Summary
Настоящий Протокол описывает процедуру оценки спермы рыбы с помощью анализа спермы, компьютерный и охлаждения устройства. Программное обеспечение дает быстрый, точный и количественный анализ качества спермы рыбы, основанный на подвижность сперматозоидов, который может быть полезным инструментом в аквакультуре для улучшения воспроизводства успех.
Abstract
Для оценки качества гамет есть новаторские, быстрое и количественные методы, которые могут предоставить полезные данные для аквакультуры. Компьютеризированных систем для анализа спермы были разработаны для измерения несколько параметров и один из наиболее часто измеряемых сперматозоидов.
Первоначально этой компьютерной техники был разработан для млекопитающих, хотя он также может использоваться для анализа спермы рыбы. Рыбы имеют особенности, которые могут повлиять на спермы оценки например, короткий моторики время после активации и, в некоторых случаях, адаптация к снижению температуры. Таким образом необходимо изменить программное и аппаратное обеспечение компоненты сделать анализ сократительной способности более эффективным для анализа спермы рыбы. Для млекопитающих спермы нагревательная пластинка используется для поддержания оптимальной температуры сперматозоидов. Однако для некоторых видов рыб, это выгодно использовать более низкую температуру продлить продолжительность моторики, так как сперма активна для менее 2 мин. Таким образом Охлаждающие устройства необходимо охладить образцов при постоянной температуре за время анализа, в том числе на оптический микроскоп. Этот протокол описывает анализ Рыба сперматозоидов с помощью программного обеспечения для анализа спермы и новых охлаждающих устройств для оптимизации результатов.
Introduction
Эффективность воспроизведения зависит от качества обоих гамет (яйца и сперматозоиды)1,2. Это является важным фактором, который способствует успешного оплодотворения, позволяя развития жизнеспособного потомства3,4. Удобный оценки качества гамет является лучшим инструментом для определения потенциала плодородия образца.
Смешивания спермы от нескольких самцов является обычной практикой в производстве многих водных коммерческих видов4. Однако спермы изменчивость между мужчинами может привести к конкуренции спермы, и, следовательно, не все мужчины одинаково вклад генофонда5. В этом смысле правильной оценки отдельных эякулята/сперматозоидов функций, таких как подвижность, имеет основополагающее значение для получить дискриминационные информацию, касающуюся отдельных мужской фертильности потенциал. Непосредственное наблюдение за сперматозоидов может производить неточными и субъективные данные как он требует времени и опыта, который приводит к несовместимости результатов6,7и отсутствие последовательности. Однако есть много новаторских, быстрое и количественных методов, которые могут обеспечить надежный спермы качества анализа2,4.
Анализ спермы компьютерный был разработан предлагать точные данные о качества спермы8. Эта технология включает в себя разработку программного обеспечения, связанные с микроскопом контраст фазы, которая позволяет оценки подвижности сперматозоидов. Однако ограничивающим фактором моторики параметра является частота кадров видео-камеры. Индивидуальных траекторий основаны на сперматозоиды сперматозоидов голова центроид позиции в последовательных кадров видеозаписей, который коррелирует с flagellar движение модели3,9,10, 11. основные кинетические параметры измерения являются прямой линии скорости (ВУС), криволинейная скорость (VCL) и средней траектории скорости (VAP). VSL — это расстояние между начальной и конечной точки, принятые сперматозоидов, деленному на время. VCL-реальная скорость по точной траектории, принятые сперматозоидов. VAP-скорость пути производных сглаженного траектории. Эти параметры позволяют дополнительную кинетическую информацию, включая линейность (Лин), прямолинейность (STR), колебание (WOB) и избиение измерения как амплитуда бокового движения головы (ALH) и бить крест частоты (КБК)4,10.
Система анализа спермы первоначально использовался для млекопитающих, и одним из требований для системы – для работы при температуре тела донора (около 37 ° C). Это программное обеспечение может также использоваться для видов рыб; Хотя, это необходимо сделать некоторые приспособления, чтобы уменьшить погрешность результатов анализа спермы. В некоторых видов рыб, таких как лососевых и угорь8,12оплодотворение происходит при низкой температуре (около 4 ° C)2,4. Таким образом чтобы избежать неудобных условий труда должны разрабатываться охлаждения устройства. Кроме того Рыба сперматозоидов сперматозоидов в семенной жидкости и требуют осмотическим шоком для активации сократительной способности. Для пресноводных видов средний активатор должны иметь гипотонический осмотического давления, в то время как для морских видов среды должно быть гипертонический. Однако для некоторых видов, как лососевых, концентрация ионов также может быть важным3,4,9. После активации рыбы спермы характеризуется быстрое уменьшение подвижности (менее 2 мин)13,14 и высокой скорости, будучи жизненно необходимо определить оптимальную частоту кадров для получения надежных данных15.
Цели этого исследования, для разработки и применения систем охлаждения для рыб образцов спермы. Кроме того этот протокол определяет способ определить оптимальную частоту для создания стандартных протоколов в зависимости от вида. Использование этого протокола открывает новые двери в контексте рыбы семенных оценки, используя Европейский угорь в качестве модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры с участием животных темы были одобрены общее направление производства сельскохозяйственной продукции и скота на университетской политехнического де Валенсия (2015/VSC/горох/00064).
1. сбор спермы от зрелых Европейский угорь в плену
Примечание: Использование угорь мужчины поддерживали в цистернах с морской водой и системой рециркуляции при постоянной температуре (20 ° C). Лечить гормонами через загрузок внутрибрюшинной инъекции (хорионического гонадотропина человека (ХГЧ); 1,5 МЕ / г массы тела рыбы). Акклиматизировать постепенно начиная с 3 суток в пресноводных рыб после замены с морской водой (1/3 от общего объема воды в баке) каждые 2 дня до достижения соленость 37.0 g/мл.
- Анестезировать угорь 24 ч после инъекции гормона для получения образцов с лучшее качество спермы.
- Заранее подготовить анестезии: добавить 300 мг бензокаин до 100 мл 70% этанола. Хорошо перемешать и хранить при 4 ° C.
- Разбавьте бензокаин в гибкой ведро с 5 Л воды системы получить окончательный концентрации 60 мг/Л и смешайте правильно.
- Передача рыбы в ведро с водой системы и бензокаин. Подождите несколько минут, пока рыба успокоиться.
- Очистка области половых органов с водой и высушить фильтровальную бумагу, чтобы избежать загрязнения образцов спермы, калом, мочой или морской воды.
- Применить нежное давление в брюшной области и сбор образцов спермы в 15 мл пластиковых трубок с помощью вакуумного насоса. Объем спермы до 6-7 мл, в зависимости от мужчин.
- Держите образцов спермы на 4 ° C для по крайней мере 1 h, пока проводится анализ подвижности.
2. хранить в холодильнике и развести образцы спермы
- Заранее подготовьте разбавителя решение.
Примечание: Образцов спермы следует разбавить в расширитель решения, специфичные для каждого вида.- Подготовьте средне-активатор для образцов спермы угорь (P1 средний). Добавьте 0,42 г бикарбоната натрия, 1.828 г натрия хлорида, 0,127 г хлорида магния, 0,56 г калия хлорида и 0,037 г хлорида кальция до 250 мл дистиллированной воды. Смесь хорошо распустить. Хранить при 4 ° C.
- Установите кулер блок на 4 ° C для поддержания образцов при постоянной температуре. Подождите, пока температура стабилизируется.
- Развести образцы спермы с помощью разбавителя конкретные решения для каждого вида.
Примечание: Коэффициент разрежения конкретные виды и должен быть определен для стандартизации протокол. Во-первых оценки концентрации сперматозоидов, основанный на концентрации, полученные в предварительный анализ сократительной способности, с помощью программного обеспечения, как описано в шагах 3 и 4. С этим анализом это также можно выбрать лучшие образцы спермы, основанные на процентах подвижности. После этого исследователь может начать сбор данных для эксперимента с использованием лучших образцов с правильной концентрации.- Развести образцы спермы угорь в средстве P1 с соотношением 1:50. Чтобы подготовить 500 мкл угорь разбавленный спермы, добавьте 50 мкл пример свежей спермы и 450 мкл P1. Хорошо перемешайте.
3. оценки параметров подвижности спермы
-
Настройка модуля сократительной способности программного обеспечения
- Установите кулер этап при температуре 4 ° C и подождите, пока она стабилизируется.
- Откройте программу и выберите Модуль подвижности. При необходимости создайте имя пользователя и пароль.
- Выберите Свойства и выберите желаемые параметры перед началом анализа спермы.
- Нажмите на видов | Рыба.
- Выберите Кадров в секунду и Число изображений, в зависимости от лучших технических условий для каждого вида. Установите оба варианта в 120 кадров в секунду.
- Выберите отрицательный контраст. Она является обязательной для точной реконструкции сперматозоидов траекторий16.
- Выберите соответствующий Подсчета камеры и масштаб видео-камеры. Калибровка камеры видео для увеличения объектива используется в эксперименте. Задать SpermTrack10 в качестве счетной палаты и 10 X масштаба.
Примечание: В целом, на глубину 10 мкм в Счетной палате и увеличение объектива 10 X являются Рекомендуемые условия так как они обеспечивают лучшее сосредоточение всех сперматозоидов и захватить наибольшее количество клеток. Однако рекомендуется сделать предыдущие исследования оптимальных условий для анализа подвижности каждого вида. - Настройка Области частиц и подключения для каждого вида. Задать область минимальный частиц на 2 мкм2 и подключения на 7 мкм.
Примечание: Для рыб, минимальное значение частиц области колеблется от 2-5 мкм и подключения зависит от скорости сперматозоидов и частоту кадров. - Сохраните настройки.
- Выберите захват.
-
Анализ спермы угорь с программным обеспечением
- Приготовляют раствор активатора (искусственный морской воды) путем добавления 25 мл дистиллированной воды с 2% BSA 0.946 g коммерческих соли.
- Возьмите 500 мл раствора активатор (искусственный морской воды) и место в блоке прохладнее.
Примечание: В целом, рыбы спермы активируется событием осмотическим шоком, хотя для некоторых видов концентрации ионов может также иметь важное значение. Для пресноводных видов средний активатор должны иметь гипотонический осмотического давления, в то время как для морских видов среды должно быть гипертонический. - Положите Счетной палаты стадии охлаждения и подождать до тех пор, пока температура стабилизируется до 4 ° C.
- Mix активатор и разбавленных спермы, чтобы активировать сперматозоидов и начать запись между 5-10 секунд после активации сократительной способности видео.
- Возьмите 4 мкл раствора активатор и место в Счетной палате.
- Аккуратно гомогенизировать разреженных спермы путем встряхивания microcentrifuge 3 раза, чтобы избежать повреждения клеток сперматозоидов.
- Возьмите 0.5 мкл разбавленного спермы, смешать с активатором и Поставьте крышку в Счетной палате быстро.
Примечание: Этот шаг не следует принимать более чем 5 s, чтобы как можно скорее начать анализ. - Фокус на клетки сперматозоидов и найти лучшие визуальные области, которая определяется низкое количество сперматозоидов (150-200 клеток) чтобы избежать перехвата между ячейками (Дополнительные рис. 1A). Выберите Захват видео для получения сперматозоидов треков, которые разделены согласно скорость.
- Выберите захват для получения поля 3-7, которые являются оптимальный интервал для получения нижней изменчивость в результатах и приступить, как раньше. Запись видео до 120 s после активации во избежание конденсации на обложке Счетной палаты.
- Выберите выход , чтобы иметь общее представление о всех полей.
4. получение данных моторики
- Выберите поля, | Частичный | Сохранить и выбрать имя файла. Нажмите кнопку сохранить.
Примечание: Таблица обеспечивает средние значения частичные данные, графики и изображений сперматозоидов треков. - Выберите Общие данные | Имя файла | Сохранить.
Примечание: Данные предоставляют кинетическая значения для отдельных сперматозоидов всех полей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ времени влияние на подвижность сперматозоидов
В случае угорь, доля статической сперматозоидов, увеличилась с 15 s до 120 секунд после активации (с 24,4% до 40,7%) и процент мобильных прогрессивного сперматозоидов сократилось (с 36,9% до 20,9%) (Рис. 1A и 1B). Основываясь на скорости, сперматозоидов клетки показал снижение скорости со временем (Рисунок 1 c и 1 D) снизилась. Количество сперматозоидов с быстрой скоростью снизился около 23% (с 49,4% до 26,6%), и увеличилась доля сперматозоидов с средней скоростью около 7%.
Влияние частоты кадров и Счетной палаты
Различные виды требуют различную частоту для достижения оптимальных результатов. Русский осетр требует 150 кадров в секунду (fps; Рисунок 2A); сазан требует 100 fps (рис. 2B); и для хариуса, 200 fps не было достаточно, чтобы получить оптимальные результаты кинетического (рис. 2 c). Эти результаты были не зависит от глубины Счетной палаты (рисунок 2A-2 C) испытания.
Спермы субпопуляций структура
Выявления субпопуляции спермы на основе статистического анализа. Первым шагом является определение основных компонентов (анализ главных компонентов; PCA) от полного набора данных подвижности. Затем кластеризации процедуры выполняются с спермы производные индексы, полученные после PCA.
Для этого исследования, мы использовали спермы Атлантического лосося, который показал четыре различных субпопуляций, названный: медленно нелинейных (низкая Лин, STR и VCL), быстрая нелинейного (Нижняя ул, высокая VCL), быстрая линейная (высокая Лин, STR и VCL) и быстрый линейный (наивысший Лин, STR и VCL). Распределение этих подгрупп, разнообразные вдоль поколений от диких животных для выращиваемых те (рис. 3).
Рисунок 1 : Влияние времени после активации на прогрессивности и подвижности сперматозоидов угорь. A и B) процент прогрессивности в 15 и 120 s, соответственно; и C и D) процент моторики, основанный на скорости течением времени (15 и 120 s после активации, соответственно). Прогрессивности была разделена на три группы: прогрессивный подвижных клеток (белая; VCL означает значение ± SD: 114.5 ± 18.2 и 101.4 ± 34,5 мкм/s для 15 и 120 s, соответственно), без прогрессивных подвижные клетки (серый; VCL означает значение ± SD: 84.8 ± 17,4 мкм/s для 15 s и 84,6 ± 16,5 микрон/s для 120 s) и статических сперматозоидов (черный). Сперматозоиды скорость была разделена на 4 группы: быстрый (VCL означает значение ± SD: 119.3 ± 13.7 мкм/s для 15 s и 118.9 ± 13.3 мкм/s для 120 s; белый), средний (VCL означает значение ± SD: 79.7 ± 15,5 мкм/s для 15 s и 79,6 ± 15,5 мкм/s для 120 s; светло-серый) , медленно (VCL означает значение ± SD: 32.9 ± 6,5 мкм/s для 15 s и 32,6 ± 6,6 мкм/s для 120 s; темно-серый) и статическими (черный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Влияние частоты кадров и Счетной палаты в трех видов пресноводных рыб: (A) русского осетра (B) карпа и (C) хариуса. Анализ спермы было сделано на 50, 100, 150 и 200 fps, с использованием двух коммерческих подсчета камер с разных глубин (10 и 20 мкм). Черный круг представляет лучшие частоты кадров для каждого вида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Спермы субпопуляций структура трех поколений Атлантического лосося: дикие самцы (F0) и первые два поколения, производится в неволе (F1 и F2). После кластерного анализа, были замечены четыре подгруппы: медленно нелинейных сперматозоидов (низкая Лин, STR и VCL; кластер 1; черный), быстрая нелинейного сперматозоидов (Нижняя ул, высокой VCL кластер 2; темно-серый), быстрая линейная сперматозоидов (высокая Лин, STR и VCL; кластер 3; Средний серый) и быстрый линейный сперматозоидов (наивысший Лин, STR и VCL; кластера 4; светло-серый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные Рисунок 1. Различные зрительные области от анализа подвижности спермы угорь, определяется как лучших (A) и (B) в худшем случае концентрации клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Программное обеспечение анализа спермы, используемые в настоящем Протоколе использовался исследователями во всем мире для различных видов, включая рыб. Однако рыбы имеют некоторые особенности, которые могут повлиять на оценки спермы. Рыба сперматозоидов показали высокую скорость в момент активации, которая падает быстро и приводит к короткое время моторики после активации. Кроме того Температура размножения зависит от вида и, в некоторых случаях, может быть около 4 ° C2,4,8,12. Таким образом это необходимо сделать некоторые приспособления для повышения эффективности компьютеризованной системы для анализа спермы рыбы. Основной принцип подвижности параметра является сбор и анализ последовательных изображений, количество подвижных сперматозоидов. Большинство систем использует стандартные кадров (16, 25, 30, 50 или 60 fps) из-за ограничений аппаратного и программного обеспечения17,18,-19,-20,-21,-22. Однако, некоторые исследования показали, что выше частота кадров увеличивает некоторые параметры скорости, например VCL, STR, КБК15,23,24. Это особенно важно, когда необходимо оценить гиперактивацию сперматозоидов и найти максимальной скорости сперматозоидов11,,1718,19, 25. по отношению к температуре анализа, охлаждения пластины для оптических микроскопов и новые технологии для охлаждать образцов при постоянной температуре также могли бы улучшить анализ с течением времени. Настоящая работа предлагает подход для решения двух главных проблем, связанных с подвижности спермы рыбы чувствительность анализа и температуры. Несмотря на результаты, сосредоточив внимание на некоторые виды пресноводных эта методология может использоваться для морских видов, хотя средство активации должны быть адаптированы для каждого вида.
На рынке существует ряд продуктов или даже различные версии того же продукта. Даже если системы могут иметь тот же принцип, каждый из них имеет различные детали, что приводит к несовместимости результатов26,27,28. Кроме того оценки качества спермы рыбы может по-прежнему имеют методологические и технические ограничения. Метод активации спермы и время анализа после активации являются два основных факторов, которые влияют спермы качества оценки29,30. Время между активации образцов спермы и стабилизация изображения видео записи должно быть около 5 s, начиная с первой секунды (интервал времени s 5-20) обеспечивает наиболее полезных данных2,4. Время анализа спермы может быть ограничен из-за проблемы конденсации на стеклянное скольжение. Однако рыба сперматозоиды остаются активными с энергичным движением за менее чем две минуты2. На техническом уровне необходимо знать «оптимальный» частоту кадров для получения подробной информации, которая дает точную реконструкции сперматозоидов траекторий15. На более низких кадров детали траектории теряются, особенно для быстрого и нелинейных сперматозоидов, тогда как на более высоких кадров, информация становится излишним15,31. Для некоторых видов рыб, частота кадров (до 250 fps) не может быть достаточно, чтобы найти максимальную скорость сперматозоидов для некоторых видов рыб, таких как хариус и лосось. Этот вариант является конкретным видам и должны быть определены для каждого вида стандартизировать протокол и получить надежные результаты15,23,24. Глубина Счетной палаты может ограничить движение больших жгутика рыбы и сперматозоиды не могут достичь максимальной скорости11,32,33. Кроме того программное обеспечение может иметь некоторые ограничения в выявлении реальных сперматозоидов, когда есть пересечение клеток.
Классическая Оценка качества спермы это субъективный анализ, основанный на оценке концентрации и процент моторики, который может производить изменчивости на результаты. Однако компьютеризированная система обеспечивает быстрое, точное и количественных измерений параметров подвижности. Этот объективный анализ дает большое количество данных и снижает изменчивость результатов34,35,,3637. Ответ поведения подвижности спермы зависит от температуры анализа и варьируется среди видов38,,3940. Оптимальная температура анализа спермы может обеспечить скорость спермы и продолжительность периода моторики, похож на природных условий воспроизводства38,40. Таким образом программное обеспечение для анализа спермы с устройств охлаждения улучшает оценку качества спермы рыбы.
Результаты анализа качества спермы может улучшить знания о рыбы спермы характеристики и качества на основе спермы субпопуляций, который может быть в будущем оценки спермы в всех видов животных41,42. На практическом уровне, этот метод может быть показателем высокого качества заводчиков и помогает получить больше информации о спермы процесс отбора, семенные дозы вычисления для искусственного осеменения, спермы конкуренция, основанная на скорости и прогрессивности и потенциального плодородия. Все это знание может применяться в различных исследовательских областях, включая аквакультуру и сохранения программы, которые стимулировали интерес к хранения рыбы спермы и криоконсервирования в последние десятилетия2,13. Токсикологическое воздействие также получают особый интерес из-за экологических проблем, а также исследования развития филогенетического исследований на основе спермы подвижности характеристики43,44.
Эта работа показала, как оптимизация автоматического программного обеспечения для анализа подвижности спермы рыба улучшает результаты. Стандартизация протокола должны учитывать температуру анализа и частота кадров, которые могут быть различны в зависимости от вида. Однако анализ Рыба сперматозоидов имеет две важные шаги, что исследователь следует обратить внимание. Коллекция спермы является первым важным шагом, который может уничтожить образца из-за загрязнений, калом, мочой и воды (морской или пресной воды). Другой критической точки ассоциируется с момента активации спермы и начало видеозаписи. Этот шаг следует сделать как можно скорее для сбора данных, когда сперматозоиды энергичные движения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Этот проект получил финансирование от стоимости ассоциации (продовольствие и сельское хозяйство стоимость действий FA1205: AQUAGAMETE и научных исследований и инновационной программы Европейского союза по Horizon 2020 под Марии Склодовской-Кюри проекта ВПЕЧАТЛЯЮТ (GA No 642893). Мы хотели бы поблагодарить научный коллектив PROiSER, специально для студентов Альберто Vendrell Бернабеу, за его активное участие в записи видео этого проекта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
- Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
- Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
- Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
- Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
- Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
- Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
- Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
- Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout - the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
- Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis? Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
- Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
- Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
- Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
- Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
- Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
- Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
- Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
- Holt, W. V., O'Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
- Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
- Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
- Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
- Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
- Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
- Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
- David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
- Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
- Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
- Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
- Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
- Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
- Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
- Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
- Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
- Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).
