Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de Plasmodium falciparum em infectados aquosas glóbulos vermelhos usando um espectrômetro infravermelho de reflexão total atenuada e análise multivariada de dados.
Vamos demonstrar um método de quantificação e detecção de parasitas em aquosas células vermelhas do sangue (hemácias) usando uma simples bancada espectrômetro atenuadas Total reflexão Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) em conjunto com a análise de dados multivariada ( MVDA). 3 7 por p. falciparum foram cultivadas para parasitas de palco 10% parasitemia anel e usado para spike hemácias do doador fresco isolado para criar uma diluição de série entre 0 – 1%. 10 µ l de cada amostra foram colocadas no centro da janela de diamante ATR para adquirir o espectro. Os dados da amostra foi tratados para melhorar a relação sinal / ruído e remover a contribuição da água, e então aplicou-se a segunda derivada para resolver características espectrais. Os dados foram então analisados usando dois tipos de MVDA: primeiro Principal componente análise (PCA) para determinar quaisquer valores atípicos e regressão de mínimos quadrados parciais (PLS-R) para construir o modelo de quantificação.
Malária está entre as doenças mais devastadoras do nosso tempo; mais de metade da população vive em risco em regiões endêmicas e encargos desproporcionalmente o pobre1,2,3,4. Uma grande parte da questão é a portadores assintomáticos e primeiros pacientes de palco que atuam como reservatórios para mosquitos vetores5, causando picos de infecção durante a época chuvosa e permitindo que persistem nas comunidades. A malária é causada por parasitas de Plasmodium cinco, é o mais mortal do que por p. falciparum , que faz com que a forma mais grave da doença2.
Atualmente, técnicas para o diagnóstico da malária são menos do que perfeito. Microscopia óptica, o atual padrão-ouro, pode somente detectar parasitas 62-88 / µ l dependendo do método usado6. Além disso, devido à intensidade e alta habilidade necessária, em muitas regiões microscopia diagnósticos errados > 50% dos casos, especialmente aqueles com baixa parasitemia níveis2, que pode ser directamente atribuída à falta de recursos na área e resultados em o uso indevido de drogas contra a malária. Outros 2 principais métodos de diagnóstico são testes de diagnóstico rápido (RDTs), que utilizam anticorpos para a detecção e ensaios de reação em cadeia da polimerase (PCR), que discriminam e quantificar parasitas de DNA. Atualmente, o RDTs só são capazes de detectar por p. falciparum e p. vivax de pelo menos 100 parasitas / µ l de sangue, resultando em formas mais raras da doença a ser tratada. 7 , 8 em contraste, os ensaios PCR discriminar e quantificar as diferentes espécies de Plasmodium em uma sensibilidade de 0,0004-5 parasitas / µ l de sangue. No entanto, isso requer habilidade técnica, os equipamentos e reagentes caros e, portanto, não é adequado para o campo de aplicação.
Uma técnica altamente sensível, confiável e acessível é essencial para melhorar os tempos de diagnóstico e melhorando os resultados dos pacientes e possibilitando a eliminação da doença. Atenuada espectroscopia de Total reflexão Fourier transform (ATR-FTIR) oferece uma solução para este problema em potencial. Trabalhos anteriores mostraram que era possível detectar e quantificar por p. falciparum em metanol fixada filmes de sangue atingir os limites de detecção de < 1 parasita / µ l de sangue (< 0,0002% parasitemia)9, que é comparável aos métodos PCR. Estudos recentes têm mostrado que é possível detectar e quantificar parasitas em amostras aquosas e, assim, eliminar a etapa de fixação. No entanto, fatores tais como o vapor de água, ruído espectral e tratamento de dados precisam ser tomadas em consideração para obter melhores resultados10.
Este protocolo tem como objetivo mostrar novos usuários como adquirir espectros de FTIR-ATR e preparar um modelo de regressão para a detecção de p. falciparum de amostras aquosas glóbulos vermelhos (RBC)10.
PLS-R modelo é um método multivariado supervisionado que encontra uma relação linear, Y = bX + E, entre as variáveis preditivas X (aqui, a absorvância a cada número de onda) e uma variável Y contínua (aqui, o nível de parasitemia). Em suma, o modelo combina as variáveis em X para criar um novo conjunto de variáveis latentes (LVs) que captam a variação no X correlacionada com Y e calcula um vetor de regressão (b) que multiplicado por um novo resulta de espectro na estimativa do valor y. A força do modelo p…
The authors have nothing to disclose.
Financiamento para os autores foi fornecido pelo Conselho australiano de pesquisa (futuro Fellowship FT120100926 a BRW), nacional de saúde e médico pesquisa Conselho da Austrália (programa grant e bolsa de pesquisa sênior para JGB; Bolsas de carreira precoce JSR; Infraestrutura para pesquisa institutos de concessão de regime de apoio ao Instituto Burnet), e a infra-estrutura operacional de governo de Victorian estado apoiar Grant ao Instituto de Burnet. Reconhecemos o Sr. Finlay Shanks para apoio instrumental.
Donor blood | – | – | Must be collected by a trained medical practitioner |
Stock blood | Australian Red Cross` | – | |
3D7 Plasmodium falciparum | The Burnet Institute | – | Laboratory strain wild type equivalent |
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | R6504 | |
Albumax (Gibco) | Thermofisher | E003000PJ | Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Giemsa Stain | Sigma Aldrich | 48900 | |
Sorbitol | Sigma Aldrich | S1876 | Must be filtered before use in culture |
Blood collection tubes (Vacutainers) | Becton, Dickonson and Company | 367671 | |
Immersion Oil | Thermofisher | M3004 | |
50 mL culture dishes | Falcon | 353025 | |
25mL pipette tips | Falcon | 357515 | |
10mL pipette tips | Falcon | 357530 | |
Microscope Slides | Sigma Aldrich | S8902 | |
Centrifuge tubes 50 mL | Sigma Aldrich | T2318 | |
Automated pipette controller | Integra-biosciences | 155 015 | |
Sorvall Legend X1R Centrifuge | Thermofisher | 75004260 | |
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators | Thermofisher | 310TS | |
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope | Nikon Instruments | E100_2CE-MRTK-1 | When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens |
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment | Bruker | 9308-3700 | Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing |
Matlab | Mathworks Inc | Multivariate data analysis software | |
The Unscrambler X | CAMO | Multivariate data analysis software | |
PLS-Toolbox | Mathworks, Inc. | GUI for Matlab |