Summary
Il presente protocollo descrive una procedura di valutazione di sperma di pesce mediante analisi computerizzata dello sperma e dispositivi di raffreddamento. Il software dà un rapido, accurato e l'analisi quantitativa della qualità dello sperma di pesce basata sulla motilità degli spermatozoi, che può essere un utile strumento nel settore dell'acquacoltura per migliorare il successo di riproduzione.
Abstract
Per la valutazione della qualità dei gameti, esistono tecniche innovative, rapide e quantitative che possono fornire dati utili per l'acquacoltura. Sistemi computerizzati per l'analisi dello sperma sono stati sviluppati per misurare diversi parametri e uno dei più comunemente misurato è la motilità degli spermatozoi.
Inizialmente, questa tecnologia informatica è stata progettata per specie di mammiferi, anche se può anche essere utilizzato per l'analisi dello sperma dei pesci. I pesci hanno caratteristiche specifiche che possono influenzare la sperma valutazione come un momento di breve motilità dopo l'attivazione e, in alcuni casi, adattamento a temperature più basse. Pertanto, è necessario modificare i componenti hardware e software per analisi di motilità più efficiente per l'analisi dello sperma dei pesci. Per gli spermatozoi dei mammiferi, la piastra di riscaldamento viene utilizzata per mantenere la temperatura ottima di spermatozoi. Tuttavia, per alcune specie di pesci, è vantaggioso utilizzare una temperatura più bassa per prolungare la durata della motilità, dato che gli spermatozoi rimangono attivi per meno di 2 min. Di conseguenza, dispositivi di raffreddamento sono necessari per refrigerare i campioni a temperatura costante sopra il tempo di analisi, tra cui il microscopio ottico. Questo protocollo descrive l'analisi di motilità dello sperma di pesce utilizzando il software per l'analisi dello sperma e nuovi dispositivi per ottimizzare i risultati di raffreddamento.
Introduction
L'efficacia di riproduzione dipende dalla qualità dei due gameti (uova e spermatozoi)1,2. Questo è il fattore principale che contribuisce alla fecondazione, permettendo lo sviluppo di prole vitale3,4. Il conveniente valutazione della qualità dei gameti è lo strumento migliore per definire il potenziale di fertilità di un esemplare.
Miscelazione di sperma da più maschi è una pratica comune nella produzione di molte specie acquatiche commerciali4. Tuttavia, la variabilità di sperma tra maschi può portare a concorrenza dello sperma e, di conseguenza, non tutti i maschi sono ugualmente contribuendo al pool genico5. In questo senso, la corretta valutazione delle caratteristiche individuali eiaculare/spermatozoi, come motilità, è fondamentale per ottenere informazioni discriminatorie per quanto riguarda la fertilità maschile individuale potenziale. Osservazione diretta di motilità dello sperma può produrre dati inesatti e soggettivi come richiede tempo ed esperienza, che porta a una mancanza di coerenza e incompatibilità di risultati6,7. Tuttavia, ci sono molte tecniche innovative, rapide e quantitative che possono fornire un affidabile sperma qualità analisi2,4.
Analisi computerizzata dello sperma è stata sviluppata per offrire dati accurati su sperma qualità8. Questa tecnologia comprende lo sviluppo di software associato con un microscopio di contrasto di fase che permette la valutazione della motilità spermatica. Tuttavia, un fattore limitante del parametro motilità è la frequenza dei fotogrammi della telecamera. Individuali degli spermatozoi traiettorie si basano su spermatozoi testa posizione di baricentro in fotogrammi consecutivi di registrazioni video, che è correlata con il movimento flagellare modelli3,9,10, 11. i principali parametri cinetici misurati sono la velocità lineare (VSL), la velocità curvilinea (VCL) e la velocità di percorso medio (VAP). VSL è la distanza tra l'inizio e il punto finale presi dagli spermatozoi divisi da tempo. VCL è la reale velocità lungo la traiettoria precisa presa di spermatozoi. VAP è la velocità lungo un percorso levigato derivata della traiettoria. Questi parametri consentono ulteriori informazioni cinetiche, tra cui linearità (LIN), rettilineità (STR), wobble (WOB) e misurazioni di battitura come ampiezza di movimento laterale della testa (ALH) e frequenza di battimento-Croce (BCF)4,10.
Il sistema di analisi dello sperma è stato originariamente utilizzato per specie di mammiferi, e uno dei requisiti per il sistema è quello di operare alla temperatura corporea del donatore (circa 37 ° C). Questo software potrebbe essere utilizzato anche per le specie ittiche; anche se, è necessario effettuare alcuni adattamenti per ridurre l'errore di risultati di analisi dello sperma. In alcune specie di pesci, come i salmonidi e anguille8,12, la fecondazione avviene a bassa temperatura (circa 4 ° C)2,4. Così, dispositivi di raffreddamento dovrebbero essere sviluppato per evitare scomode condizioni di lavoro. Inoltre, gli spermatozoi di pesce sono immotile nel liquido seminale e richiedono un shock osmotico per attivare la motilità. Per le specie d'acqua dolce, il mezzo di attivatore dovrebbe avere osmolalità ipotonico, mentre per le specie marine il mezzo dovrebbe essere ipertonico. Tuttavia, per alcune specie, come i salmonidi, la concentrazione di ioni potrebbe anche essere importante3,4,9. Dopo l'attivazione, sperma di pesce è caratterizzato da una rapida diminuzione della motilità (meno di 2 min)13,14 e ad alta velocità, essendo essenziale per determinare la frequenza di fotogrammi ottimale per ottenere dati affidabili15.
Gli obiettivi di questo studio sono per progettare e applicare sistemi di refrigerazione per campioni di sperma di pesce. Inoltre, il presente protocollo definisce le modalità determinare i tassi di fotogrammi ottimale per l'istituzione di protocolli standard a seconda della specie. L'utilizzo di questo protocollo apre nuove porte nel contesto della valutazione seminale pesce, utilizzando l'anguilla europea come un modello.
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Protocol
Procedure che coinvolge soggetti animali sono stati approvati (2015/VSC/pisello/00064) dalla direzione generale della produzione agricola e del bestiame presso la Universitat Politècnica de València.
1. raccogliere lo sperma da anguille adulte europee in cattività
Nota: Maschi di anguilla europea uso mantenuti in vasche con acqua di mare e un sistema di ricircolo a temperatura costante (20 ° C). Trattare con gli ormoni attraverso iniezione intraperitoneale settimanale (gonadotropina corionica umana (hCG); 1,5 IU / g del peso corporeo di pesce). Acclimatare pesci gradualmente, cominciando con 3 giorni in acqua dolce seguita da sostituzione con acqua di mare (1/3 del totale dell'acqua del serbatoio) ogni 2 giorni fino a raggiungere una salinità di 37,0 g/mL.
- Anestetizzare l'Anguilla 24 h dopo l'iniezione di ormone per ottenere campioni con migliore qualità dello sperma.
- Preparare in anticipo l'anestesia: aggiungere 300 mg di benzocaina per 100 mL di etanolo al 70%. Mescolare bene e conservare a 4 ° C.
- Diluire benzocaina in un secchio flessibile con 5 L di acqua dell'impianto per ottenere una concentrazione finale di 60 mg/L e mescolare bene.
- Trasferire il pesce al secchio con acqua dell'impianto e benzocaina. Attendere alcuni minuti fino a quando il pesce si calmi.
- Cancellare l'area genitale con acqua e asciugare con carta assorbente per evitare la contaminazione dei campioni di sperma da feci, urine o acqua di mare.
- Applicare una leggera pressione nella zona addominale e raccogliere i campioni di sperma in tubi di plastica da 15 mL con la pompa a vuoto. Volume di sperma fino a 6-7 mL, a seconda del maschio.
- Mantenere i campioni di sperma a 4 ° C per almeno 1 h fino a motilità analisi viene svolta.
2. mettere in frigorifero e diluire i campioni di sperma
- Preparare la soluzione di diluente in anticipo.
Nota: I campioni di sperma devono essere diluiti in soluzione di estensione specifica per ciascuna specie.- Preparare il supporto non-attivatore per campioni di sperma di Anguilla (P1 medio). Aggiungere 0,42 g di bicarbonato di sodio, 1,828 g di cloruro di sodio, 0,127 g di cloruro di magnesio, 0,56 g di cloruro di potassio e 0,037 g di cloruro di calcio a 250 mL di acqua distillata. Miscela bene per dissolvere. Conservare a 4 ° C.
- Impostare il blocco di raffreddamento a 4 ° C per mantenere i campioni a temperatura costante. Attendere che la temperatura si stabilizzi.
- Diluire i campioni di sperma usando il DILUENTE soluzione specifici per ogni specie.
Nota: Il rapporto di diluizione è specie specifico e deve essere definito per standardizzare il protocollo. In primo luogo, stimare la concentrazione di spermatozoi basata sulla concentrazione ottenuta in pre-analisi della motilità utilizzando software, come spiegato nei passaggi 3 e 4. Con questa analisi, è anche possibile selezionare i migliori campioni di sperma sulla base della percentuale di motilità. Dopo questo, il ricercatore può iniziare a raccogliere dati per l'esperimento con i migliori campioni con la giusta concentrazione.- Diluire i campioni di sperma di Anguilla in mezzo P1 con un rapporto di 01:50. Per preparare 500 µ l di sperma diluito di Anguilla, aggiungere 50 µ l del campione di sperma fresco e 450 µ l di P1. Mescolare bene.
3. valutare i parametri di motilità dello sperma
-
Set-up del modulo di motilità del Software
- Impostare la fase di raffreddamento a 4 ° C e attendere finché non si stabilizza.
- Aprire il software e selezionare il Modulo di motilità. Se necessario, creare nome utente e password.
- Selezionare Proprietà e scegliere i parametri desiderati prima di iniziare l'analisi dello sperma.
- Fare clic su specie di | Pesce.
- Selezionare i Fotogrammi al secondo e il Numero di immagini, a seconda delle condizioni tecniche migliori per ciascuna specie. Impostare entrambe le opzioni 120 immagini al secondo.
- Scegliere contrasto negativo. È obbligatorio per la ricostruzione accurata delle traiettorie spermatozoi16.
- Selezionare la corrispondente Camera di conteggio e la scala della videocamera. Calibrare la videocamera per la lente di ingrandimento usata nell'esperimento. Impostare SpermTrack10 come camera di conteggio e 10 X scala.
Nota: In generale, una profondità di 10 µm nella camera di conteggio e una lente di ingrandimento di 10x sono condizioni raccomandate poiché forniscono la migliore messa a fuoco di tutti gli spermatozoi e catturare il maggior numero di cellule. Tuttavia, si consiglia di fare uno studio precedente delle condizioni ottimali per l'analisi di motilità di ogni specie. - Regolare l'Area delle particelle e la connettività per ciascuna specie. Impostare area minima particella a 2 µm2 e connettività a 7 µm.
Nota: Per i pesci, il valore minimo di particelle zona varia tra 2-5 µm e connettività dipende la velocità di spermatozoi e il frame rate. - Salvare il set-up.
- Selezionare cattura.
-
Analizzare lo sperma di anguilla europea con Software
- Preparare la soluzione di attivatore (acqua di mare artificiale) aggiungendo 0,946 g di sale commerciale a 25 mL di acqua distillata con 2% BSA.
- Prendere 500 mL di soluzione di attivatore (acqua di mare artificiale) e nel blocco di raffreddamento.
Nota: In generale, la sperma di pesce viene attivato da un evento shock osmotico, anche se per alcune specie la concentrazione di ioni potrebbe inoltre essere importante. Per le specie d'acqua dolce, il mezzo di attivatore dovrebbe avere osmolalità ipotonico, mentre per le specie marine il mezzo dovrebbe essere ipertonico. - Mettere la vaschetta del conteggio sotto la fase di raffreddamento e attendere che la temperatura si stabilizza a 4 ° C.
- Mescolare l'attivatore e sperma diluito per attivare gli spermatozoi e avviare la registrazione tra 5-10 s dopo l'attivazione del video di motilità.
- Prendere 4 µ l di soluzione attivatore e posto nella camera di conteggio.
- Delicatamente e omogeneizzare lo sperma diluito agitando microcentrifuga 3 volte per evitare danni in cellule di spermatozoi.
- Prendere 0,5 µ l di sperma diluito, mescolare con l'attivatore e riporre il coperchio della camera di conteggio rapidamente.
Nota: Questo passaggio non dovrebbe richiedere più di 5 s per avviare l'analisi appena possibile. - Concentrarsi sulle cellule degli spermatozoi e trovare la migliore area visiva, che è definito da un numero basso di spermatozoi (150-200 celle) per evitare l'intercettazione tra cellule (Supplemental Figura 1A). Selezionare Acquisisci Video per ottenere le tracce di spermatozoi, che sono separate in base alla velocità.
- Selezionare Capture per ottenere campi da 3 a 7, che sono l'intervallo ottimale per ottenere una bassa variabilità nei risultati e procedere come prima. Registrare video fino a 120 post-attivazione s al fine di evitare fenomeni di condensa sul coperchio della camera di conteggio.
- Selezionare uscita per avere una visione generale di tutti i campi.
4. ottenere i dati di motilità
- Selezionare campi di | Parziale | Salvare e scegliere un nome di file. Fare clic su Salva.
Nota: Il foglio di calcolo fornisce i valori medi di dati parziali, grafici e immagini di tracce di spermatozoi. - Selezionare dati generali | Nome del file | Salvare.
Nota: I dati forniscono valori cinetici per spermatozoi individuali di tutti i campi.
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Representative Results
Analisi dell'effetto tempo sulla motilità dello sperma
Nel caso l'anguilla europea, la percentuale degli spermatozoi statici aumentato da 15 s a 120 s dopo l'attivazione (dal 24,4% al 40,7%) e la percentuale di spermatozoi mobili progressivi è diminuito (da 36,9% al 20,9%) (Figura 1A e 1B). Basato su velocità, le cellule degli spermatozoi hanno mostrato una diminuzione nella velocità nel tempo (Figura 1 e 1 D) è diminuito. La percentuale di spermatozoi con rapida velocità diminuita di circa il 23% (da 49,4% al 26,6%) e la percentuale di spermatozoi con velocità medio aumentato circa 7%.
L'effetto della frequenza dei fotogrammi e camera di conteggio
Diverse specie richiedono diversi frame rate per ottenere risultati ottimali. Storione russo richiede 150 fotogrammi al secondo (fps; Figura 2A); carpa comune richiede 100 fps (Figura 2B); e per il temolo, 200 fps non era sufficiente per ottenere risultati ottimali di cinetici (Figura 2). Questi risultati non erano dipendenti dalla profondità del conteggio camera testato (Figura 2A-2 C).
Struttura di sottopopolazioni di sperma
L'identificazione della sottopopolazione di sperma si basa sull'analisi statistica. Il primo passo è la determinazione dei principali componenti (analisi delle componenti principali; PCA) dall'insieme completo dei dati di motilità. Quindi, vengono eseguite le procedure di clustering con gli indici di sperma-derivati ottenuti dopo la PCA.
Per questo studio, abbiamo usato lo sperma di salmone atlantico che ha mostrato quattro sottopopolazioni differenti, che si chiamano: lento non lineari (basso LIN, STR e VCL), veloce non lineari (STR inferiore, alta VCL), rapido lineare (alta LIN, STR e VCL) e più rapida lineare (LIN più alta, STR e VCL). La distribuzione di queste sottopopolazioni variato lungo generazioni dagli animali selvatici d'allevamento ones (Figura 3).
Figura 1 : Effetto di post-attivazione time sulla progressività e motilità degli spermatozoi di anguilla europea. A e B) percentuale di progressività alle 15 e 120 s, rispettivamente; e C e D) la percentuale di motilità basata sulla velocità nel tempo (15 e 120 post-attivazione s, rispettivamente). La progressività è stato diviso in tre gruppi: cellule motili progressive (bianco; VCL significa valore ± SD: 114,5 ± 18,2 e 101.4 ± 34.5 µm/s per 15 e 120 s, rispettivamente), senza cellule motili progressive (grigio; VCL significa valore ± SD: 84,8 ± 17.4 µm/s per 15 s e 84,6 ± 16,5 µm/s per 120 s) e gli spermatozoi statici (nero). La velocità degli spermatozoi è stato diviso in 4 gruppi: rapido (VCL significa valore ± SD: 119,3 ± 13,7 µm/s per 15 s e 118,9 ± 13,3 µm/s per 120 s; bianco), medio (VCL significa valore ± SD: 79,7 ± 15,5 µm/s per 15 s e 79,6 ± 15,5 µm/s per 120 s; grigio chiaro) , lento (VCL significa valore ± SD: 32,9 ± 6,5 µm/s per 15 s e 32,6 ± 6,6 µm/s per 120 s; grigio scuro) e statico (nero). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : L'effetto del frame rate e la camera di conteggio in tre specie di pesci d'acqua dolce: (A) storione russo (B) Common carp e (C) Temolo. Analisi dello sperma sono stata effettuata a 50, 100, 150 e 200 fps, utilizzando due conteggio commerciale chambers con diverse profondità (10 e 20 µm). Il cerchio nero rappresenta la migliore frequenza di fotogrammi per ogni specie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Struttura di sottopopolazioni di sperma di tre generazioni di salmone atlantico: maschi selvatici (F0) e le prime due generazioni prodotte in cattività (F1 e F2). Dopo analisi dei cluster, sono state osservate quattro sottopopolazioni: rallentare gli spermatozoi non lineari (basso LIN, STR e VCL; cluster 1; nero), veloce gli spermatozoi non lineari (STR inferiore, alta VCL; cluster 2; grigio scuro), veloce spermatozoi lineari (LIN alta, STR e VCL; cluster 3; intermedio di grigio) e più veloce degli spermatozoi lineari (più alto LIN, STR e VCL; cluster 4; grigio chiaro). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare nella figura 1. Diverse aree visive dall'analisi della motilità degli spermatozoi di anguilla europea definiti come migliore (A) e (B) peggiore della concentrazione cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il software di analisi dello sperma utilizzato in questo protocollo è stato utilizzato dai ricercatori in tutto il mondo per le diverse specie, tra cui pesce. Tuttavia, i pesci hanno alcune caratteristiche specifiche che possono influenzare la valutazione di sperma. Spermatozoi di pesce ha mostrati ad alta velocità al momento dell'attivazione che declina rapidamente e conduce ad un a breve termine della motilità dopo l'attivazione. Inoltre, la temperatura della riproduzione è specie-dipendente e, in alcuni casi, potrebbe essere intorno a 4 ° C2,4,8,12. Pertanto, è necessario effettuare alcuni adattamenti per migliorare l'efficienza di un sistema computerizzato per l'analisi dello sperma dei pesci. Il principio di base del parametro di motilità è l'acquisizione e l'analisi di immagini successive degli spermatozoi mobili. Maggior parte dei sistemi utilizza standard frame rate (16, 25, 30, 50 o 60 fps) a causa di limitazioni di hardware e software17,18,19,20,21,22. Tuttavia, alcuni studi hanno mostrato che un frame rate più elevato aumenta di alcuni parametri di velocità, come VCL, STR, BCF15,23,24. Ciò è particolarmente importante quando è necessario valutare l'iperattivazione di spermatozoi e trovare la velocità massima di spermatozoi11,17,18,19, 25. in relazione alla temperatura di analisi, una piastra di raffreddamento per il microscopio ottico e una nuova tecnologia di refrigerare i campioni a temperatura costante potrebbe anche migliorare l'analisi nel tempo. Il presente lavoro propone un approccio per risolvere due dei problemi principali connessi con la sensibilità di pesce sperma motilità analisi e temperatura. Nonostante i risultati concentrandosi su alcune specie d'acqua dolce, questa metodologia potrebbe essere utilizzata per le specie marine, anche se il mezzo di attivazione dovrebbe essere adattato per ogni specie.
Nel mercato, ci sono una gamma di prodotti o anche diverse versioni dello stesso prodotto. Anche se i sistemi possono avere lo stesso principio, ognuno ha diversi dettagli conseguente l'incompatibilità dei risultati26,27,28. Inoltre, la valutazione della qualità dello sperma di pesce potrebbe ancora avere limitazioni metodologiche e tecniche. La tecnica di attivazione dello sperma e il tempo di analisi dopo l'attivazione sono due fattori essenziali che possono influenzare lo sperma qualità valutazione29,30. Il tempo tra l'attivazione di campioni di sperma e la stabilizzazione dell'immagine per le registrazioni video dovrebbe essere circa 5 s dopo i primi secondi (intervallo di tempo di 5-20 s) fornisce i dati più utili2,4. Il tempo di analisi dello sperma può essere limitato a causa di problemi di condensa su vetrino. Tuttavia, gli spermatozoi pesce rimangono attivi con un vigoroso movimento per meno di due minuti2. A livello tecnico, è necessario conoscere la frequenza di fotogrammi "ottimale" per ottenere informazioni di dettaglio che dà un'accurata ricostruzione delle traiettorie spermatozoi15. A basso frame rate, i dettagli della traiettoria sono persi, in particolare per gli spermatozoi non lineari e veloci, mentre al frame rate più elevati, le informazioni diventano ridondanti15,31. Per alcune specie di pesci, il frame rate (fino a 250 fps) potrebbe non essere sufficiente per trovare la velocità massima di spermatozoi per alcune specie di pesci, come il temolo e salmone. Questa variazione è specie specifico e deve essere definita per ciascuna specie di standardizzare il protocollo e ottenere risultati affidabili15,23,24. La profondità della camera di conteggio può limitare il movimento del grande flagello di pesce e gli spermatozoi non potevano raggiungere la velocità massima11,32,33. Inoltre, il software potrebbe avere alcune limitazioni nella rilevazione degli spermatozoi reale quando c'è un incrocio delle cellule.
Valutazione classica di qualità dello sperma è un'analisi soggettiva basata sulla stima della concentrazione e della percentuale di motilità, che può determinare una variabilità dei risultati. Tuttavia, un sistema computerizzato fornisce misurazioni rapide, precise e quantitative dei parametri di motilità. Questa analisi obiettiva dà una grande quantità di dati e riduce la variabilità dei risultati34,35,36,37. La risposta del comportamento di motilità dello sperma dipende dalla temperatura dell'analisi e varia tra le specie38,39,40. Temperatura ottimale dell'analisi dello sperma potrebbe fornire velocità di sperma e la durata del periodo di motilità, simile alle condizioni naturali di riproduzione38,40. Di conseguenza, software di analisi dello sperma con dispositivi di raffreddamento migliora la valutazione della qualità dello sperma di pesce.
I risultati delle analisi di qualità dello sperma potrebbero migliorare la conoscenza circa le caratteristiche dello sperma di pesce e qualità basato su sottopopolazioni di sperma, che può essere il futuro della valutazione di sperma in tutte le specie animali41,42. A livello pratico, questa tecnica potrebbe essere un indicatore di qualità allevatori e aiuta ad ottenere ulteriori informazioni su sperma processo di selezione, calcolo di dosi seminale per inseminazione artificiale, competizione spermatica basato su velocità e progressività e fertilità potenziale. Tutta questa conoscenza può essere applicata a diversi campi di ricerca inclusi programmi di conservazione e dell'acquacoltura, che ha stimolato l'interesse nella conservazione dello sperma di pesce e la crioconservazione nelle ultime decadi2,13. Effetti tossicologici sono anche sempre interesse speciale a causa di problemi ambientali, come pure gli studi lo sviluppo di studi successivo basato su spermatozoi motilità caratteristiche43,44.
Questo lavoro ha dimostrato come l'ottimizzazione di un software automatico per analisi di motilità dello sperma di pesce migliora i risultati. Standardizzazione del protocollo deve tener conto della temperatura di analisi e il frame rate, che potrebbe essere diverso a seconda della specie. Tuttavia, l'analisi di motilità dello sperma di pesce ha due passaggi critici che il ricercatore dovrebbe prestare attenzione. Raccolta di sperma è il primo passo fondamentale che può distruggere il campione a causa di contaminazioni da feci, urine e acqua (acqua di mare o acqua dolce). L'altro punto critico è associato al momento dell'attivazione dello sperma e l'inizio delle registrazioni video. Questo passaggio dovrebbe essere fatto appena possibile per raccogliere i dati quando gli spermatozoi hanno movimento vigoroso.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dall'associazione di costo (cibo e agricoltura costo azione FA1205: AQUAGAMETE, programma ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea sotto il Marie Sklodowska-Curie progetto IMPRESS (GA No 642893). Vorremmo ringraziare il team scientifico di PROiSER, in particolare allo studente Alberto Vendrell Bernabéu, per la sua partecipazione attiva nella registrazione video di questo progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
- Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
- Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
- Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
- Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
- Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
- Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
- Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
- Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout - the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
- Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis? Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
- Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
- Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
- Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
- Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
- Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
- Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
- Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
- Holt, W. V., O'Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
- Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
- Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
- Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
- Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
- Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
- Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
- David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
- Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
- Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
- Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
- Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
- Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
- Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
- Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
- Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
- Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).
