Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Gjenkjennings- og kvantifisering av Plasmodium falciparum i vandig røde blodceller av dempes totale refleksjon infrarødspektroskopi og multivariabel analyse

doi: 10.3791/56797 Published: November 2, 2018

Summary

Her presenterer vi en protokoll av kvantifisering av Plasmodium falciparum i infiserte vandig røde blodlegemer bruke dempes totale refleksjon infrarød spectrometer og multivariat dataanalyse.

Abstract

Vi viser en metode for kvantifisering og påvisning av parasitter i vandig røde blodlegemer (RBCs) ved hjelp av en enkel Borstemmaskin dempes totale refleksjon Fourier transformere infrarød (ATR-FTIR) spectrometer sammen med multivariabel analyse ( MVDA). 3D 7 P. falciparum ble kultivert for 10% parasitemia ring scenen parasitter og brukes å pigge frisk donor isolert RBCs for å opprette en fortynning mellom 0-1%. 10 µL av hvert utvalg plassert på midten av vinduet ATR diamant å erverve spekteret. Eksempeldataene ble behandlet til å forbedre signal til støyforhold og fjerne bidrag av vann, og deretter den andre deriverte ble brukt til å løse spectral funksjoner. Dataene ble deretter analysert ved hjelp av to typer MVDA: første viktigste komponenten analyse (PCA) til å fastslå eventuelle outliers og deretter delvis minste kvadrater regresjon (PLS-R) å bygge kvantifisering modell.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Malaria er blant de mest ødeleggende sykdommene i vår tid; over halvparten av befolkningen lever i faresonen i endemiske områder og det byrder uforholdsmessig dårlig1,2,3,4. En stor del av problemet er asymptomatisk bærere og tidlig stadium pasienter som reservoarer for mygg vektorer5, forårsaker pigger av infeksjon i våte sesonger og tillater den å vedvare i fellesskap. Malaria skyldes fem Plasmodium parasitter, den mest dødelige som er P. falciparum som forårsaker den strengeste formen av sykdom2.

Foreløpig er teknikker for diagnostisering av malaria mindre enn perfekt. Optisk mikroskopi, gjeldende gull standard, kan bare oppdage 62-88 parasitter/µL avhengig av oppfølgingsmetoden6. Videre, på grunn av sier og høye ferdigheter som kreves, i mange regioner mikroskopi misdiagnoses > 50% av tilfellene, spesielt de med lav parasitaemia nivå2, som kan direkte tilskrives mangel på ressurser i området og resultater i misbruk av anti-malarial medikamenter. De andre 2 viktigste diagnostiske metodene er rask diagnostiseringstester (RDTs), som utnytter antistoffer for deteksjon og Polymerase kjedereaksjon (PCR) analyser, som diskriminerer og kvantifisere parasitter fra DNA. Foreløpig er RDTs bare kjøpedyktig merker P. falciparum og P. Samsung av minst 100 parasitter/µL av blod som resulterer i sjeldne former av sykdommen som ubehandlet. 7 , 8 i kontrast, PCR analyser diskriminere og kvantifisere ulike arter av Plasmodium på en følsomhet på 0,0004-5 parasitter/µL av blod. Men det krever dyre reagenser, utstyr og tekniske ferdigheter, og dermed er ikke egnet for programmet feltet.

En svært følsom, pålitelig og rimelig teknikk er viktig å bedre diagnose ganger, og dermed bedre pasientens utfall og gjør sykdommen eliminering mulig. Dempes totale refleksjon Fourier transform (ATR-FTIR) spektroskopi tilbyr en mulig løsning på dette problemet. Tidligere arbeid har vist at det var mulig å oppdage og kvantifisere P. falciparum i metanol fast blod filmer å oppnå oppdagelsen grensene for < 1 parasitten/µL av blod (< 0.0002% parasitemia)9, som er sammenlignbare med PCR metoder. Nyere studier har vist at det er mulig å oppdage og kvantifisere parasitter i vandig prøver og dermed eliminerer fiksering trinnet. Faktorer som vanndamp, spectral støy og data behandling må imidlertid tas i betraktning for optimale resultater10.

Denne protokollen skal vise nye brukere hvordan du anskaffer ATR-FTIR spectra og forberede en regresjonsmodell for påvisning av P. falciparum vandig røde blodlegemer (RBC) prøver10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vennligst kontakt riktig Material Safety Data ark (MSDS) og søke riktig grad 2 (BSL-2) trening. Alle culturing skritt må gjøres i en BSL-2 skap bruker steril teknikk, betyr det er en risiko for eksponering for skadelige UV-stråling fra dekontaminering skritt, nål-stick skader, og berøres av biologiske og infeksjon hvis parasitten kultur inn noen skader. Videre er lager blod fra blodbanker er bare vist for enkelte sykdommer og potensialet for spredning blod båret sykdommer en potensiell risiko. Oppsøk øyeblikkelig medisinsk hjelp i forekomsten av skade.

1. forberedelse og måling av 3D 7 Plasmodium falciparum parasitten fortynning serien

Merk: Plasmodium sp. kultur er svært følsom. Bruke friske/ikke utløpt reagenser og mate parasitter regelmessig ved å endre media. Mate kulturer under 5% parasitemia hver andre dag; mate kulturer mellom 6-10% parasitemia en eller to ganger dag; og mate kulturer mellom 11-20% til 4 ganger om dagen. Parasitter som begynner å sulte vil miste fasongen og begynne å kontrakt. I slike tilfeller fôr og fortynne umiddelbart ved å endre media og legge lager RBCs. samle donor blodet i blod samling rør som inneholder heparin som antikoagulerende og innenfor første 6 h.

  1. Kultur totalt 30 mL av 3D 7 belastning Plasmodium falciparum parasitter i henhold til standard protokoll til parasitemia når 10% ringer.
  2. Synkronisering av parasitter
    1. 11 h etter shizogeny i parasitten livssyklusen, resuspend kultur og overføre til en 50 mL konisk rør med en automatisk pipette.
    2. Sentrifuge kulturen på 300-400 x g og standard laboratorieforhold (25° C og 100 kPa) i 5 min.
    3. Fjerne nedbryting ved å trekke det opp med en pipette eller en Pasteur pipette knyttet til et vakuum uten å forstyrre pellet. Kaste avfall medier til en 10% blekemidler løsning.
    4. Sakte legge til 12-15 mL 4% sorbitol løsning pellets med en automatisk pipette og bland kulturen av capping og invertere røret til kulturen er homogen.
    5. Inkuber kulturen på 37 ° C i 15 min.
    6. Sentrifuge kulturen på 300-400 x g og standard laboratorieforhold i 5 min.
    7. Fjern nedbryting som beskrevet i trinn 1.2.3.
    8. Legge til 10-15 mL 0,9% saltløsning i pellet og bland løsningen av capping og invertere røret til kulturen er homogen.
    9. Gjenta trinn 1.2.6–1.2.8 to ganger mer å vaske alle rester av sorbitol.
  3. Utarbeidelse av parasitemia fortynning serien
    1. Vask lager RBCs som trinn 1.2.6–1.2.9.
    2. Sentrifuge kulturen på standard laboratorieforhold, lager RBCs 300-400 x g i 5 min og kast nedbryting som i trinn 1.2.3.
    3. Etiketten microcentrifuge rør som 0% 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0.250%, 0.750% og 1,000%, og legge 0 µL, 1 µL, 2,5 µL, 7,5 µL, 10 µL, 25 µL, 75 µL og 100 µL av kultur henholdsvis bruker en 0,2-20 µL pipette.
    4. Legg 100 µL 99 µL 97.5 µL, 92.5 µL, 80 µL, 75 µL, 25 og 0 µL av lager RBCs rør merket 0%, 0.010%, 0.025%, 0.075%, 0.100%, 0.250%, 0.750% og 1,000%, henholdsvis.
    5. Sentrifuger frisk donor blod samles i antikoagulerende rør på 1200 x g og standard laboratorieforhold i 10 min.
    6. Fjerne plasma ved å trekke det opp med en pipette og forkaster som beskrevet i trinn 1.2.3.
    7. Legge til 900 µL av isolerte RBCs i hver microcentrifuge rør og bland godt ved å snu 10 x.
  4. Spectral oppkjøp
    1. Bruker det medfølgende spectral oppkjøpet programmet, klikk "Instrument oppsett" og angi samling dataparametrene følgende: 128 avsøker for bakgrunn; 32 avsøker for eksempel; og oppløsning 8/cm over maksimal eksempel området av instrumentet.
    2. Still inn temperaturen av ATR-FTIR spectrometer per produsentens anbefaling eller over natten.
    3. Rengjør krystall ved forsiktig skrubbe i en sirkulær bevegelse med lo gratis kluter fuktet med ultrapure vann. Tørk grundig bruker en annen lo gratis tørke.
    4. Ta en bakgrunn måling av luften ved å klikke "Bakgrunn Measurement". Hvert 20 min, ren krystall som i trinn 1.4.3 og gjenta målingen.
    5. Åpne live view ved å klikke "Preview". Observere en flatt, Vannrett grunnlinje som angir at krystallen er ren.
    6. Pipetter 10 µL deionisert vann direkte på midten av krystall og klikk "Mål Sample". Gjenta vann målingen etter hver femte prøven.
    7. Tørr krystall lo gratis tømming og en mild sirkelbevegelse.
    8. Pipetter 10 µL av prøve og klikk "Mål Sample".
    9. Rengjør krystall mellom eksempler som trinn 1.4.3.
    10. Gjenta til 3 gjentak er ervervet, gjør at randomize rekkefølgen på både prøvene og gjentak.

2. multivariat dataanalyse (MVDA)

Merk: Data behandling må gjøres over hele datasettet for å unngå støy og tillegg av toppene av ikke-biologisk opprinnelse. I kontrast, analysere over biologisk relevante regioner: 2980-2800/cm og 1750-850/cm.

  1. Behandling av personopplysninger.
    Merk: To programvare, f.eks Matlab (heretter referert til som programvare 1) og Unscrambler X (heretter referert til som programvare 2) brukes som eksempler for MVDA. Programvare 1 har evnen til å utføre MVDA uten tilsetning av et grafisk brukergrensesnitt (GUI). Men anbefales det å kjøpe en GUI (Tabell for materiale). Instruksjonene nedenfor når du refererer til programvare 1 overtar som er i forbindelse med kommersielt tilgjengelig GUI verktøykassen og eksempelskriptet data behandling er tilknyttet.
    1. Åpne den aktuelle multivariable analyse programvaren, klikk "Importer Data" og Velg filtypen for analyse.
      1. I 1-programmet inn "Analyse" kommandovinduet til åpne GUI. Høyreklikk på X-boksen for å finne "Importer Data".
      2. Klikk kategorien "Fil" finne "Import" i 2-programvaren.
    2. Importere eksempel, vann og planlagte spectra som datasett til arbeidsområdet ved å velge alle spektra i hvert sett separat og klikke "Åpne" og gi hvert sett et kort navn, f.eks "wat" for dataset til vann spectra.
    3. Velg ny tabell/matrise ved å klikke "ny matrise/vektor" og generere en n × 1 vektor, der n er antall utdrag. Input parasitemia av hver prøve og gi vektoren navnet 'Parasitemia'.
      1. Klikk "Ny Variable" i kommandovinduet i programvare 1.
      2. Klikk på ikonet "Nye Matrix" i 2-programvaren.
    4. Tegne inn data ved å velge "Plot Data". Inspisere spectra for vanndamp effekter ved å klikke "Zoom" og zoome inn på 1800-1400/cm; mest tydelig observert som kort, skarp, trange topper langs bakken av amid jeg og amid II band.
    5. I tilfeller av ekstreme vanndamp, åpne Rediger/pre-prosessfarger data-kategorien, og velg "Mykere". Reduserer støy og/eller sterk vanndamp bidrag av utjevning til prøve og vann spectra med opptil 25 poeng av jevne eller bruke en vanndamp korreksjon metoden.
    6. Riktig ikke er horisontale opprinnelig plan ved hjelp av planlagte korrigeringsalgoritme behov under samme Rediger/pre-prosessfarger data-kategorien i trinn 2.1.4.
    7. Gjennomsnittlig vann spectra og kopiere radene i en n × m matrise tilsvarer for eksempel datasettet og redusere det til 70% intensitet ved å multiplisere det med 0,7.
      1. I software 1, gjøre det i vinduet ved å legge inn følgende skript "AverageWater=mean(WaterDataset)". Deretter Kopier-lim radene for å matche data eksempelsettet. For å redusere intensiteten, input "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".
    8. Trekk gjennomsnittlig vann spectra fra hver prøve spekteret.
      1. I software 1, gjøre det i vinduet ved å legge inn følgende skript "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".
    9. Åpne kategorien Rediger/pre-prosessfarger data for å bruke en andre deriverte funksjonen, og deretter normaliserer dataene ved å velge én vanlig variere (SNV) funksjon og mener center data.
      1. I software 1, kan du gjøre det på en gang. Merk "Avledet", og input 25 poeng utjevning, polynom-ordenen 3 og avledede orden på prøven ved å bruke 25 poeng av jevne og Savitzky-Golay funksjon. Velg deretter "SNV" og "Mener Center". Klikk "OK/bruk".
    10. Åpne kategorien Rediger/pre-prosessfarger data og "Kolonnen variabler", Velg 2980-2800/cm og 1,750-850/cm å sørge for at bare boksene er krysset.
  2. Dataanalyse
    1. Viktigste komponenten analyse (PCA)
      1. Klikk "analyse | Nedbrytningen"og velg PCA.
        1. Klikk "Bygge modell" i programvare 1.
        2. Inndatametoder PCA i 2-programvaren. Input optimalt antallet rektor komponenter (stk.) - i dette arbeidet, 7 - og maksimalt 100 gjentakelser og velg kryss-validering for Valideringsmetoden. Klikk "Kjør".
      2. Observere 95% tillit grensen, stiplet ringen, på score tomten mellom PC1 og PC2.
      3. Merke til eksempel spectra med score som oppstår utenfor som potensielle outliers bruke "Merk Spectra verktøyet".
      4. Hvis de merkede spectra har høy utelukke Hotellings T2 -verdier og høy Q rest dem fra videre analyse.
    2. Delvis minste kvadrater regresjon (PLS-R)
      1. Klikk "analyse | Regresjon"og velg"PLS-R".
        1. Høyre klikk Y blokk i programvare 1, og velg vektoren "Parasitemia | Bygge modell".
        2. Inndatametoder PLS-R i 2-programvaren. Velg vektoren "Parasitemia" som "Y referanse" og prøve datasettet som "X Data Set" og velg kryss-godkjenningen som Valideringsmetoden. Klikk "Kjør".
      2. Analysere regresjonsmodellen. R2 verdier over 0,80 og rot betyr kvadratisk feil av kryss-validering (RMSECV) verdier som er mindre enn 0,1% parasitemia er akseptabel modeller.
      3. Analysere regresjon vektoren og identifisere de biologiske bandene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Delvis minste kvadraters (PLS-R) plot og dens tilknyttede regresjon vektor, figur 1a og 1b henholdsvis vise at signalet fra parasitter er såpass fra RBCs som de kan brukes å danne en lineær regresjon modell som skal brukes for den prediksjon av parasitter i fremtidige datasett.

En robust, lineær PLS-R-modellen ble generert med en R-kvadrert verdi av 0.87 og en rot-betyr-squared tvers valideringsfeil (RMSECV) av 0,13% parasitemia, figur 1a. Økende parasitemia nivåer er hovedsakelig forbundet med nukleinsyre band, spesielt 1042, 1083 1226/cm, som er tilordnet ν(C=O) fra RNA ribose gruppen, νs(PO4 -) og νen(PO4 -), og sett den største negative delen av regresjon vektoren. Dette er fordi RBCs mangler en kjerne og dermed nukleinsyrer er sterke indikatorer for parasitter. Videre angir 1226/cm bandet at strukturen har en B-DNA form, som fremhever betydningen av måling i vandig staten12. Derimot parasitter konsumere RBC komponenter, hovedsakelig hemoglobin, og dermed en høyere protein lipid forhold forventes infisert RBCs som indikert av lipid band 2913, 2879 og 1397 cm-1 og 1631 og 1555 cm-1 fra amid jeg og amid II moduser12,13.

De forskjellige bandene som tydelig viser at signalene er sant biologiske band enn differensiering basert på falske band av ikke-biologisk opprinnelse som vanndamp, som presenterer som smale og intens. Spesielt kan tilstedeværelsen av DNA band, tabell 1, knyttes direkte til13parasitt11,12,. Generelt kan regresjon vektoren tolkes på en lignende måte til belastninger i PCA. Band oljevolumer band og Skift til de opprinnelige spectra.

Figure 1
Figur 1: PLS-R regresjon plottet, , RBCs piggete mellom 0-1% parasitemia og tilknyttede regression koeffisient, (b). Regresjon tomten demonstrerer evne til modellen til å forutsi parasitemia i hver prøve, med den kjente parasitemia på x-aksen og den anslåtte parasitemia på y-aksen. The regression koeffisient beskriver bidrag av hvert band til prediktiv evnen av modellen, jo mer intens bandet er mer det bidrar til modellen, og dermed hvordan parasitten endrer den kjemiske sammensetningen av blodet. Gjengitt og endret fra Martin, M. et al. 10 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Regresjon koeffisienten Band (cm-1) Assignment25-27
2929 ΝaCH2 fra lipider, parasitt
2913 ΝaCH2 fra lipider, røde blodlegemer
2879 ΝsCH3 fra lipider, røde blodlegemer
2861 ΝsCH2 fra lipider, parasitt
1707 B-DNA/A-DNA base par vibrasjoner νC = O & νC = N, parasitt
1652 Amid I fra α-helix proteiner, parasitt
1631 Amid I fra β-pleated ark proteiner, røde blodlegemer
1584 ΝC = N fra imidazoles i Nucleic syrer, parasitt
1555 Amid II fra proteiner, røde blodlegemer
1530 Amid II, parasitt
1423 B-DNA Deoxyribose, parasitt
1397 Ν(COO-) fra lipider, røde blodlegemer
1226 ΝaPO4-fra B-DNA, parasitt
1184 B-DNA Deoxyribose, parasitt
1083 ΝaPO4-fra DNA, parasitt
1042 ΝC = O fra RNA ribose, parasitt

Tabell 1: tildelinger regression koeffisient band av PLS-R på spektra av malaria piggete RBCs. I PLSR, er parasitemia verdien forbundet med et spektrum beregnet ved å multiplisere preprocessed spekteret med regresjon vektoren. Derfor viser regresjon vektoren betydningen og retning IR band i en regresjon. Fordi spectra var forbehandles med den andre deriverte, er negative band forbundet med en høyere parasitemia mens positiv band er forbundet med en lav parasitemia. Gjengitt og endret fra Martin, M. et al. 10 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PLS-R-modellen er en veiledet multivariabel metode som finner en lineær sammenheng, Y = bX + E, mellom prediktiv variablene X (her, absorbans ved hver wavenumber) og en kontinuerlig variabel Y (her, hvilket parasitemia). Kort sagt, modellen kombinerer variablene i X for å opprette et nytt sett av latent variabler (LVs) som fange variansen på X korrelert med Y, og beregner en regresjon vektor (b) som ganges med en ny spektrum resulterer i estimering av y-verdien. Styrken på modellen kan bli tatt fra to verdier: R2 verdien og verdien rot betyr kvadratisk feil av Cross validering (RMSECV). Tidligere beskriver linearitet av modellen og dermed robusthet (jo nærmere det er til 1 bedre) og data for modeller med R2 verdi mindre enn 0,8 må vurderes nøye for uteliggere og støyende data. RMSECV verdien beskriver feilen som prediksjon kan gjøres. Det er alltid best å prøve å redusere dette tallet som mulig ved å sørge for å ekskludere outliers, nøye behandle data og å sørge for at det er så mange biologiske gjentak som mulig.

Det er derfor viktig at gode data er kjøpt for å bygge modellen. Utarbeidelse av fortynning serien er avgjørende; spesielt gjør at hver RBC prøve er som homogen som mulig. Ved hjelp av pipette trekke opp og kaste ut RBCs noen ganger mens virvlende eller forsiktig flicking slutten av microcentrifuge røret 5-10 ganger, vil inkonsekvenser unngås. På samme måte er det også viktig å rengjøre krystall mellom hver prøve å hindre forurensning. Bruker svært rent vann og lo gratis tørke ren krystall og kontrollere at den opprinnelige planen er flat sikrer at det ikke er noen rester som vil forurense neste eksempel måling.

Biologiske prøver kreves for en modell som er aktuelt i feltet er minst 30 per betingelse som er godkjent med et datasett med like mange. Dette betydelig volum vil ta mye å generere og dermed er dette begrensning av teknikken. Men som flere prøver er riktig analysert de kan legges til prediktiv modellen og styrke den. Således, når etablert, modellen kan bli mer nøyaktig og kan rettferdiggjøre innsatsen trengs konfigureres.

Avhengig av miljøet og instrumentering som målinger er tatt, kan det oppstå flere ytterligere problemer. Hvis beamline ikke er fullstendig omsluttet apparatet, kan betyr leddene er ikke lufttett eller vinduet ATR er utbyttbare med andre eksempel avdelinger, etanol og vann damp forurense til spectra. Etanol vises som en sterk skarpe bandet rundt 1070/cm 14. Dette kan unngås ved å måle i et rom uten etanol og desinfiserer apparatet bare når alle mål tas. Vanndamp er forårsaket av endringer i atmosfæren og vises som små skarpe positive og negative topper rundt 1400-1800 /cm og 3200-3600/cm. Dette kan løses ved å øke frekvensen av bakgrunnen målinger og fjerne maskinen med nitrogen. I tilfeller der purging er utilgjengelig og vanndamp er fortsatt ganske sterk kan utjevning algoritmer og vanndamp erstatning legges til før behandling å fjerne dem.

Denne teknikken har mange løfter for fremtidige diagnostikk og pasient utfall. For det første er metoden generelt svært enkelt å implementere prøven må bare være pipetted på ATR krystall og så den kan måles direkte og legges inn i modellen redusere potensialet for brukerfeil. Dette eliminerer behovet for dyktige lys microscopist, som er i noen områder i Afrika mangler2. På grunn av enkelhet, behovet for dyr reagenser og utstyr er også eliminert og dermed diagnosen ville være nesten kostnadsfrie for pasienter, som er stor begrensning for PCR. Denne kombinasjonen vil føre til høyere antall pasienter kommer for diagnostisering mye raskere og dermed bedre pasientens utfall. Teknikken har potensial for ekstremt høy følsomheten som ville overvinne lav problemområdene av RDTs og kunne oppdage asymptomatisk bærere raskere og dermed kan brukes som en screening teknikk. Videre har teknikken potensial til å brukes for andre sykdommer, blod båret eller ellers, hvor noen microliters eller mikrogram kan brukes på krystall.

Men i eksempel modellen er det mange ting som må tas opp før den kan brukes i feltet. Korset godkjenningen er en på grunn av lavt antall biologiske gjentak og det er ikke ideelt; heller ha en egen validering satt til teste modellen i stedet er mye bedre. Videre er på RMSECV ganske høy her gjør de lavere nivåene av kvantifisering upålitelige. Øke antall gjentak forbedrer denne verdien og må gjøres før adferd i feltet. Dette er bekreftet i laboratoriet studier9, hvor RMSECV var mye lavere på grunn av større utvalgsstørrelsen. I tillegg vil øke intervall utvalg og poeng også forbedre denne verdien også. Ytterligere forbedre diagnostiske evnen, ville stammer av P. falciparum skal brukes, som 3D 7 P. falciparum er et laboratorium belastning og kan presentere en ulike kjemiske sammensetning på grunn av variasjoner i fenotypen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Midler til forfatterne ble gitt av den australske forskningsråd (fremtiden fellesskap FT120100926 til BRW), National Health og medisinsk forskning rådet i Australia (programmet grant og Senior Research Fellowship til JGB; Tidlig karriere stipend JSR; Infrastruktur for forskning institutter støtte ordningen Grant til Burnet Institute), og den viktorianske stat regjeringen operative infrastrukturen støtte Grant til Burnet Institute. Vi erkjenner Mr. Finlay Shanks instrumental støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Donor blood - - Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood Australian Red Cross` -
3D7 Plasmodium falciparum The Burnet Institute - Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich R6504
Albumax (Gibco) Thermofisher E003000PJ Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Giemsa Stain Sigma Aldrich 48900
Sorbitol Sigma Aldrich S1876 Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers) Becton, Dickonson and Company 367671
Immersion Oil Thermofisher M3004
50 mL culture dishes Falcon 353025
25mL pipette tips Falcon 357515
10mL pipette tips Falcon 357530
Microscope Slides Sigma Aldrich S8902
Centrifuge tubes 50 mL Sigma Aldrich T2318
Automated pipette controller Integra-biosciences 155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge Thermofisher 75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators Thermofisher 310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope Nikon Instruments E100_2CE-MRTK-1 When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment Bruker 9308-3700 Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab Mathworks Inc Multivariate data analysis software
The Unscrambler X CAMO Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox Mathworks, Inc. GUI for Matlab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hommel, M., Gilles, H. Chapter 20. Topley & Wilson's Microbiology and Microbial Infections. Vol. 5 Parasitology. Collier, L., Balows, A., Sussman, M. Arnold. Great Britain. 361 (1998).
  2. World Health Organization. World Malaria Report 2016. (2016).
  3. Rogers, W. Chapter 105. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P., Baron, E., Pflaller, M., Tenover, F., Yolken, R. American Society for Microbioogy, USA. 1355 (1999).
  4. White, N. J. Chapter 9. Manson's Tropical Infectious Diseases. 23, Elsevier, USA. 532-600 (2014).
  5. Lindblade, K. A., Steinhardt, L., Samuels, A., Kachur, S. P., Slutsker, L. The silent threat: asymptomatic parasitemia and malaria transmission. Expert Rev Anti Infect Ther. 11, (6), 623-639 (2013).
  6. Hanscheid, T., Grobusch, M. How useful is PCR in the diagnosis of malaria. Trends Parasitol. 18, (9), 395-398 (2002).
  7. Joanny, F., Löhr, S. J., Engleitner, T., Lell, B., Mordmüller, B. Limit of blank and limit of detection of Plasmodium falciparum thick blood smear microscopy in a routine setting in Central Africa. Malar J. 13, (1), 234-241 (2014).
  8. World Health Organisation. Malaria Rapid Diagnostic Test Performance: results of WHO product testing of malaria RDTs: round 6 (2014-2015). (2014).
  9. Khoshmanesh, A., et al. Detection and quantification of early-stage malaria parasites in laboratory infected erythrocytes by attenuated total reflectance infrared spectroscopy and multivariate analysis. Anal Chem. 86, 4379-4386 (2014).
  10. Martin, M., et al. The effect of common anticoagulants in detection and quantification of malaria parasitemia in human red blood cells by ATR-FTIR spectroscopy. Anal. 142, (8), 1192-1199 (2017).
  11. Fabian, H., Mäntele, W. Handbook of Vibrational Spectroscopy. John Wiley & Sons, Ltd. (2006).
  12. Whelan, D., et al. Monitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscoptMonitoring the reversible B to A-like transition of DNA in eukaryotic cells using Fourier transform infrared spectroscopy. Nucleic Acid Res. 39, (13), 5439-5448 (2011).
  13. Wood, B. The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chem Soc Rev. 45, 1980-1998 (1980).
  14. Plyler, E. K. Infrared spectra of methanol, ethanol, and rn-propanol. J Res Natl Bur Stand. 48, (4), (1952).
Gjenkjennings- og kvantifisering av <em>Plasmodium falciparum</em> i vandig røde blodceller av dempes totale refleksjon infrarødspektroskopi og multivariabel analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).More

Martin, M., Perez-Guaita, D., Andrew, D. W., Richards, J. S., Wood, B. R., Heraud, P. Detection and Quantification of Plasmodium falciparum in Aqueous Red Blood Cells by Attenuated Total Reflection Infrared Spectroscopy and Multivariate Data Analysis. J. Vis. Exp. (141), e56797, doi:10.3791/56797 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter