Summary
Nåværende protokollen beskriver en fremgangsmåte av fisk sperm vurdering computer-assistert sperm analyse og kjøling enheter. Programvaren gir en rask, nøyaktig og kvantitativ analyse av fisk sperm kvalitet basert på spermatozoa motilitet, som kan være nyttig verktøy i akvakultur å forbedre reproduksjon suksess.
Abstract
For Kjønnscelle kvalitet evaluering finnes det nyskapende, rask og kvantitative teknikker som kan gi nyttig informasjon for akvakultur. En av de oftest måles er Spermiemotilitet datastyrte systemer for sperm analyse ble utviklet for å måle flere parametere.
I utgangspunktet ble denne datateknologi utviklet for pattedyrarter, selv om det kan også brukes for fisk sperm analyse. Fisken har bestemte funksjoner som kan påvirke sperm vurdering som en kort motilitet tid etter aktivering og, i noen tilfeller tilpasning til lavere temperaturer. Derfor er det nødvendig å endre både programvare og maskinvare komponenter slik at motilitet analyse mer effektiv for fisk sperm analyse. Pattedyr sæd brukes varmeplaten å opprettholde optimal temperatur spermatozoa. Men for noen fiskearter er det en fordel å bruke en lavere temperatur for å forlenge varigheten av motilitet, siden sperm forblir aktive for mindre enn 2 minutter. Kjøling enheter er derfor nødvendig å kjøle samples ved konstant temperatur over tid analyse, inkludert på optisk mikroskopet. Denne protokollen beskriver analyse av fisk Spermiemotilitet programvare for sperm analyse og nye kjøleenhetene å optimalisere resultatene.
Introduction
Effekten av reproduksjon, avhenger av kvaliteten på begge gameter (egg og sperm)1,2. Dette er den viktigste faktoren som bidrar til vellykket befruktning, slik at utviklingen av levedyktig avkom3,4. Praktisk evaluering av Kjønnscelle kvalitet er det beste verktøyet for å definere fruktbarhet potensialet i en prøve.
Blande sperm fra flere menn er en vanlig praksis i produksjon av mange kommersielle dyrearter4. Men sperm variasjon mellom menn kan føre til sæd konkurranse, og derfor ikke alle menn like bidrar til gener5. I denne forstand er riktig evaluering av personlige ejakulere/spermatozoa funksjoner, for eksempel motilitet, grunnleggende for få diskriminerende informasjon om individuelle mannlig fertilitet potensielle. Direkte observasjon av Spermiemotilitet kan gi unøyaktige og subjektive data som det krever tid og erfaring, som fører til manglende konsistens og uforlikelighet resultater6,7. Det er imidlertid mange nyskapende, rask og kvantitative teknikker som kan gi et pålitelig sperm kvalitet analyse2,4.
Computer-assistert sperm analyse ble utviklet for å gi nøyaktige data om sperm kvalitet8. Denne teknologien inkluderer utvikling av programvare som er knyttet til fase kontrast mikroskop som lar vurdering av Spermiemotilitet. En begrensende faktor motilitet parameteren er imidlertid bildefrekvens videokameraet. Individuelle spermatozoa baner er basert på spermatozoa leder centroid posisjon i påfølgende rammer på videoopptak, som er forbundet med flagellar bevegelse mønstre3,9,10, 11. de viktigste kinetic parametrene målt er lineære hastighet (VSL), beregner hastighet (VCL) og gjennomsnittlig banen hastighet (VAP). VSL er avstanden mellom start- og sluttpunktet tatt av spermatozoa delt tid. VCL er reelle hastigheten langs nøyaktige banen tatt av spermatozoa. VAP er hastigheten langs en avledet buede banen til banen. Disse parametrene kan kinetic tilleggsinformasjon, inkludert linearitet (LIN), rett linje (STR), vingle (WOB) og slo målinger som amplituden av hodet vridning (ALH) og beat-cross frekvens (milliarder Kubikkfot)4,10.
Sperm analyse systemet ble opprinnelig brukt til pattedyrarter, og et av kravene for systemet er å operere på kroppstemperaturen av donor (ca 37 ° C). Denne programvaren kan også brukes til fiskearter; Selv om det er nødvendig å gjøre noen tilpasninger å redusere antallet sperm analyseresultater. I enkelte fiskearter, som laks og ål8,12, oppstår befruktning ved lav temperatur (rundt 4 ° C)2,4. Dermed skal kjøleenheter utvikles for å unngå ubehagelig arbeidsforhold. I tillegg fisk spermatozoa er immotile i seminal væske og krever en osmotisk sjokk å aktivere motilitet. For ferskvannsarter ha aktivator mediet hypotonisk osmolality, mens for marine arter medium bør være hypertonic. Men for noen arter kan som laks, konsentrasjonen også være viktig3,4,9. Etter aktivisering, er fisk sperm preget av en svekkelse av motilitet (mindre enn 2 min)13,14 og høy hastighet, blir viktig å fastslå den optimale bildefrekvensen for å få pålitelige data15.
Målene med denne studien er å designe og bruke kuldeanlegg for fisk sperm prøver. I tillegg definerer denne protokollen fastslå de optimale bildefrekvens for etablering av standardprotokoller avhengig av arten. Bruk av denne protokollen åpner nye dører i sammenheng med fisk banebrytende evaluering, med europeisk som modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer som involverer dyr fag er godkjent (2015/VSC/ert/00064) av den generelle retningen av jordbruks produksjon og husdyr på Universitat Politècnica de València.
1. samle Sperm fra modne europeisk ål i fangenskap
Merk: Bruk europeisk menn vedlikeholdes i tanker med sjøvann og en resirkuleringssystemet konstant temperatur (20 ° C). Behandle med hormoner gjennom ukentlige intraperitoneal injeksjon (humant choriongonadotropin (hCG), 1,5 IU per g fisk kroppsvekt). Acclimatize fisk gradvis starter med 3 dager i ferskvann etterfulgt av erstatning med sjøvann (1/3 av totale vannet inne akvariet) hver 2 dager fram en saltholdighet i 37.0 g/mL.
- Bedøve ålen 24 timer etter hormon injeksjon til å innhente prøver med bedre kvaliteten.
- Forberede anestesi forhånd: legge til 300 mg benzocaine 100 mL 70% etanol. Bland godt og lagre på 4 ° C.
- Fortynne benzocaine i en fleksibel bøtte med 5 L system vann for å få en endelig konsentrasjon av 60 mg/L og blande riktig.
- Overføre fisken til bøtte med system vann og benzocaine. Vent noen minutter før fisken roe ned.
- Fjern genital området med vann og tørk med tørkepapir for å unngå forurensning av sæd prøver av avføring, urin eller sjøvann.
- Bruke lett trykk i abdominal området og samle sperm prøvene i 15 mL plast rør bruke vakuumpumpen. Sperm volum opp til 6-7 mL, avhengig av mannlige.
- Hold sperm prøver på 4 ° C i minst 1 time før motilitet analyse er gjennomført.
2. kjøle og fortynne Sperm prøvene
- Forbered den diluter løsningen på forhånd.
Merk: Sperm prøvene bør fortynnet i extender løsningen gjelder hver art.- Forberede ikke-aktivator mediet ål sperm prøver (P1 medium). Legg 0.42 g av natrium bikarbonat, 1.828 g natriumklorid, 0.127 g magnesiumklorid, 0.56 g av kalium klorid og 0.037 g veisalt til 250 mL destillert vann. Bland godt å oppløse. Butikken på 4 ° C.
- Angi kjøligere blokken på 4 ° C å opprettholde samples ved en konstant temperatur. Vent til temperaturen stabiliserer.
- Fortynne sperm eksemplene bruker den diluter løsning spesifikt for hver art.
Merk: Fortynning forholdet er bestemt og må defineres for å standardisere protokollen. Først beregne sæd konsentrasjon basert på konsentrasjonen innhentet i pre analyse av motilitet bruker programvare, som beskrevet i trinn 3 og 4. Med denne analysen er det også mulig å velge de beste sperm prøvene avhengig av motilitet. Etter dette kan forskeren begynne å samle inn data for eksperimentere med de beste prøvene med riktig konsentrasjonen.- Fortynne ål sperm prøver i P1 medium med forholdet 1:50. For å forberede 500 µL av ål utvannet sæd, Legg 50 µL av fersk sperm utvalget og 450 µL av P1. Bland godt.
3. vurdere parameterne Sperm motilitet
-
Oppsett modulen motilitet av programvaren
- Sette kjøligere scenen på 4 ° C og vent til det stabiliserer.
- Åpne programvaren og velg Motilitet modul. Opprett brukernavn og passord hvis nødvendig.
- Velg Egenskaper og velg ønsket parameterne før du starter sperm analysen.
- Klikk på arter | Fisk.
- Velg Rammer Per sekund og Nummeret til bilder, avhengig av de beste tekniske forutsetninger for hver art. Angi både på 120 bilder per sekund.
- Velg negativ kontrast. Det er obligatorisk for nøyaktig rekonstruksjon av spermatozoa baner16.
- Velg tilsvarende Telling kammer og omfanget av videokameraet. Kalibrere video kameraet for forstørrelse objektiv i eksperimentet. Angi SpermTrack10 som teller kammer og 10 X skala.
NOTE generelt en dybde på 10 µm i telling chamber og en forstørrelse-objektiv på 10 X er de anbefalte vilkårene siden de gir bedre fokusere alle spermatozoa og fange det høyeste antallet celler. Men anbefales det å foreta en tidligere studie av optimale forhold for motilitet analyse av hver art. - Juster Partikkel området og tilkobling for hver art. Angi minimum partikkel området på 2 µm2 og tilkobling på 7 µm.
Merk: For fisk, minimumsverdien for partikler området varierer mellom 2-5 µm og tilkobling avhenger spermatozoa hastigheten og bildefrekvens. - Lagre oppsett.
- Velg fange.
-
Analysere ål spermier med programvare
- Forberede aktivatoren løsning (kunstig sjøvann) ved å legge 0.946 g kommersielle salt til 25 mL destillert vann med 2% BSA.
- Ta 500 mL aktivatoren løsning (kunstig sjøvann) og plassere i kjøligere blokken.
Merk: Generelt, fisk sperm aktiveres osmotisk sjokk hendelse, men for enkelte arter av konsentrasjon kan også være viktig. For ferskvannsarter ha aktivator mediet hypotonisk osmolality, mens for marine arter medium bør være hypertonic. - Sette telling kammeret under kjøling scenen og vent til temperaturen stabiliserer til 4 ° C.
- Bland Aktivator og utvannet sædcellene å aktivere spermatozoa og starte motilitet video innspillingen mellom 5-10 s etter aktivering.
- Ta 4 µL aktivatoren løsning og sted i telling kammeret.
- Forsiktig homogenize utvannet sæd ved å riste microcentrifuge 3 ganger å unngå skader i spermatozoa celler.
- Ta 0,5 µL av utvannet sæd, bland med aktivatoren og sett dekselet i telling kammeret raskt.
Merk: Dette trinnet bør ikke ta mer enn 5 s starte analysen så snart som mulig. - Fokus på spermatozoa cellene og finne den beste visuelle området, som er definert av et lavt antall spermatozoa (150 til 200 celler) å unngå avskjæring mellom celler (supplerende figur 1A). Velg Fange Video å få spermatozoa sporene, som skilles etter hastighet.
- Velg ta å få 3-7 felt, som er det optimale intervallet for å få en lavere variasjon i resultatene, og fortsetter som før. Spille inn videoer til 120 s etter aktivisering for å unngå kondens på forsiden av telling chamber.
- Velg Avslutt å ha en oversikt over alle feltene.
4. få motilitet Data
- Velg felt | Delvis | Lagre og velg et filnavn. Klikk Lagre.
Merk: Regnearket gir mener verdier med ufullstendige data, diagrammer og bilder av spermatozoa spor. - Velg generelle Data | Filnavn | Lagre.
Merk: Angi dataene kinetic verdier for individuelle spermatozoa for alle felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse av tid effekt på Spermiemotilitet
I ål, prosentandelen av statisk spermatozoa økt fra 15 s til 120 s etter aktivering (fra 24,4% 40.7%) og andelen mobile progressiv spermatozoa redusert (fra 36,9% 20.9%) (Figur 1A og 1B). Basert på fart, spermatozoa celler viste en nedgang i hastighet over tid (figur 1 c og 1 D) redusert. Prosentandelen av spermatozoa med rask hastighet redusert ca 23% (fra 49.4% til 26,6%) og andelen spermatozoa med middels hastighet økt rundt 7%.
Effekten av rammen rate og telling kammer
Ulike arter krever forskjellige bildefrekvenser for optimale resultater. Russiske sturgeon krever 150 bilder per sekund (fps; Figur 2A); felles karpe krever 100 fps (figur 2B); og etter harr, 200 fps var ikke nok til å få optimal kinetic resultater (figur 2C). Disse resultatene var ikke avhengig av dybden på telling kammer testet (figur 2A2 C).
Sperm subpopulasjoner struktur
Identifikasjon av sperm subpopulasjon er basert på statistiske analyser. Det første trinnet er fastsettelse av rektor komponenter (viktigste komponenten analyse; PCA) fra den komplette settet av motilitet data. Deretter blir klynging prosedyrene utført med sæd-avledet indeksene innhentet etter PCA.
For denne studien vi brukte laks sperm som viste fire forskjellige subpopulasjoner, kalt: langsom lineære (lav LIN, STR og VCL), rask ikke-lineære (lavere STR, høy VCL), rask lineær (høy LIN, STR og VCL) og raskest lineære (høyeste LIN, STR og VCL). Fordelingen av disse subpopulasjoner variert langs generasjoner fra ville dyr å oppdrettet de (Figur 3).
Figur 1 : Effekt av tid etter aktivisering på progressivity og motilitet av ål sæd. A og B) prosentandel av progressivity på 15 og 120 s, henholdsvis; og C og D) andelen motilitet basert på fart over tid (15 og 120 s etter aktivisering, henholdsvis). Progressivity ble delt i tre grupper: progressiv motile celler (hvit; VCL mener verdi ± SD: 114.5 ± 18.2 og 101.4 ± 34,5 µm/s for 15 og 120 s, henholdsvis), ingen progressive motile celler (grå; VCL mener verdi ± SD: 84.8 ± 17,4 µm/s for 15 s og 84.6 ± 16,5 µm/s for 120 s), og statisk spermatozoa (svart). Spermatozoa hastigheten var fordelt på 4 grupper: rask (VCL mener verdi ± SD: 119.3 ± 13.7 µm/s for 15 s og 118.9 ± 13,3 µm/s for 120 s, hvit), medium (VCL mener verdi ± SD: 79.7 ± 15.5 µm/s for 15 s og 79.6 ± 15.5 µm/s for 120 s, lys grå) , langsom (VCL mener verdi ± SD: 32,9 ± 6.5 µm/s for 15 s og 32,6 ± 6.6 µm/s for 120 s, mørk grå) og statisk (svart). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Effekten av bildefrekvensen og telling kammeret i tre freshwater fiskeart: (A) russisk sturgeon (B) felles karpe og (C) harr. Sperm analyse ble gjort på 50, 100, 150 og 200 fps, bruker to kommersielle teller chambers med ulike dybder (10 og 20 µm). Den svarte sirkelen representerer beste bildefrekvensen for hver art. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Sperm subpopulasjoner strukturen i tre generasjoner av laks: wild menn (F0), og de første to generasjonene produsert i fangenskap (F1 og F2). Etter klynge analyse, fire subpopulasjoner ble observert: langsom lineære spermatozoa (lavt LIN, STR og VCL; sektorgruppe 1; svart), rask lineær spermatozoa (lavere STR, høy VCL, klynge 2, mørk grå), rask lineær spermatozoa (høy LIN, STR og VCL; klynge 3; middels grå) og raskest lineær spermatozoa (høyeste LIN, STR og VCL; klynge 4, lys grå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 1. Ulike visuelle områder fra motilitet analyse av ål sæd definert som (A) best og (B) verste celle konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sperm analyseprogramvare brukes i denne protokollen er brukt av forskere over hele verden for ulike arter, inkludert fisk. Men har fisk noen spesielle funksjoner som kan påvirke sperm vurdering. Fisk spermatozoa viste høy hastighet i øyeblikket aktivisering hvilke avtar raskt og fører til kort tid for motilitet etter aktivering. Dessuten temperaturen på reproduksjon er avhengig av arter, og i noen tilfeller kunne rundt 4 ° C2,4,8,12. Derfor er det nødvendig å gjøre noen tilpasninger å forbedre effektiviteten av en datastyrt system for fisk sperm analyse. Grunnprinsippet for parameteren motilitet er erverv og analyse av etterfølgende bilder motile spermatozoa. De fleste systemer bruker standard bildefrekvens (16, 25, 30, 50 eller 60 fps) på grunn av begrensninger av maskinvare og programvare17,18,19,20,21,22. Men noen studier viste at en høyere bildefrekvens øker noen hastighet parametere, for eksempel VCL, STR, milliarder Kubikkfot15,23,24. Dette er spesielt viktig når det er nødvendig å vurdere hyperactivation spermatozoa og finne den maksimale hastigheten spermatozoa11,17,18,19, 25. i forhold til temperaturen analyse, en kjøleplate for optisk mikroskopet og en ny teknologi for å kjøle samples ved konstant temperatur kan også forbedre analyse over tid. Dette arbeidet gir en tilnærming for å løse to av de største problemene knyttet til fisk sperm motilitet analyse og temperatur følsomhet. Til tross for resultatet fokuserer på noen ferskvannsarter kan denne metoden brukes for marine arter, selv om aktivisering medium bør være tilpasset hver art.
I markedet er det en rekke produkter eller med ulike versjoner av samme produkt. Selv om systemene har samme prinsipp har hver forskjellige detaljer som resulterer i inkompatibilitet resultater26,27,28. Dessuten kunne evalueringen av fisk kvaliteten fortsatt ha metodisk og teknisk begrensninger. Sperm aktivisering teknikken og tiden for analyse etter aktivering er to viktige faktorer som påvirker sperm kvalitet evaluering29,30. Tiden mellom aktivering av sæd prøver og stabilisering av bildet for videoopptak bør være rundt 5 s siden de første sekundene (tidsintervall 5-20 s) gir den mest nyttige data2,4. Tiden for sperm analyse kan være begrenset på grunn av kondens problemer på av objektglass. Men forbli fisk spermatozoa aktiv med en sterk bevegelse for mindre enn to minutter2. På et teknisk nivå er det nødvendig å vite "optimal" bildefrekvensen å få detaljert informasjon som gir en nøyaktig rekonstruksjon av spermatozoa baner15. På lavere bildefrekvens er detaljer om banen tapt, spesielt for rask og ikke-lineære spermatozoa, mens høyere bildefrekvens, informasjonen blir overflødige15,31. For enkelte fiskearter, bildefrekvens (opptil 250 fps) kan ikke være nok til å finne den maksimale hastigheten spermatozoa for enkelte fiskearter, som harr og laks. Denne varianten er bestemt og må defineres for hver art å standardisere protokollen og få pålitelige resultater15,23,24. Dybden av telling kammer kan begrense bevegelsen av den store flagell av fisk og spermatozoa kunne ikke nå topphastigheten11,32,33. Dessuten kan programvaren har noen begrensninger i deteksjon av ekte spermatozoa når det er en skjæringspunktet mellom celler.
Klassisk vurdering av kvaliteten er en subjektiv analyse basert på estimering av konsentrasjon og andelen motilitet, som kan produsere variasjon på resultatene. Men gir en datastyrt system rask, nøyaktig og kvantitativ måling av motilitet parametere. Denne objektiv analyse gir en stor mengde data og reduserer variasjon av resultater34,35,36,37. Responsen av sperm motilitet virkemåten avhenger temperaturen på analyse og varierer mellom arter38,39,40. Optimal temperatur av sæd analyse kan gi sæden hastighet og av motilitet ligner de naturgitte forholdene i reproduksjon38,40. Derfor forbedrer sperm analyseprogramvare med kjøleenheter evalueringen av fisk kvaliteten.
Resultatene av sperm kvalitet analyse kan forbedre kunnskap om fisk sædceller egenskaper og kvalitet basert på sæd subpopulasjoner, som kan være fremtiden for sperm evaluering i alle dyrearter41,42. På det praktiske nivået, denne teknikken kan være en indikator for høy kvalitet oppdrettere og bidrar til å få mer informasjon om sperm utvelgelsesprosessen, banebrytende doser beregning for kunstig befruktning, sperm konkurranse basert på hastighet og progressivity og fruktbarhet potensielle. All denne kunnskapen kan brukes til forskjellige forskningsfelt inkludert akvakultur og konserverings programmer, noe som stimulerte interessen fisk sperm lagring og kryonisk bevaring i siste tiår2,13. Toksikologiske effekter blir også spesiell interesse på grunn av miljøproblemer, samt studier utviklingen av phylogenetical studier basert på sæd motilitet egenskaper43,44.
Dette arbeidet har vist hvordan optimalisering av en automatisk programvare for fisk sperm motilitet analyse forbedrer resultatene. Standardisering av protokollen må ta hensyn temperaturen på analyse og bildefrekvens, som kan være forskjellig avhengig av arten. Analyse av fisk Spermiemotilitet har imidlertid to viktige trinn at hun skal betale oppmerksomhet. Sæd samling er første viktige skritt som kan ødelegge prøven på grunn av forurensing av avføring, urin og vann (sjøvann eller ferskvann). Det andre kritiske punktet er forbundet med øyeblikk av sæd aktivisering og begynnelsen av videoopptak. Dette trinnet bør gjøres så snart som mulig å samle inn data når spermatozoa har sterk bevegelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet har mottatt finansiering fra kostnaden Association (mat og landbruk pris handling FA1205: AQUAGAMETE og EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet under Marie Sklodowska-Curie prosjekt imponere (GA ingen 642893). Vi vil gjerne takke vitenskapelige team av PROiSER, spesielt for studenten Alberto Vendrell Bernabéu, hans aktiv deltakelse i videoinnspillingen av dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
- Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
- Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
- Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
- Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
- Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
- Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
- Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
- Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout - the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
- Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis? Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
- Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
- Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
- Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
- Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
- Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
- Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
- Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
- Holt, W. V., O'Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
- Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
- Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
- Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
- Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
- Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
- Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
- David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
- Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
- Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
- Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
- Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
- Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
- Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
- Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
- Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
- Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).
