Summary
O presente protocolo descreve um procedimento de avaliação do esperma de peixe usando análise de esperma assistida por computador e dispositivos de refrigeração. O software dá uma rápida, precisa e a análise quantitativa da qualidade do esperma de peixe com base na mobilidade do espermatozoide, que pode ser uma ferramenta útil na aquicultura para melhorar o sucesso da reprodução.
Abstract
Para avaliação da qualidade de gametas, existem técnicas inovadoras, rápidas e quantitativas que podem fornecer dados úteis para a aquicultura. Sistemas informatizados para a análise de esperma foram desenvolvidos para medir vários parâmetros e dentre as mais comumente medido é a mobilidade do esperma.
Inicialmente, esta tecnologia de computador foi projetada para espécies de mamíferos, embora ele também pode ser usado para análise do esperma de peixe. Os peixes têm características específicas que podem afetar o esperma avaliação tais como um tempo curto de motilidade após a ativação e, em alguns casos, adaptação às temperaturas mais. Assim, é necessário modificar os componentes de software e hardware para fazer análise da motilidade mais eficiente para análise do esperma de peixe. Para espermatozoides de mamíferos, a placa de aquecimento é usada para manter a temperatura ideal de espermatozoides. No entanto, para algumas espécies de peixes, é vantajoso usar uma temperatura mais baixa para prolongar a duração da motilidade, uma vez que os espermatozoides permanecem ativos por menos de 2 min. Portanto, dispositivos de resfriamento são necessários para refrigerar amostras a temperatura constante ao longo do tempo de análise, incluindo no microscópio óptico. Este protocolo descreve a análise da mobilidade do esperma de peixe utilizando software para análise de esperma e resfriamento novos dispositivos para otimizar os resultados.
Introduction
A eficácia de reprodução depende da qualidade de ambos os gâmetas (óvulos e espermatozoides)1,2. Este é o principal fator que contribui para uma fecundação bem sucedida, permitindo o desenvolvimento da prole viável3,4. Conveniente avaliação da qualidade do material genético é a melhor ferramenta para definir o potencial de fertilidade de um espécime.
Mistura de esperma de vários machos é uma prática comum na produção de muitas espécies aquáticas comercial4. No entanto, a variabilidade de esperma entre machos pode levar à competição de esperma e, consequentemente, não todos os homens igualmente estão contribuindo para o pool de gene5. Neste sentido, a avaliação correta das características de ejaculação/espermatozoides individuais, tais como motilidade, é fundamental para obterem informações discriminatórias sobre potenciais individuais a fertilidade masculina. Observação directa da motilidade espermática pode produzir dados imprecisos e subjetivos como requer tempo e experiência, o que leva a uma falta de consistência e incompatibilidade dos resultados6,7. No entanto, existem muitas técnicas inovadoras, rápidas e quantitativas que podem fornecer um esperma confiável qualidade análise2,4.
Análise de esperma assistida por computador foi desenvolvido para oferecer dados precisos sobre o esperma de qualidade8. Esta tecnologia inclui o desenvolvimento de software associado com um microscópio de contraste de fase que permite a avaliação da motilidade espermática. No entanto, um fator limitante de parâmetro de motilidade é a taxa de quadros da câmara. Espermatozoides individuais trajetórias baseiam-se em espermatozoides cabeça posição de centroide em quadros consecutivos de gravações em vídeo, que está correlacionada com o movimento flagelar padrões3,9,10, 11. os principais parâmetros cinéticos medidos são a velocidade linear (VSI), velocidade curvilínea (VCL) e caminho de média velocidade (VAP). VSI é a distância entre o início e o ponto de extremidade tomadas por espermatozoides divididos pelo tempo. VCL é a velocidade real ao longo da trajetória precisa tomada por espermatozoides. VAP é a velocidade ao longo de um caminho suavizado derivada da trajetória. Estes parâmetros permitem que informações adicionais de cinéticas, incluindo linearidade (LIN), linearidade (STR), wobble (WOB) e medições de espancamento como amplitude de movimento lateral da cabeça (ALH) e frequência de batida-Cruz (BCF)4,10.
O sistema de análise de esperma foi originalmente utilizado para espécies de mamíferos, e um dos requisitos para o sistema está a funcionar a temperatura do corpo do doador (cerca de 37 ° C). Este software também pode ser utilizado para espécies de peixes; embora, seja necessário fazer algumas adaptações para reduzir o erro dos resultados de análise do esperma. Em algumas espécies de peixes, tais como os salmonídeos e enguia8,12, a fecundação ocorre em baixa temperatura (em torno de 4 ° C),2,4. Assim, dispositivos de arrefecimento deve ser desenvolvida para evitar condições de trabalho desconfortáveis. Além disso, peixes espermatozoides são fixa no fluido seminal e requerem um choque osmótica para ativar a motilidade. Para espécies de água doce, o meio de ativador terem osmolalidade hipotônica, enquanto para espécies marinhas a mídia deve ser hipertônica. No entanto, para algumas espécies, como os salmonídeos, a concentração do íon também poderia ser importante3,4,9. Após a ativação, esperma de peixe é caracterizada por uma rápida diminuição da motilidade (menos de 2 min)13,14 e alta velocidade, sendo vital para determinar a taxa de quadro ideal para obter dados fiáveis15.
Os objetivos deste estudo são projetar e aplicar sistemas de refrigeração para as amostras de esperma de peixe. Além disso, esse protocolo define como determinar as taxas de quadro ideal para o estabelecimento de protocolos padrão, dependendo da espécie. O uso deste protocolo abre novas portas no contexto da avaliação seminal de peixe, usando a enguia europeia como modelo.
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Protocol
Procedimentos envolvendo assuntos animais tem sido aprovaram (2015/VSC/ervilha/00064) pela direção geral da produção agrícola e pecuária na Universitat Politécnica de València.
1. recolher o esperma maduro enguias europeias em cativeiro
Nota: Uso enguia europeia os machos mantidos em tanques com água do mar e um sistema de recirculação a uma temperatura constante (20 ° C). Tratar com hormônios através de injeção intraperitoneal semanal (gonadotrofina coriônica humana (hCG); 1,5 UI por g de peso corporal de peixes). Aclimatar gradualmente começando com 3 dias na água doce de peixe seguido de substituição com água do mar (1/3 da água total no tanque) cada 2 dias até atingir uma salinidade de 37,0 g/mL.
- Anestesia a enguia 24h após a injeção de hormônio para obter amostras com melhor qualidade do esperma.
- Preparar a anestesia de antemão: Adicionar 300 mg de benzocaína para 100 mL de etanol a 70%. Misture bem e armazenar a 4 ° C.
- Dilua a benzocaína num balde flexível com 5 L de água do sistema para obter uma concentração final de 60 mg/L e misture corretamente.
- Transfira o peixe para o balde com água do sistema e benzocaína. Aguarde alguns minutos até que o peixe se acalme.
- Limpar a área genital com água e seque com papel absorvente para evitar a contaminação das amostras de esperma por fezes, urina ou água do mar.
- Aplique uma pressão suave na área abdominal e coletar as amostras de esperma em tubos de plástico de 15 mL usando a bomba de vácuo. Volume de esperma até 6-7 mL, dependendo do sexo masculino.
- Manter amostras de esperma a 4 ° C, durante pelo menos 1 h até análise de motilidade é realizado.
2. leve à geladeira e diluir as amostras de esperma
- Prepare a solução diluidor de antemão.
Nota: As amostras de esperma devem ser diluídas na solução extensor específica para cada espécie.- Prepare o suporte não-ativador para amostras de esperma de enguia (P1 médio). Adicione 0,42 g de bicarbonato de sódio, 1,828 g de cloreto de sódio, 0,127 g de cloreto de magnésio, 0,56 g de cloreto de potássio e 0,037 g de cloreto de cálcio para 250 mL de água destilada. Misture bem para dissolver. Loja a 4 ° C.
- Defina o bloco refrigerador a 4 ° C, para manter as amostras à temperatura constante. Espere até que a temperatura se estabilize.
- Dilua as amostras de esperma usando a diluidor solução específica para cada espécie.
Nota: A razão de diluição é espécie específico e deve ser definida para padronizar o protocolo. Primeiro, estimar a concentração de espermatozoides, com base na concentração obtida na pré-análise da motilidade usando software, conforme explicado nas etapas 3 e 4. Com esta análise, também é possível selecionar as melhores amostras de esperma com base na porcentagem de motilidade. Depois disto, o pesquisador pode começar a coletar dados para o experimento usando as melhores amostras com a concentração correta.- Dilua as amostras de esperma de enguia no meio de P1, com uma proporção de 01:50. Para preparar 500 µ l de esperma de enguia diluída, adicione 50 µ l de amostra de esperma fresco e 450 µ l de P1. Misture bem.
3. avaliar os parâmetros de motilidade do esperma
-
Instalação do módulo de motilidade do Software
- Definir o cenário refrigerador a 4 ° C e esperar até que estabiliza.
- Abra o software e selecione o Módulo de motilidade. Crie nome de usuário e senha, se necessário.
- Selecione Propriedades e escolha os parâmetros desejados antes de iniciar a análise do esperma.
- Clique sobre as espécies de | Peixe.
- Selecione os Quadros por segundo e o Número de imagens, dependendo das condições técnicas melhores para cada espécie. Defina as duas opções em 120 imagens por segundo.
- Escolha o contraste negativo. É obrigatório para reconstrução precisa dos espermatozoides trajetórias16.
- Selecione o correspondente Câmara de contagem e a escala da câmara. Calibre a câmera de vídeo para a lente de ampliação utilizada no experimento. Defina SpermTrack10 como câmara de contagem e escala de X 10.
Nota: em geral, uma profundidade de 10 µm em câmara de contagem e uma lente de ampliação de 10x são condições recomendadas desde que eles fornecem a melhor focagem de todos os espermatozoides e capturar o maior número de células. No entanto, é aconselhável fazer um estudo prévio das condições ideais para a análise da mobilidade de cada espécie. - Ajuste a Área de partícula e conectividade para cada espécie. Definir área de partícula mínimo 2 µm2 e conectividade em 7 µm.
Nota: Para o peixe, o valor mínimo de intervalos de área de partículas entre 2-5 µm e conectividade depende a velocidade de espermatozoides e a taxa de quadros. - Salve a configuração.
- Selecione capturar.
-
Analisar a enguia europeia esperma com Software
- Prepare a solução de ativador (água do mar artificial) adicionando 0,946 g de sal comercial para 25 mL de água destilada com 2% de BSA.
- Tomar 500 mL de solução ativador (água do mar artificial) e coloque no refrigerador bloco.
Nota: em geral, esperma de peixe é ativada por um evento de choque osmotic, embora para algumas espécies a concentração do íon também pode ser importante. Para espécies de água doce, o meio de ativador terem osmolalidade hipotônica, enquanto para espécies marinhas a mídia deve ser hipertônica. - Coloque a câmara de contagem sob a fase de arrefecimento e espere até a temperatura estabilizar a 4 ° C.
- Misture o ativador e esperma diluídas para ativar os espermatozoides e começar o motilidade de gravação de vídeo entre 5-10 s após a ativação.
- Tome 4 µ l de solução ativador e lugar na câmara de contagem.
- Homogeneizar delicadamente o esperma diluído agitando a microcentrifuga 3 vezes para evitar danos nas células de espermatozoides.
- Tomar 0,5 µ l de esperma diluídas, misture com o ativador e coloque a tampa na câmara contando rapidamente.
Nota: Este passo não deve tomar mais de 5 s para iniciar a análise logo que possível. - Centrar-se sobre as células de espermatozoides e encontrar a melhor área visual, que é definida por um baixo número de espermatozoides (150 a 200 células) para evitar a intercepção entre células (Supplemental figura 1A). Selecione Capturar vídeo para obter as faixas de espermatozoides, que são separadas de acordo com a velocidade.
- Selecione capturar para obter campos 3 a 7, que são o intervalo ideal para obter uma baixa variabilidade nos resultados e proceder como anteriormente. Gravar vídeos até 120 s pós da ativação para evitar condensação na tampa da câmara de contagem.
- Selecione a saída para ter uma visão geral de todos os campos.
4. obter dados de motilidade
- Selecione os campos de | Parcial | Salve e escolher um nome de arquivo. Clique em salvar.
Nota: A planilha fornece valores médios de dados parciais, gráficos e imagens de faixas de espermatozoides. - Selecione dados gerais | Nome do arquivo | Salvar.
Nota: Os dados fornecem valores cinéticas para espermatozoides individuais de todos os campos.
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Representative Results
Análise do efeito do tempo na mobilidade do esperma
No caso da enguia europeia, a percentagem de espermatozoides estáticos aumentou de 15 s para 120 s após sua ativação (de 24,4% para 40,7%) e a porcentagem de espermatozoides móveis de progressivas diminuição (de 36,9% para 20,9%) (Figura 1A e 1B). Com base na velocidade, células de espermatozoides mostraram uma diminuição de velocidade ao longo do tempo (Figura 1 e 1 D) diminuída. A porcentagem de espermatozoides com velocidade rápida diminuiu cerca de 23% (de 49,4% para 26,6%) e a porcentagem de espermatozoides com velocidade média aumentou cerca de 7%.
O efeito da taxa de quadros e câmara de contagem
Espécies diferentes exigem diferentes taxas de quadro para obter melhores resultados. Esturjão russo requer 150 quadros por segundo (fps; Figura 2A); carpa comum requer 100 fps (Figura 2B); e para a grayling, 200 fps não foi suficiente para obter óptimos resultados cinéticos (Figura 2). Esses resultados não eram dependentes da profundidade da contagem câmara testado (Fig. 2A-2 C).
Estrutura de subpopulações de esperma
A identificação da subpopulação de esperma é baseada na análise estatística. O primeiro passo é a determinação dos principais componentes (análise de componentes principais; PCA) do conjunto completo de dados de motilidade. Em seguida, os clusters procedimentos são realizados com os índices de esperma-derivados obtidos após o PCA.
Para este estudo, foi utilizado esperma de salmão do Atlântico, que mostrou quatro subpopulações diferentes, chamadas: lento não-linear (baixa LIN, STR e VCL), rápida, não-linear (baixa STR, VCL alta), rápido linear (alta LIN, STR e VCL) e mais rápido linear (LIN mais alta, STR e VCL). A distribuição destas subpopulações variadas ao longo de gerações de animais selvagens para viveiro ones (Figura 3).
Figura 1 : Efeito do pós-ativação tempo sobre a progressividade e a motilidade do esperma de enguia europeia. A e B) percentagem de progressividade no s 15 e 120, respectivamente; e, C e D) a porcentagem de motilidade com base na velocidade ao longo do tempo (15 e 120 s após a ativação, respectivamente). A progressividade foi dividida em três grupos: pilhas motile progressivas (branco; VCL significa valor ± SD: 114.5 ± 18,2 e 101.4 ± 34,5 µm/s para 15 e 120 s, respectivamente), não há células motile progressivas (cinza; VCL significa valor ± SD: 84,8 ± 17,4 µm/s para 15 s e 84.6 ± 16,5 µm/s para 120 s) e espermatozoides estáticos (preto). A velocidade de espermatozoides foi dividida em 4 grupos: rápida (VCL significa valor ± SD: 119,3 ± 13,7 µm/s para 15 s e 118.9 ± 13,3 µm/s para 120 s; branco), médio (VCL significa valor ± SD: 79,7 ± 15,5 µm/s para 15 s e 79,6 ± 15,5 µm/s para 120 s; cinza claro) , lento (VCL significa valor ± SD: 32,9 ± 6,5 µm/s para 15 s e 32,6 ± 6.6 µm/s para 120 s; cinza escuro) e estática (preto). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : O efeito da taxa de quadro e a câmara de contagem em três espécies de peixes de água doce: (A) russo esturjão (B) carpa e (C) Grayling. Análise do esperma foi feita em 50, 100, 150 e 200 fps, usando dois comerciais contando câmaras com diferentes profundidades (10 e 20 µm). O círculo preto representa a melhor taxa de quadros para cada espécie. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Estrutura de subpopulações de esperma de três gerações de salmão do Atlântico: machos selvagens (F0) e as duas primeiras gerações produzidas em cativeiro (F1 e F2). Após a análise de cluster, observaram-se quatro subpopulações: lento espermatozoides não lineares (baixa LIN, STR e VCL; cluster 1; preto), rápido espermatozoides não lineares (STR baixa, alta VCL cluster 2; cinza escuro), rápida espermatozoides lineares (LIN alta, STR e VCL; cluster 3; intermediário de cinza) e mais rápidos lineares espermatozoides (LIN, STR e VCL; maior cluster 4; cinza claro). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 1. Diferentes áreas visuais a partir da análise da motilidade do esperma de enguia europeia definida como melhor (A) e (B) pior célula concentração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O software de análise de esperma utilizado neste protocolo tem sido usado por pesquisadores em todo o mundo para diferentes espécies, incluindo peixe. No entanto, os peixes têm algumas características específicas que podem afetar a avaliação do esperma. Espermatozoides de peixes mostrou alta velocidade no momento da ativação que declina rapidamente e leva a um curto período de tempo de motilidade após a ativação. Além disso, a temperatura de reprodução é dependente da espécie e, em alguns casos, pode ser em torno de 4 ° C2,4,8,12. Assim, é necessário fazer algumas adaptações para melhorar a eficiência de um sistema informatizado para análise de esperma de peixe. O princípio básico do parâmetro motilidade é a aquisição e análise de imagens sucessivas de espermatozoides móveis. A maioria dos sistemas usa taxas de quadro padrão (16, 25, 30, 50 ou 60 fps) devido a limitações de hardware e software17,18,19,20,21,22. No entanto, alguns estudos mostraram que uma maior taxa de quadros aumenta alguns parâmetros de velocidade, como VCL, STR, BCF15,23,24. Isto é particularmente importante quando é necessário avaliar a hyperactivation de espermatozoides e encontrar a velocidade máxima de espermatozoides11,17,18,19, 25. em relação a temperatura de análise, uma placa de resfriamento para o microscópio óptico e uma nova tecnologia para refrigerar amostras a temperatura constante pode também melhorar a análise ao longo do tempo. O presente trabalho apresenta uma abordagem para resolver dois dos principais problemas associados com o peixe esperma motilidade temperatura e análise de sensibilidade. Apesar dos resultados com foco em algumas espécies de água doce, esta metodologia pode ser usada para espécies marinhas, embora o meio de ativação deve ser adaptado para cada espécie.
No mercado, há uma gama de produtos ou até mesmo diferentes versões do mesmo produto. Mesmo que os sistemas podem ter o mesmo princípio, cada um tem detalhes diferentes, resultando na incompatibilidade dos resultados26,,27,28. Além disso, a avaliação da qualidade do esperma de peixe poderia ainda ter limitações metodológicas e técnicas. A técnica de ativação de esperma e o tempo de análise após a ativação são dois factores essenciais que afetam a qualidade de esperma a avaliação29,30. O tempo entre a ativação de amostras de esperma e a estabilização de imagem para gravações de vídeo deve ser em torno de 5 s desde os primeiros segundos (intervalo de tempo de 5 a 20 s) fornece o mais útil de2,de dados4. O tempo de análise de esperma pode ser limitado devido a problemas de condensação sobre a lâmina de vidro. No entanto, peixe espermatozoides permanecem ativos com um vigoroso movimento por menos de dois minutos2. A nível técnico, é necessário conhecer a taxa de quadros "ideal" para obter informações detalhadas que dá uma reconstrução precisa dos espermatozoides trajetórias15. Em taxas de quadros mais baixas, os detalhes da trajetória são perdidos, particularmente para espermatozoides rápidos e não-lineares, Considerando que a taxas mais elevadas de quadro, a informação torna-se redundante15,31. Para algumas espécies de peixes, o frame rate (até 250 fps) pode não ser suficiente para encontrar a velocidade máxima de espermatozoides para algumas espécies de peixes, como salmão e Grayling. Esta variação é espécie específico e deve ser definida para cada espécie de padronizar o protocolo e obter resultados fiáveis15,23,24. A profundidade da câmara de contagem pode limitar o movimento do grande flagelo do peixe e os espermatozoides não conseguia alcançar a velocidade máxima de11,32,33. Além disso, o software pode ter algumas limitações na detecção de espermatozoides reais quando há um cruzamento de células.
Avaliação clássica da qualidade do esperma é uma análise subjetiva com base na estimativa da concentração e a porcentagem de motilidade, que pode produzir variabilidade nos resultados. No entanto, um sistema informatizado fornece medições rápidas, precisas e quantitativas dos parâmetros de motilidade. Esta análise objetiva dá uma grande quantidade de dados e reduz a variabilidade dos resultados34,35,36,37. A resposta do comportamento de motilidade do esperma depende da temperatura da análise e varia entre espécies38,39,40. Temperatura ideal da análise de esperma pode fornecer velocidade de esperma e a duração do período de motilidade semelhante das condições naturais de reprodução38,40. Portanto, o software de análise de esperma com dispositivos de resfriamento melhora a avaliação da qualidade do esperma de peixe.
Os resultados da análise de qualidade de esperma poderiam melhorar o conhecimento sobre as características de esperma de peixes e qualidade baseada em subpopulações de esperma, que pode ser o futuro da avaliação de esperma em todas as espécies animais41,42. A nível prático, esta técnica pode ser um indicador de reprodutores de alta qualidade e ajuda para obter mais informações sobre o esperma, processo de seleção, cálculo de doses seminais para inseminação artificial, competição de esperma com base na velocidade e progressividade e potencial de fertilidade. Todo esse conhecimento pode ser aplicado a campos de investigação diferentes, incluindo programas de aquicultura e conservação, o que estimulou o interesse no armazenamento de esperma do peixe e criopreservação na última décadas2,13. Efeitos toxicológicos também estão ficando especial interesse devido a problemas ambientais, bem como estudos o desenvolvimento de estudos phylogenetical baseado no esperma motilidade características43,44.
Este trabalho tem mostrado como a otimização de um software automático para análise de mobilidade de esperma de peixe melhora os resultados. Padronização do protocolo deve ter em conta a temperatura de análise e a taxa de quadros, que pode ser diferente dependendo da espécie. No entanto, a análise da mobilidade do esperma de peixe tem duas etapas críticas que o pesquisador deve prestar atenção. Coleta de esperma é o primeiro passo crítico que pode destruir a amostra devido a contaminações por fezes, urina e água (água do mar ou de água doce). O outro ponto crítico é associado com o momento da ativação de esperma e o início de gravações em vídeo. Esta etapa deve ser feita logo que possível para coletar dados, quando o espermatozoide tem movimento vigoroso.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este projeto recebeu financiamento da Associação de custo (alimentação e agricultura custo ação FA1205: AQUAGAMETE e Horizonte 2020 inovação programa de investigação e da União Europeia sob o Marie Sklodowska-Curie projeto IMPRESS (GA n 642893). Gostaríamos de agradecer a equipe científica de PROiSER, especificamente para o aluno Alberto Vendrell Bernabéu, por sua participação ativa na gravação do video deste projecto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
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