Summary
בפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך של דגים זרע הערכה באמצעות ניתוח המחשב בסיוע זרע, התקני קירור. התוכנה נותנת מהירה, מדויקת, ניתוח כמותי של איכות הזרע דגים בהתבסס על spermatozoa מורפולוגית, יכול להיות כלי שימושי חקלאות מים כדי לשפר את ההצלחה רבייה.
Abstract
להערכת איכות תא רבייה, ישנן טכניקות חדשניות, מהירה, כמותיים שיכול לספק נתונים שימושיים עבור חקלאות ימית. מערכות ממוחשבות לניתוח זרע פותחו כדי למדוד פרמטרים מספר, באחד נמדד בדרך כלל תנועתיות הזרע.
בתחילה, טכנולוגיית מחשב זה תוכנן עבור יונקים, למרות שזה יכול לשמש גם לצורך ניתוח זרע של דג. לדגים יש תכונות ספציפיות אשר יכולים להשפיע על זרע הערכה כגון זמן קצר תנועתיות לאחר ההפעלה ו, במקרים מסוימים, הסתגלות כדי להוריד את הטמפרטורה. לכן, זה הכרחי לשנות רכיבי תוכנה וחומרה לבצע ניתוח תנועתיות יעילה יותר לניתוח זרע של דג. לזרע יונקים, הצלחת חימום משמש כדי לשמור על טמפרטורות אופטימלית של spermatozoa. עם זאת, עבור כמה זני דגים, זה יתרון לשימוש בטמפרטורה נמוכה כדי להאריך את משך הזמן של תנועתיות, מאז הזרע להישאר פעיל למשך פחות מ 2 דקות. לכן, התקני הצינון יש צורך לקרר את דגימות בטמפרטורה קבועה על פני הזמן של ניתוח, כולל על המיקרוסקופ האופטי. פרוטוקול זה מתאר הניתוח של תנועתיות הזרע דגים באמצעות תוכנה לניתוח זרע וקירור חדש התקנים כדי למטב את התוצאות.
Introduction
היעילות של רבייה תלויה באיכות של שתי גמטות (ביצים, זרע)1,2. . זה הגורם אשר תורם הפריה מוצלחת, ומאפשר התפתחות הצאצאים קיימא3,4 הערכת איכות תא רבייה נוח הוא הכלי הטוב ביותר עבור הגדרת את פוטנציאל הפוריות של הדגימה.
ערבוב זרע מן הזכרים מרובים הוא מנהג נפוץ בייצור של מינים ימיים מסחריים רבים4. עם זאת, ההשתנות זרע בין הזכרים יכול להוביל זרע תחרות, כתוצאה מכך, לא כל הגברים באותה מידה תורמים מאגר הגנים5. במובן זה, הערכת הנכונות לפלוט בודדים/spermatozoa תכונות, כגון תנועתיות, הוא היסוד המפלה מידע לגבי פוריות הגבר בודדים פוטנציאליים. התבוננות תנועתיות הזרע יכול להפיק נתונים לא מדויקים ולא סובייקטיבי כפי שהוא דורש זמן וניסיון, מה שמוביל חוסר עקביות של אי-תאימות של תוצאות6,7. עם זאת, ישנם טכניקות חדשניות, מהיר ולא כמותית רבות שיכול לספק2,4ניתוח איכות הזרע אמין.
ניתוח המחשב בסיוע זרע פותחה להציע נתונים מדויקים לגבי איכות הזרע8. טכנולוגיה זו כוללת הפיתוח של תוכנה הקשורים עם מיקרוסקופ לעומת זאת שלב המאפשר להערכת תנועתיות הזרע. עם זאת, גורם מגביל של תנועתיות פרמטר הוא קצב המסגרות של מצלמת הוידאו. Spermatozoa בודדים מסלולים מבוססים על spermatozoa ראש centroid המיקום במסגרות רצופים של הקלטות וידאו, אשר הוא מתואם עם התנועה השוטוניים דפוסי3,9,10, 11. הפרמטרים העיקריים קינטי נמדד הם מהירות הקו הישר (וי), מהירות לאכסדרות (צ'לו) נתיב ממוצע מהירות (ידינו). וי הוא המרחק בין נקודת המוצא מובילים שגבה את spermatozoa מחולק זמן. צ'לו היא המהירות האמיתית לאורך המסלול נלקחה על ידי spermatozoa. ידינו הוא המהירות לאורך נתיב מוחלקים נגזרת של המסלול. פרמטרים אלה מאפשרים פרטים קינטי נוספים, לרבות ליניאריות (לין), יושר (STR), התנודדות (WOB), מדידות מכות כמו משרעת של התנועה הראשי לרוחב (ALH) ו ביט-צלב תדר (BCF)4,10.
מערכת ניתוח זרע ששימש במקור עבור יונקים, אחת הדרישות של המערכת לפעול טמפרטורת הגוף של התורם (כ 37 מעלות צלזיוס). תוכנה זו יכולה לשמש גם זני דגים; למרות, יש צורך לבצע כמה עיבודים כדי להפחית את השגיאה של תוצאות ניתוח זרע. במינים מסוימים דג ', כגון סלמונאיים: צלופח8,12, ההפריה מתרחשת בטמפרטורה נמוכה (בסביבות 4 ° C)2,4. לפיכך, התקני קירור צריכה להיות מפותחת כדי להימנע תנאי עבודה לא נוח. בנוסף, דג spermatozoa immotile בנוזל הזרע, לדרוש מכת אוסמוטי להפעלת תנועתיות. מים מתוקים מינים, המדיום activator צריך להיות osmolality היפוטוניק, בעוד מינים ימיים המדיום צריך להיות hypertonic. עם זאת, עבור מינים מסוימים, כמו סלמונאיים:, ריכוז יון יכול גם להיות חשוב3,4,9. לאחר ההפעלה, דגים זרע מאופיין על ידי ירידה מהירה של תנועתיות (פחות מ- 2 דקות)13,14 ו בדחיסות גבוהה, להיות חיוני כדי לקבוע את קצב המסגרות אופטימלית להשיג נתונים אמינים15.
מטרות המחקר הן לעצב וליישם מערכות קירור עבור דגימות זרע של דג. בנוסף, פרוטוקול זה מגדיר כיצד לקבוע את המחירים מסגרת אופטימלית עבור הקמת פרוטוקולים סטנדרטיים בהתאם למין. השימוש בפרוטוקול זה פותח דלתות חדשות בהקשר של הערכת הזרע דגים, משתמש הצלופח אירופה כמודל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נהלים בנושאים בעלי חיים מעורבים היו אישור (2015/VSC אפונה 00064) הכיוון הכללי של תוצרת חקלאית, משק-החי-València דה Politècnica Universitat.
1. איסוף זרע צלופחים בוגרים האירופית בשבי
הערה: שימוש צלופח האירופית זכרים בהשתתפות טנקים עם מי ים ומערכת recirculation בטמפרטורה קבועה (20 ° C). פנקו עם הורמונים באמצעות הזרקה בקרום הבטן שבועי (גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG); לכל g IU 1.5 ממשקל הגוף דגים). ואקלום דגים בהדרגה החל מ 3 ימים במים מתוקים ואחריו החלפה עם מי ים (1/3 של המים הכולל במיכל) כל יומיים עד שהגיע עם מליחות של 37.0 גר'/mL.
- עזים ומתנגד הצלופח 24 שעות לאחר הזרקת הורמון להשיג דגימות עם איכות זרע טובה יותר.
- להכין מראש ההרדמה: להוסיף 300 מ"ג בנזוקאין 100 מ של 70% אתנול. מערבבים היטב ולאחסן ב 4 º C.
- לדלל בנזוקאין בדלי גמיש עם 5 L של מערכת מים בכדי לקבל ריכוז סופי של 60 מ ג/ליטר, מערבבים היטב.
- להעביר את הדגים הדלי עם מערכת מים, בנזוקאין. המתן מספר דקות עד דגים תירגע.
- לנקות את אזור איברי המין עם מים ויבשה עם נייר סופג כדי למנוע זיהום של זרע דגימות צואה, שתן או מי-ים.
- החל לחץ עדין באזור הבטן, לאסוף דגימות זרע לתוך צינורות פלסטיק 15 מ"ל באמצעות את משאבת ואקום. נפח הזרע עד 6-7 מ ל, בהתאם הזכר.
- שמור דגימות זרע ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה עד תנועתיות ניתוח מבוצע.
2. להכניס למקרר ו לדלל את דגימות זרע
- הכינו מראש את הפתרון כיום.
הערה: דגימות זרע צריך להיות מדולל בפתרון ה-extender ספציפיים עבור כל המינים.- היכונו המדיום-מפעיל דגימות זרע צלופח (P1 בינוני). הוסף 0.42 גר' נתרן ביקרבונט, 1.828 גר' נתרן כלורי, g 0.127 של מגנזיום כלוריד, 0.56 g של אשלגן כלורי, 0.037 גרם סידן כלורי עד 250 מ"ל של מים מזוקקים. מערבבים היטב כדי להמיס. חנות ב 4 º C.
- הגדר את מגניבים הבלוק ב 4 ° C כדי לשמר דגימות בטמפרטורה קבועה. המתן עד מייצבת הטמפרטורה.
- לדלל את דגימות זרע באמצעות כיום פתרון ייחודיים לכל מין.
הערה: יחס דילול מינים ספציפיים, חייב להיות מוגדר כדי לתקנן את הפרוטוקול. ראשית, מעריכים ריכוז הזרע מבוסס על ריכוז שהושג בניתוח קדם תנועתיות באמצעות תוכנה, כמוסבר בשלבים 3 ו- 4. ניתוח זה, זה גם אפשרי לבחור את דגימות זרע הטוב ביותר בהתאם לאחוז תנועתיות. אחרי זה, החוקר יכול להתחיל לאסוף נתונים עבור הניסוי באמצעות את הדוגמאות הטובות ביותר עם הריכוז הנכון.- לדלל צלופח דגימות זרע במדיום P1 עם יחס של 1:50. כדי להכין µL 500 של זרע צלופח מדולל, להוסיף 50 µL של דגימת זרע טרי ו- 450 µL של P1. מערבבים היטב.
3. להעריך את הפרמטרים תנועתיות הזרע
-
הגדרת המודול תנועתיות של התוכנה
- הבמה קריר ב 4 ° C והמתן עד זה מייצבת.
- פתח את התוכנה ובחר מודול תנועתיות. צור שם משתמש וסיסמה במידת הצורך.
- בחר מאפיינים ובחר את הפרמטרים הרצויים לפני תחילת הניתוח זרע.
- לחץ על מינים | דגים.
- בחר את מסגרות לכל השני ואת מספר תמונות, בהתאם לתנאי הטכני הטוב ביותר עבור כל המינים. הגדר שתי האפשרויות-120 תמונות לשניה.
- לבחור הניגוד השלילי. . זה הכרחי עבור שחזור מדויק של ה-מסלולים spermatozoa16.
- בחר את המקביל קאמרית סופר ואת קנה המידה של מצלמת הוידאו. כיילו את מצלמת הווידאו עבור העדשה ההגדלה המשמשים את הניסוי. הגדר SpermTrack10 כמו חדר הספירה ואת סולם X 10.
הערה: באופן כללי, לעומק של 10 מיקרומטר בתא הספירה ו עדשה ההגדלה של 10 X הם התנאים המומלצת מכיוון שהם מספקים יותר התמקדות של כל spermatozoa וללכוד את המספר הגבוה ביותר של תאים. עם זאת, מומלץ לבצע מחקר קודם של התנאים האופטימלי לניתוח תנועתיות של כל מין. - להתאים את אזור החלקיקים ואת קישוריות עבור כל המינים. הגדר אזור המינימלי חלקיקים ב 2 מיקרומטר2 וקישוריות ל- 7 מיקרומטר.
הערה: דגים, הערך המינימלי של חלקיקים באזור נעה בין 2-5 מיקרומטר וקישוריות תלוי את מהירות spermatozoa את קצב המסגרות. - שמור את הסידור.
- בחר ללכוד.
-
לנתח את הזרע צלופח האירופית עם תוכנה
- הכינו את הפתרון activator (מי ים מלאכותי) על-ידי הוספת 0.946 גר' מלח מסחרי 25 מ ל מים מזוקקים עם 2% BSA.
- לקחת 500 מ"ל של פתרון activator (מי ים מלאכותי) ומניחים על המקפצה קריר יותר.
הערה: באופן כללי, דגים זרע מופעל על-ידי אירוע שוק אוסמוטי, למרות עבור מינים מסוימים ריכוז יון יכול גם להיות חשוב. מים מתוקים מינים, המדיום activator צריך להיות osmolality היפוטוניק, בעוד מינים ימיים המדיום צריך להיות hypertonic. - להכניס לחדר הספירה מתחת לבמה קירור ולחכות עד מייצבת הטמפרטורה עד 4 ° C.
- מערבבים את activator ואת הזרע מדולל להפעיל spermatozoa ולהתחיל את תנועתיות ההקלטה בין 5-10 s לאחר ההפעלה.
- לקחת 4 µL activator פתרון ומקום בתא ספירה.
- Homogenize בעדינות את הזרע מדולל ע י ניעור של microcentrifuge 3 פעמים כדי למנוע נזק בתאים spermatozoa.
- לקחת 0.5 µL של זרע מדולל, מערבבים עם activator, שים את המכסה בתא הספירה במהירות.
הערה: שלב זה לא אמור לקחת יותר מ 5 s כדי להתחיל את הניתוח בהקדם האפשרי. - להתמקד על תאים spermatozoa ולמצוא את האזור החזותי הטוב ביותר, אשר מוגדר על ידי מספר נמוך של spermatozoa (150-200 תאים) כדי להימנע יירוט בין תאים (איור משלים 1A). בחר ללכוד וידאו כדי להשיג את המסילה spermatozoa, אשר מופרדים לפי מהירות.
- בחר ללכוד כדי לקבל 3 עד 7 שדות, המהווים מרווח הזמן האופטימלי כדי להשיג את השתנות התחתון בתוצאות, והמשך כמו קודם. סרטי הרשומה עד 120 s אחר-הפעלה על מנת למנוע עיבוי על השער של תא ספירה.
- בחר יציאה כדי לקבל מראה כללי של כל השדות.
4. לקבל נתונים תנועתיות
- בחר שדות | חלקית | שמור ובחרו שם קובץ. לחץ על שמור.
הערה: הגיליון מספק ערכים אכזרי של נתונים חלקיים, תרשימים ותמונות של רצועות spermatozoa. - בחר נתונים כלליים | שם הקובץ | להציל את.
הערה: הנתונים מספקים קינטי ערכים בודדים spermatozoa של כל השדות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח של אפקט הזמן על תנועתיות הזרע
במקרה של הצלופח האירופית, האחוז של spermatozoa סטטי עלה מ 15 s ל 120 s לאחר ההפעלה (מ- 24.4% ל- 40.7%), ואת האחוז של ניידת spermatozoa מתקדמת ירד (מ 36.9% 20.9%) (איור 1A ו 1B). מבוסס על מהירות, spermatozoa תאים הראה ירידה מהירות לאורך זמן (איור 1C וד' 1) ירד. האחוז של spermatozoa עם מהירות מהירה ירד כ- 23% (מ- 49.4% ל- 26.6%) והגדילה אחוז spermatozoa עם מהירות בינונית סביב 7%.
האפקט של קצב המסגרות, חדר הספירה
מינים שונים דורשים קצב תמונות שונות לקבלת תוצאות אופטימליות. חדקן רוסי דורש 150 מסגרות לשנייה (fps; איור 2 א); קרפיון מצוי דורש 100 fps (איור 2B); לכיס, 200 fps לא היה מספיק להשיג תוצאות אופטימליות קינטי (איור 2C). תוצאות אלו לא היו תלויים העומק של ספירת לשכת נבדק (איור 2 א-2 C).
מבנה subpopulations זרע
הזיהוי של זרע subpopulation מבוסס על ניתוח סטטיסטי. הצעד הראשון הוא קביעת המנהל רכיבים (ניתוח גורמים ראשיים; PCA) מ הערכה המלאה של תנועתיות נתונים. לאחר מכן, ההליכים קיבוץ באשכולות מבוצעים עם מדדי זרע-derived שהושג לאחר PCA.
במחקר זה, השתמשנו זרע סלמון אטלנטי אשר הראו ארבע subpopulations שונים, בשם: איטי לא לינארית (נמוך לין, STR ו צ'לו), מהר לא לינארית (התחתון STR, צ'לו גבוהה), לינאריות במהירות (גבוהה לין, STR ו צ'לו) וארוך המהירה (הגבוהה לין, STR ו צ'לו). ההתפלגות של אלה subpopulations מגוונות לאורך דורות של חיות בר כדי מגודלים אלה (איור 3).
איור 1 : השפעה של הפעלת שלאחר זמן על מימון ועל תנועתיות הזרע צלופח האירופית. A ו- B) אחוזי מימון-15 ו- 120 s, בהתאמה; ו- C ו- D) האחוז של תנועתיות המבוססת על מהירות לאורך זמן (15 ו 120 s שלאחר הפעלה, בהתאמה). מימון חולקה לשלוש קבוצות: תאי תאי פרוגרסיבי (לבן; צ'לו מתכוון ערך ± SD: 114.5 ± 18.2 ו- 101.4 ± 34.5 מיקרומטר/s עבור s 15 ו- 120, בהתאמה), אין תאים תאי פרוגרסיבי (אפור; צ'לו מתכוון ערך ± SD: 84.8 ± 17.4 מיקרומטר/s עבור 15 s ו 84.6 ± 16.5 מיקרומטר/s תמורת 120 s), ו spermatozoa סטטי (שחור). מהירות spermatozoa היה מחולק ל 4 קבוצות: מהירה (צ'לו מתכוון ערך ± SD: 119.3 ± 13.7 מיקרומטר/s עבור 15 s ו 118.9 ± 13.3 מיקרומטר/s תמורת 120 s; לבן), בינוני (צ'לו מתכוון ערך ± SD: 79.7 ± 15.5 מיקרומטר/s עבור 15 s ו- 79.6 ± 15.5 מיקרומטר/s תמורת 120 s; אפור בהיר) , איטי (צ'לו מתכוון ערך ± SD: 32.9 ± 6.5 מיקרומטר/s עבור 15 s ו- 32.6 ± 6.6 מיקרומטר/s תמורת 120 s; אפור כהה), סטטי (שחור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ההשפעה של קצב המסגרת ואת החדר ספירה בשלושה מינים של דגי: (א) קרפיון מצוי (ב) חדקן רוסי ו- (ג) לכיס. זרע הניתוח בוצע ב 50, 100, 150, 200 fps, באמצעות ספירת מסחרי שני צ'יימברס בעומקים שונים (10 ו- 20 מיקרומטר). העיגול השחור מייצג את קצב המסגרות הטוב ביותר עבור כל המינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : זרע המבנה subpopulations של שלושה דורות של סלמון אטלנטי: גברים פראית (F0), ו את שני דורות הראשון המיוצר בשבי (F1, F2). אחרי ניתוח האשכולות, נצפו subpopulations 4: איטי spermatozoa לא לינארית (נמוך לין, STR וצ'לו; אשכול 1; שחור), מהר spermatozoa לא לינארית (STR התחתון, צ'לו גבוהה אשכול 2; אפור כהה), מהיר spermatozoa ליניארית (לין גבוהה, STR ו צ'לו שכונה 3; ביניים אפור), המהירה ליניארי spermatozoa (הגבוהה לין, STR ו צ'לו אשכול 4; אפור בהיר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 1. אזורים חזותיים שונים מניתוח תנועתיות הזרע צלופח האירופית כהגדרתו (א) מחירי וריכוז תא הגרוע (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התוכנה ניתוח זרע בשימוש פרוטוקול זה שימש על ידי חוקרים ברחבי העולם עבור מינים שונים, כולל דגים. עם זאת, דגים יש מספר תכונות ספציפיות יכול להשפיע על ההערכה זרע. דגים spermatozoa הראו מהירות גבוהה ברגע של ההפעלה אשר מסרב במהירות, מוביל זמן קצר של תנועתיות לאחר ההפעלה. חוץ מזה, הטמפרטורה של רבייה היא תלוית מין ו, במקרים מסוימים, יכול להיות בסביבות 4 ° C2,4,8,12. לכן, זה הכרחי להפוך כמה עיבודים כדי לשפר את היעילות של מערכת ממוחשבת לניתוח זרע של דג. העיקרון הבסיסי של הפרמטר תנועתיות היא רכישה של ניתוח של תמונות עוקבות של תאי spermatozoa. רוב מערכות להשתמש בתעריפי מסגרת רגיל (16, 25, 30, 50 או 60 fps) עקב מגבלות חומרה ותוכנה17,18,19,20,21,22. עם זאת, מספר מחקרים הראו כי שיעור גבוה יותר של מסגרת מגבירה את מספר פרמטרים מהירות, כגון צ'לו, STR, BCF15,23,24. דבר זה חשוב במיוחד כאשר יש צורך להעריך את hyperactivation של spermatozoa ולמצוא מהירות מקסימלית של spermatozoa11,17,18,19, 25. ביחס הטמפרטורה של ניתוח, צלחת קירור מיקרוסקופ אופטי, טכנולוגיה חדשה לקרר את דגימות בטמפרטורה קבועה יכול גם לשפר את הניתוח לאורך זמן. העבודה הנוכחית מציעה גישה כדי לפתור את שתי הבעיות העיקריות המשויך דגים זרע תנועתיות ניתוח וטמפרטורה בוגר. למרות התוצאות התמקדות מים מתוקים מינים מסוימים, מתודולוגיה זו יכולה לשמש עבור מינים ימיים, למרות המדיום ההפעלה צריך להיות מותאם לכל מין.
בשוק, ישנם מגוון של מוצרים או אפילו גרסאות של אותו מוצר. גם אם המערכות עשוי להיות אותו עיקרון, לכל אחד יש פרטים שונים וכתוצאה מכך בעיית אי התאימות של תוצאות26,27,28. חוץ מזה, הערכת איכות הזרע דגים יכול עדיין יש מגבלות מתודולוגי וטכני. את שיטת ההפעלה של זרע המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות שני גורמים חיוניים המשפיעים על3029,הערכת איכות הזרע בזמן ניתוח לאחר ההפעלה. הזמן בין ההפעלה של דגימות זרע ייצוב תמונה הקלטות וידאו צריך להיות בסביבות 5 s מאז השניות הראשונות (מרווח זמן של 5-20 s) מספק את2,השימושיים ביותר נתונים4. הזמן של ניתוח הזרע עשוי להיות מוגבל בשל בעיות עיבוי על השקופית זכוכית. עם זאת, דגים spermatozoa יהיו פעילים בתנועה נמרצת למשך פחות מ 2 דקות2. ברמה הטכנית, יש צורך לדעת את קצב המסגרות "אופטימלית" כדי לקבל מידע מפורט שנותן של שחזור מדויק של מסלולים spermatozoa15. בקצבי מסגרות נמוכים יותר, הפרטים של המסלול אינם נשמרים, במיוחד עבור spermatozoa לא לינארית ומהירה, בעוד בקצבי מסגרות גבוהים המידע הופך להיות מיותר15,31. עבור מינים דגים מסוימים, קצב המסגרת (עד 250 fps) לא יהיה מספיק. כדי למצוא מהירות מקסימלית של spermatozoa עבור מינים מסוימים של דגים, כגון לכיס וסלמון. זו וריאציה מינים ספציפיים, יש להגדיר עבור כל המינים לתקנן את הפרוטוקול ולהשיג תוצאות אמינות15,23,24. העומק של חדר הספירה עלולה להגביל את תנועת שוטון גדול של דגים, spermatozoa לא יכול היה להגיע מהירות מירבית-11,-32,-33. חוץ מזה, התוכנה ייתכנו כמה מגבלות זיהוי spermatozoa אמיתי כאשר ישנה הצטלבות של תאים.
הערכת קלאסית באיכות הזרע הוא ניתוח סובייקטיבית המבוסס על הערכת הריכוז ואחוז של תנועתיות, אשר ניתן להפיק השתנות על התוצאות. עם זאת, מערכת ממוחשבת מספק מדידות מהיר, מדויק ולא כמותית של תנועתיות פרמטרים. ניתוח אובייקטיבי זה נותן כמות גדולה של נתונים ומפחית את ההשתנות של תוצאות34,35,36,37. התגובה של התנהגות תנועתיות הזרע תלוי בטמפרטורה של הניתוח, משתנה בין המינים-38,-39,-40. טמפרטורה אופטימלית של ניתוח זרע יכול לספק מהירות זרע ואת משך תקופת תנועתיות דומים לתנאים הטבעיים של רבייה38,40. לכן, זרע ניתוח תוכנה עם התקני הצינון משפר את הערכת איכות הזרע דגים.
התוצאות של ניתוח איכות הזרע יכולה לשפר את הידע בנושא דגים זרע המאפיינים ואיכות בהתבסס על זרע subpopulations, אשר עשוי להיות העתיד של זרע הערכה כל מיני בעלי חיים41,42. ברמה המעשית, טכניקה זו יכולה להיות אינדיקטור של מגדלים באיכות גבוהה ומסייע כדי לקבל מידע נוסף על הזרע סלקציה, חישוב מנות הזרע להפריה מלאכותית, תחרות זרע המבוססת על מהירות, מימון, פוריות פוטנציאלי. כל הידע הזה ניתן להחיל על תחומי מחקר שונים כולל תוכניות שימור מדגה, אשר מגרה את עניין דגים זרע אחסון, הקפאה קריוגנית האחרון עשרות שנים2,13. תופעות רעילות גם נעשים עניין מיוחד בשל בעיות סביבתיות, כמו גם לימודי הפיתוח של מחקרים phylogenetical מבוסס על4443,מאפיינים תנועתיות הזרע.
עבודה זו הראו איך אופטימיזציה של תוכנה אוטומטית לניתוח תנועתיות הזרע דגים משפר את התוצאות. סטנדרטיזציה של הפרוטוקול יש לקחת בחשבון את הטמפרטורה של הניתוח והן את קצב המסגרות, אשר יכול להיות שונה בהתאם למין. עם זאת, הניתוח של תנועתיות הזרע דגים יש שני שלבים קריטיים החוקר צריך לשים לב. אוסף זרע היא השלב הקריטי הראשון שיכולה להרוס את הדגימה עקב מציג צואה, שתן, מים (מי ים או מים מתוקים). הנקודה הקריטית השנייה קשורה ברגע של הפעלת הזרע לבין תחילת הקלטות וידאו. שלב זה צריך להיעשות בהקדם האפשרי כדי לאסוף נתונים כשיש spermatozoa הנמרצים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
הפרויקט קיבל מימון העמותה עלות (מזון, חקלאות עלות פעולה FA1205: AQUAGAMETE, ותוכנית של האיחוד האירופי אופק 2020 מחקר וחדשנות תחת מארי Sklodowska-קירי פרויקט מראה מרהיב (GA לא 642893). ברצוננו להודות הצוות המדעי של PROiSER, במיוחד כדי שהתלמיד אלברטו וונדרל ברנאבאו עבור השתתפותו הפעילה הקלטת וידאו של פרויקט זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
- Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
- Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
- Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
- Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
- Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
- Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
- Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
- Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout - the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
- Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis? Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
- Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
- Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
- Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
- Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
- Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
- Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
- Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
- Holt, W. V., O'Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
- Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
- Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
- Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
- Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
- Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
- Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
- David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
- Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
- Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
- Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
- Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
- Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
- Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
- Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
- Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
- Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).
