. In tegenstelling, analyseren over de biologisch relevante regio's: 2980-2800/cm en 1750-850/cm.

  1. Gegevensverwerking
    Opmerking: Twee software, bijvoorbeeld Matlab (voortaan aangeduid als de software 1) en de Chemometrie X (voortaan aangeduid als de software 2) worden gebruikt als voorbeelden voor MVDA. 1 software heeft de mogelijkheid van het uitvoeren van MVDA zonder de toevoeging van een grafische gebruikersinterface (GUI). Het is echter raadzaam om te kopen een GUI (Tabel van materialen). De volgende instructies wanneer met betrekking tot software 1 zal veronderstellen dat is samen met de commercieel beschikbare GUI toolbox, en het voorbeeldscript voor de behandeling van de gegevens is gekoppeld.
    1. De geschikte multivariate data analysesoftware niet openen, klik op "Gegevens importeren" en selecteer het type bestand voor analyse.
      1. In software 1, kunt u het "Analyse" ingevoerd door het opdrachtvenster te openen van de GUI. Klik met de rechtermuisknop het X-vak om te zoeken naar "Gegevens importeren".
      2. In software 2, klikt u op het tabblad "Bestand" om te vinden "Importeren".
    2. Importeer spectra van het monster, water en basislijn als gegevenssets in de werkruimte door alle spectra in elke reeks afzonderlijk te selecteren en te klikken op "Open" en geef elke set een korte naam, bijvoorbeeld 'wat' voor dataset van water spectra.
    3. Selecteer nieuwe tabel/matrix door te klikken op "nieuwe Matrix/Vector" en genereren een n × 1 vector, waarbij n staat voor het aantal monsters. De parasitemia van elk monster input en geven de vector de naam 'Parasitemia'.
      1. In software 1, klikt u op "Nieuwe variabele" in het opdrachtvenster.
      2. Software 2, klik op het pictogram "Nieuwe Matrix".
    4. Gegevens uitzetten door te klikken op de "Plot gegevens pictogram". Inspecteer de spectra voor waterdamp effecten door te klikken op "Zoom" en inzoomen op 1800-1400/cm; duidelijkst waargenomen als korte, scherpe, smalle pieken langs de hellingen van het amide ik en amide II bands.
    5. In gevallen van extreme waterdamp, tabblad bewerken/pre-proceskleuren gegevens openen, en selecteer "Smoothing". Verminderen van het lawaai en/of sterke waterdamp bijdragen door de spectra van het monster en water met behulp van maximaal 25 punten voor smoothing of een waterdamp correctie methode gebruiken.
    6. Juist niet-horizontale basislijn met behulp van de basislijn correctie algoritme indien van toepassing, onder het zelfde lusje van het bewerken/pre-proceskleuren gegevens in stap 2.1.4.
    7. Gemiddelde water spectra en kopieer de rijen in een n × m matrix gelijk is aan het monster dataset en brengen tot 70% intensiteit door vermenigvuldiging met 0,7.
      1. In software 1, doen in het opdrachtvenster door het invoeren van het volgende script "AverageWater=mean(WaterDataset)". Vervolgens kopieer-plak de rijen zodat deze overeenkomen met de verzameling voorbeeldgegevens. Verklein de intensiteit en input "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".
    8. Gemiddelde water spectra van elk monster spectrum aftrekken.
      1. In software 1, doen in het opdrachtvenster door het invoeren van het volgende script "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".
    9. Open het tabblad bewerken/pre-proceskleuren gegevens toe te passen van een tweede afgeleide functie, en vervolgens de gegevens normaliseren door één normale variate (SNV) functie te selecteren en center gegevens betekenen.
      1. In software 1, kunt u dat doen in een keer. Selecteer eerst "Afgeleide", en ingang 25 punten van vloeiend maken, polynomiale rangorde 3 en afgeleide orde op het monster ingesteld met behulp van 25 punten vloeiend en een Savitzky-Golay-functie. Selecteer vervolgens "SNV" en "Betekenen Center". Klik op "Oke/Apply".
    10. Open het tabblad bewerken/pre-proceskleuren gegevens en "Kolom variabelen", Selecteer in 2,980 – 2.800/cm en 1.750-850/cm door ervoor te zorgen dat alleen hun vakjes zijn aangevinkt.
  2. Data-analyse
    1. Hoofdcomponentenanalyse (PCA)
      1. Klik op "analyse | Decompositie"en selecteer partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst.
        1. In software 1, klikt u op "Build Model".
        2. Input in software 2, de methoden van de partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst. Ingang van het optimale aantal onderdelen van de opdrachtgever (PC's) - in dit werk, 7 - en een maximum van 100 iteraties en selecteer Kruis-validatie voor de validatiemethode wordt gebruikt. Klik "Run".
      2. De begrenzing van het vertrouwen van 95%, de onderbroken ring, op het perceel van de scores tussen PC1 en PC2 observeren.
      3. Mark de spectra van het monster met scores die zich voordoen buiten de limiet als potentiële uitschieters met behulp van de "Selecteer Spectra Tool".
      4. Als de gemarkeerde spectra hoog uitsluiten Hotellings T2 -waarden en hoge Q storingswaarden hen van verdere analyse.
    2. Gedeeltelijke Least Squares Regression (PLS-R)
      1. Klik op "analyse | Regressie"en selecteer"PLS-R".
        1. Klik in software 1, recht op Y blok en selecteer de vector "Parasitemia | Bouwen van het Model".
        2. Input in software 2, de methoden van PLS-R. Selecteer de vector "Parasitemia" als de "Y verwijzing" en de dataset monster als "X Data Set" en selecteer Kruis-validatie als de validatiemethode wordt gebruikt. Klik "Run".
      2. Analyseren van het regressiemodel. R-2 waarden over 0,80 en kwadratische gemiddelde fout van cross-validatie (RMSECV) waarden die kleiner dan 0,1% parasitemia zijn zijn aanvaardbaar modellen.
      3. De regressie-vector analyseren en identificeren van de biologische bands.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gedeeltelijke kleinste kwadraten (PLS-R) uitzetten en de bijbehorende regressie vector, Figuur 1a en 1b respectievelijk, laten zien dat het signaal van parasieten onderscheiden genoeg van de RBC die ze kunnen worden gebruikt om de vorm een lineaire regressie model moet worden gebruikt voor de voorspelling van parasieten in toekomstige gegevensverzamelingen.

Een robuuste, lineaire PLS-R-model is gegenereerd met een R-kwadraat van 0,87 en een root-mean squared cross validatiefout (RMSECV) van 0,13% parasitemia, Figuur 1a. Toenemende parasitemia niveaus worden vooral geassocieerd met nucleïnezuur bands, vooral 1042, 1083 1226/cm, die zijn toegewezen aan de ν(C=O) van het RNA-ribose groep, νs(PO4 -) en νeen(PO4 -) respectievelijk, en vormen het grootste negatieve gedeelte van de regressie-vector. Dit is omdat de RBC ontbreken een kern en dus nucleic zuren zijn sterke indicatoren voor de parasieten. Bovendien is de 1226/cm band geeft aan dat de structuur de vorm van een B-DNA, waarin wordt gewezen op het belang heeft van het meten in de waterige staat12. In tegenstelling, parasieten consumeren RBC componenten, voornamelijk hemoglobine, en dus een hogere eiwit lipide verhouding naar verwachting in niet-geïnfecteerde RBC zoals aangegeven door lipide balken 2913, 2879 en 1397 cm-1 en 1631 en 1555 cm-1 uit het amide ik en amide II modi12,13.

De verschillende bands tonen duidelijk aan dat de signalen echte biologische bands zijn in plaats van differentiatie op basis van valse banden van niet-biologische oorsprong zoals waterdamp, die als smalle en intense bands presenteren. In het bijzonder kan de aanwezigheid van DNA bands, tabel 1, rechtstreeks worden toegeschreven aan de parasiet11,12,13. In het algemeen, kan de regressie-vector worden geïnterpreteerd op een gelijkaardige manier aan belastingen in de partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst. Banden moeten correleren goed met bands en verschuivingen van de oorspronkelijke spectra.

Figure 1
Figuur 1: PLS-R regressie plot, onder a, van de RBC spiked tussen 0 – 1% parasitemia en bijbehorende regressie-coëfficiënt, (b). De regressie plot toont het vermogen van het model om te voorspellen van de parasitemia in elk monster, met het bekende parasitemia op de x-as en de voorspelde parasitemia op de y-as. De regressie-coëfficiënt beschrijft de bijdrage van elke band aan het voorspellend vermogen van het model, hoe intenser de band is meer het bijdraagt aan het model en dus hoe de parasiet verandert de chemische samenstelling van het bloed. Gereproduceerd en gewijzigde van Martin, M. et al. 10 met toestemming van de Royal Society of Chemistry. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Regressie-coëfficiënt Band (cm-1) Assignment25-27
2929 ΝaCH2 van lipiden, parasiet
2913 ΝaCH2 van lipiden, rode bloedcel
2879 ΝsCH3 van lipiden, rode bloedcel
2861 ΝsCH2 van lipiden, parasiet
1707 B-DNA/A-DNA basenpaar trillingen νC = O & νC = N, parasiet
1652 Amide I van α-helix eiwitten, parasiet
1631 Amide I van β-geplooid blad eiwitten, rode bloedcel
1584 ΝC = N van imidazolen in nucleïnezuren, parasiet
1555 Amide II uit eiwitten, rode bloedcel
1530 Amide II, parasiet
1423 B-DNA desoxyribose, parasiet
1397 Ν(COO-) van lipiden, rode bloedcel
1226 ΝaPO4-van B-DNA, parasiet
1184 B-DNA desoxyribose, parasiet
1083 ΝaPO4-van DNA, parasiet
1042 ΝC = O van RNA ribose, parasiet

Tabel 1: toewijzingen van bands in een regressie-coëfficiënt van PLS-R op spectra van malaria spiked RBC. In PLSR, wordt de waarde van de parasitemia die hoort bij een spectrum berekend door vermenigvuldiging van het voorverwerkte spectrum door de regressie-vector. Vandaar, de regressie-vector beschrijft het belang en de richting van de IR-bands in een regressie. Omdat spectra met behulp van de tweede afgeleide voorverwerkt waren, zijn negatieve bands geassocieerd met een hogere parasitemia terwijl positieve bands geassocieerd met een lage parasitemia zijn. Gereproduceerd en gewijzigde van Martin, M. et al. 10 met toestemming van de Royal Society of Chemistry.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PLS-R-model is een gecontroleerde multivariate methode waarmee wordt gezocht naar een lineaire relatie, Y = bX + E, tussen de voorspellende variabelen X (hier, de absorptie bij elke golfgetal) en een continu variabele Y (hier, het niveau van de parasitemia). Kortom, het model combineert de variabelen in X bij het maken van een nieuwe reeks van latente variabelen (LVs) die de variantie in X gecorreleerd met Y vangen, en berekent de vector van een regressie (b) een nieuwe resultaten van het spectrum in de schatting van de y-waarde vermenigvuldigd. De kracht van het model kan worden genomen van twee waarden: de R2 waarde en de waarde van de kwadratische gemiddelde fout van Cross validatie (RMSECV). De voormalige beschrijft de lineariteit van het model en dus de robuustheid (hoe dichter is aan 1 hoe beter) en gegevens voor modellen met een R2 waarde van minder dan 0,8 moet zorgvuldig worden herzien voor de uitschieters en lawaaierige gegevens. De waarde van de RMSECV beschrijft de fout waarop de voorspelling kan worden gemaakt. Het is altijd het beste om te proberen en dit nummer zoveel mogelijk te minimaliseren door ervoor te zorgen om uit te sluiten van uitschieters, zorgvuldig behandelen de gegevens en om ervoor te zorgen dat er zo veel biologische replicatieonderzoeken mogelijk zijn.

Het is dus noodzakelijk dat gegevens van goede kwaliteit zijn verworven voor de bouw van het model. Voorbereiding van de verdunningsreeks is van cruciaal belang; specifiek om ervoor te zorgen dat elk monster RBC zo homogeen mogelijk is. Met behulp van de pipet te stellen en uitwerpen van de RBC een paar keer tijdens het zwenken of zachtjes flicking het uiteinde van de buis microcentrifuge 5-10 keer, zal de inconsistenties worden vermeden. In dezelfde geest is het ook cruciaal voor het reinigen van het kristal tussen elk monster om verontreiniging te voorkomen. Met behulp van ultra puur water en lint gratis veegt schoon het kristal en controleren dat de basislijn plat is te maken zorgt ervoor dat er geen residuen die de volgende monster meting zal vervuilen.

Het aantal biologische monsters nodig zijn voor een model dat is van toepassing in het veld is ten minste 30 per voorwaarde die is gevalideerd met een gegevensset van een vergelijkbaar aantal. Deze aanzienlijke omvang zou een aanzienlijk bedrag voor het genereren en dit is dus de beperking van de techniek. Evenwel als meer monsters worden correct geanalyseerd kunnen worden toegevoegd aan het voorspellend model en versterken. Dus, zodra vastgesteld, het model nauwkeuriger kan worden en de inspanning die nodig is te stellen kan rechtvaardigen.

Afhankelijk van het milieu en de instrumentatie waarop metingen, kunnen diverse verdere problemen ontstaan. Als de beamline niet volledig is afgesloten in het instrument, kunnen wat betekent dat de gewrichten zijn niet luchtdicht of het ATR-venster is uitwisselbaar met andere compartimenten van de steekproef, ethanol en waterdamp besmetten de spectra. Ethanol wordt weergegeven als een sterke scherpe band rond 1.070/cm 14. Dit kan vermeden worden door meten in een ruimte vrij van ethanol en ontsmetten van het instrument slechts eenmaal alle metingen zijn verricht. Waterdamp wordt veroorzaakt door veranderingen in de atmosfeer en wordt weergegeven als kleine scherpe positieve en negatieve pieken rond 1400-1800 /cm en 3200-3.600/cm. Dit kan worden opgelost door het verhogen van de frequentie van de achtergrondmetingen en het zuiveren van het instrument met stikstof. In gevallen waar permanent verwijderen is niet beschikbaar en de waterdamp is nog steeds vrij sterk, kan vloeiend maken van algoritmen en waterdamp compensatie worden toegevoegd aan pre gegevensverwerking om ze te verwijderen.

Deze techniek heeft veel van belofte voor toekomstige diagnostiek en patiëntenoutcomes. Ten eerste, de methode is over het algemeen zeer eenvoudig te implementeren in dat het monster moet alleen worden pipetted op de ATR-crystal en vervolgens rechtstreeks kan worden gemeten en het verminderen van de mogelijkheden voor de gebruikersfout model worden ingevoerd. Dit zou elimineren de noodzaak voor hoogopgeleide lichte microscopist, die momenteel in sommige regio's van Afrika ontbreken2. Als gevolg van de eenvoud, de behoefte aan dure reagentia en apparatuur is eveneens geëlimineerd, en dus de diagnose zou vrijwel kosteloos voor patiënten, die de grote beperking voor PCR is. Deze combinatie zou leiden tot hogere aantallen patiënten voor diagnose veel sneller en dus betere geduldige resultaten komen. De techniek heeft de potentie voor extreem hoge gevoeligheden die de lage gevoeligheden van RDTs zou overwinnen en zou kundig voor speurder asymptomatische dragers eerder en dus kunnen worden gebruikt als een screening-techniek. Bovendien is de techniek heeft het potentieel om te worden gebruikt voor andere ziekten, bloed gedragen of anderszins, waar een paar microliters of microgram kan worden toegepast op het kristal.

In het voorbeeld-model zijn er echter vele dingen die worden aangepakt moeten voordat het kan worden toegepast in het veld. Cross validatie is een vanwege het lage aantal biologische wordt gerepliceerd en dat is niet ideaal; eerder hebben een aparte validatie instellen om te testen het model in plaats daarvan is veel beter. Bovendien, de RMSECV is vrij hoog hier maken de lagere niveaus van kwantificering onbetrouwbaar. Verhoging van het aantal replicatieonderzoeken deze waarde zal verbeteren en moeten worden uitgevoerd voordat deze methode in het veld in dienst. Dit wordt bevestigd in het laboratorium proeven9, waar RMSECV veel lager vanwege de grotere steekproefomvang was. Naast dit verbetert verhoging van het interval bereik en punten ook deze waarde ook. Naar verdere verbetering van de diagnostische mogelijkheden, wilde stammen van P. falciparum moeten worden toegepast, zoals de 3D-7 P. falciparum is een laboratorium spanning en een verschillende chemische samenstelling wegens verschillen in fenotype kunnen opleveren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Aan de auteurs financiering werd verstrekt door de Australian Research Council (toekomst Fellowship FT120100926 aan BRW), nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad van Australië (Program grant en Senior Research Fellowship aan JGB; Vroege carrière Fellowships JSR; Infrastructuur voor onderzoek instituten ondersteuning regeling subsidie aan het Instituut Burnet), en de Victoriaanse staat regering operationele infrastructuur ondersteuning subsidie aan het Instituut Burnet. Wij erkennen Mr. Finlay Shanks voor instrumentele ondersteuning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Donor blood - - Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood Australian Red Cross` -
3D7 Plasmodium falciparum The Burnet Institute - Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich R6504
Albumax (Gibco) Thermofisher E003000PJ Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Giemsa Stain Sigma Aldrich 48900
Sorbitol Sigma Aldrich S1876 Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers) Becton, Dickonson and Company 367671
Immersion Oil Thermofisher M3004
50 mL culture dishes Falcon 353025
25mL pipette tips Falcon 357515
10mL pipette tips Falcon 357530
Microscope Slides Sigma Aldrich S8902
Centrifuge tubes 50 mL Sigma Aldrich T2318
Automated pipette controller Integra-biosciences 155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge Thermofisher 75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators Thermofisher 310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope Nikon Instruments E100_2CE-MRTK-1 When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment Bruker 9308-3700 Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab Mathworks Inc Multivariate data analysis software
The Unscrambler X CAMO Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox Mathworks, Inc. GUI for Matlab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Arnold. Great Britain. 361 (1998).
  2. World Health Organization. World Malaria Report 2016. (2016).
  3. Rogers, W. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. American Society for Microbioogy, USA. 1355 (1999).
  4. White, N. J. Chapter 9. Manson's Tropical Infectious Diseases. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).
  5. Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11, (6), 623-639 (2013).
  6. Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18, (9), 395-398 (2002).
  7. Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13, (1), 234-241 (2014).
  8. World Health Organisation. Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). (2014).
  9. Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
  10. Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142, (8), 1192-1199 (2017).
  11. Fabian, H., Mäntele, W. Handbook of Vibrational Spectroscopy. John Wiley & Sons, Ltd. (2006).
  12. Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39, (13), 5439-5448 (2011).
  13. Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
  14. Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48, (4), (1952).
Detectie en kwantificering van <em>Plasmodium falciparum</em> in waterige rode bloedcellen door verzwakt totale reflectie infraroodspectroscopie en Multivariate Data-analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).More

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter