Summary
Mevcut iletişim kuralını kullanarak bilgisayar destekli sperm analizi ve soğutma aygıtlarının balık sperm değerlendirmesi bir yordam açıklanır. Yazılım bir hızlı, doğru ve kantitatif analiz yetiştiricilik üreme başarı geliştirmek için yararlı bir araç olabilir sperm hareketliliği göre balık sperm kalitesi verir.
Abstract
Gamet kalite değerlendirme için su ürünleri yetiştiriciliği için yararlı veri sağlayabilir yenilikçi, hızlı ve kantitatif teknikler vardır. Bilgisayarlı sistemler sperm analizi için çeşitli parametreleri ölçmek için geliştirilmiş ve en yaygın olarak ölçülen sperm motilitesi biridir.
Başlangıçta, her ne kadar da balık sperm analizi için kullanılabilir Bu bilgisayar teknolojisi memeli türleri için tasarlanmıştır. Balık sperm değerlendirmesi kısa hareketliliği süresi gibi aktivasyon sonra ve bazı durumlarda düşük sıcaklığı adaptasyon etkileyen belirli özellikleri var. Böylece, motilite analiz balık sperm analizi için daha verimli hale getirmek için yazılım ve donanım bileşenleri değiştirmek gereklidir. Memeli sperm için ısıtma yüzeyi sperm optimum sıcaklık tutmak için kullanılır. Ancak, bazı balık türleri için sperm az 2 dk için etkin kaldığı hareketliliği, süresini uzatmak için daha düşük bir sıcaklığa kullanmak avantajlıdır. Bu nedenle, soğutma cihazları, analiz üzerinde optik mikroskop dahil olmak üzere, zaman içinde sabit sıcaklıkta örnekleri soğutmak gereklidir. Bu iletişim kuralı için sperm analizi yazılımı kullanarak ve yeni soğutma aygıtlarının sonuçları optimize balık sperm motilitesi analizini açıklar.
Introduction
Üreme etkinliğinin her iki gamet (yumurta ve sperm)1,2kalitesine bağlı. Bu uygun yavrular3,4gelişimi sağlayan başarılı gübreleme için katkıda bulunan önemli bir faktördür. Gamet kalite uygun değerlendirilmesi bir numune doğurganlık potansiyelini tanımlamak için en iyi araçtır.
Birden fazla erkek sperm karıştırma birçok su ticari tür4üretiminde yaygın bir uygulamadır. Ancak, erkekler arasında sperm değişkenlik sperm rekabete neden olabilir ve sonuç olarak, tüm erkekler eşit gen havuzunun5' e katkıda bulunuyorlar. Bu anlamda, hareketliliği gibi bireysel boşalmak/sperm özellikleri doğru değerlendirilmesi ile ilgili bireysel erkek üreme potansiyel ayrımcı bilgi elde etmek için esastır. Zaman ve tutarlılık eksikliği ve sonuçları6,7uyumsuzluk yol açar tecrübe gerektirdiği sperm motilitesi doğrudan gözlem ve öznel yanlış veri oluşturabilir. Ancak, güvenilir sperm kalitesi analizi2,4sağlayabilir birçok yenilikçi, hızlı ve kantitatif teknikler vardır.
Bilgisayar destekli sperm analizi sperm kalitesi8hakkında doğru veri sunmak için geliştirilmiştir. Bu teknoloji sperm hareketliliğini değerlendirmesini sağlar bir faz kontrast mikroskobu ile ilişkili yazılım geliştirme içerir. Ancak, kısıtlayıcı bir faktör hareketliliği parametre video kamera çerçeve oranıdır. Bireysel sperm yörüngeleri olan bağlı olarak sperm hücreleri üzerinde kafa kamçılı hareketi kalıpları3,9,10ile, ilişkili centroid pozisyon üst üste kare video kayıtları, 11. doğrusal hız (VSI), eğrisel hız (VCL) ve ortalama yol hız (VİP) ölçülen ana kinetik parametreleri vardır. VSL son nokta zaman bölünmüş sperm hücreleri tarafından alınan ve başlangıç arasındaki mesafedir. VCL sperm hücreleri tarafından alınan kesin yörünge boyunca gerçek hızı olduğunu. VAP yörünge türetilmiş bir düzleştirilmiş yol boyunca hızı olduğunu. Bu parametreler doğrusallık (LIN), doğruluk (STR), sallantı (WOB) ve yan kafa hareketi (SKİP'in) ve beat-cross frekans (BCF)4,10genlik gibi dayak ölçümleri de dahil olmak üzere ek kinetik bilgi sağlar.
Sperm analizi sistemi memeli türler için kullanılan özgün ve sistem gereksinimlerini donör (yaklaşık 37 ° C) vücut sıcaklığında çalışmasına biridir. Bu yazılım aynı zamanda balık türleri için kullanılabilir; Her ne kadar sperm analizi sonuçları hata azaltmak için bazı uyarlamalar yapmak gereklidir. Salmonids ve yılan balığı8,12, gibi bazı balık türlerinin fertilizasyon düşük sıcaklık (yaklaşık 4 ° C'de)2,4' te oluşur. Böylece, rahatsız çalışma koşulları önlemek için soğutma aygıtlarının geliştirilmelidir. Ayrıca, balık spermlerin meni içinde immotile ve motilite etkinleştirmek için bir ozmotik şok gerektirir. Deniz canlıları için orta hipertonik gerekirken tatlı türler için harekete geçirmek orta hipotonik osmolalite, olmalıdır. Ancak, bazı türler için salmonids iyonu konsantrasyonu da önemli3,4,9olabilir. Aktivasyon sonra balık sperm hareketliliği (az 2 dk)13,14 ve15güvenilir veri elde etmek için en iyi kare hızı belirlemek için hayati olan yüksek hız hızlı bir azalma ile karakterizedir.
Bu çalışma, tasarım ve soğutma sistemleri balık sperm örnekleri için geçerli hedeflerdir. Ayrıca, bu protokol bağlı olarak bu tür standart protokolleri kurulması için en uygun kare hızları belirleme tanımlar. Bu Protokolü'nün kullanılmasına Avrupa yılan balığı bir model olarak kullanarak balık seminal değerlendirme bağlamında yeni kapılar açılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yordamlar içeren hayvan konuyu olmuştur (2015/VSC/bezelye/00064) tarımsal üretim ve Hayvancılık Universitat Politècnica de València de genel yönünü tarafından onaylanmış.
1. Sperm Olgun Avrupa yılan balığı esaret altında toplamak
Not: kullanım Avrupa yılan balığı erkek tankları deniz suyu ve sabit sıcaklıkta (20 ° C) bir devridaim sistemi ile yapılmaktadır. Haftalık mayi enjeksiyonuyla (insan korionik gonadotropin (hCG); balık vücut ağırlığı g başına 1,5 IU) hormonları ile tedavi. Deniz suyu ile replasmanı ardından 3 gün yavaş yavaş başlayan tatlı su balık parkenizin (1/3 toplam su tankında) 2 günde bir tuzluluk 37,0 g/ml ulaşan kadar.
- Yılan balığı 24 h hormonu enjeksiyon örnekleri ile daha iyi sperm kalitesini elde etmek için sonra anestezi.
- Anestezi önceden hazırlamak: benzokain 300 mg 100 mL % 70 etanol için ekleyin. Mix iyi ve 4 ° C'de depolayın
- Benzokain 60 mg/L son bir konsantrasyon ve mix düzgün sistem su 5 L ile esnek bir kovada sulandırmak.
- Balık kova sistemi su ve benzokain ile aktarın. Balık sakinleşene kadar birkaç dakika bekleyin.
- Genital bölge su ile temizleyin ve dışkı, idrar veya deniz suyu sperm örneklerinin kirlenmesini önlemek için emici kağıt ile kuru.
- Karın bölgesinde hafif basınç uygulayın ve vakum pompası ile 15 mL Plastik tüpler içine sperm örnekleri toplamak. Sperm hacmi en fazla 6-7 mL, Erkek bağlı olarak.
- Motilite analizi yapılır kadar en az 1 h için 4 ° C'de sperm örnekleri sakla.
2. soğutmak ve Sperm örnekleri sulandırmak
- Diluter çözüm önceden hazırlayın.
Not: Sperm örnekleri her tür için belirli extender çözümde seyreltilmiş.- Harekete geçirmek orta yılan balığı sperm örnekleri (P1 orta) için hazır olun. 0,42 g sodyum bikarbonat, sodyum klorür, magnezyum klorür, potasyum klorür ve 250 ml distile su kalsiyum klorür 0,037 g 0,56 g 0,127 g 1.828 g ekleyin. Mix de çözülmeye. 4 ° C'de mağaza
- Soğutucu blok 4 ° C'de sabit bir ısıda örnekleri korumak için ayarlayın. Sıcaklık stabilize kadar bekleyin.
- Her tür için diluter çözüm özel kullanarak sperm örnekleri sulandırmak.
Not: Seyreltme oranı belirli türler ve protokol standartlaştırmak için tanımlanmalıdır. İlk olarak, sperm konsantrasyonu 3 ve 4 numaralı adımlarda açıklandığı gibi yazılım kullanarak hareketliliği ön analizinde elde edilen konsantrasyon dayalı tahmin ediyoruz. Bu analiz ile hareketliliği yüzdeye dayalı en iyi sperm örnekleri seçmek mümkündür. Bundan sonra en iyi örnekleri doğru konsantrasyon ile kullanarak deney verileri toplamak araştırmacı başlayabilirsiniz.- Yılan balığı sperm örnekleri 1:50 oranında P1 ortamda sulandırmak. Yılan balığı seyreltilmiş sperm 500 µL hazırlamak için taze sperm örneği 50 µL ve P1 450 µL ekleyin. İyice karıştırın.
3. Sperm hareketliliği parametreleri değerlendirmek
-
Set-up hareketliliği modül yazılım
- Soğutucu 4 ° C'de hazırladı ve bu stabilize kadar bekleyin.
- Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı açın ve Motilite modülüseçin. Kullanıcı adı ve parola gerekiyorsa oluşturun.
- Özellikler ' i seçin ve sperm analizi başlamadan önce istediğiniz parametreleri seçin.
- ' I tıklatın türler üzerinde | Balık.
- Saniyede çerçeveler ve Görüntüleri numarası, her tür için en iyi teknik şartlarına bağlı olarak seçin. Saniyede 120 kare, her iki seçenek ayarlayın.
- Negatif kontrast seçin. Sperm hücreleri yörüngeleri16doğru yeniden inşası için zorunludur.
- Karşılık gelen Sayım odası ve video kamera Ölçek seçin. Denemede kullanılan büyütme objektif için video kamera kalibre. Sayım odası olarak SpermTrack10 ve 10 X ölçeği ayarlayın.
Not: genel olarak, sayım odasında 10 µm derinliğe ve 10 X büyütme objektif tarafından önerilen koşullar onlar daha iyi tüm sperm elde odaklanan sağlamak ve en yüksek hücre sayısı yakalama beri. Ancak, bu hareketliliği analiz için optimal koşullar her türün önceki bir çalışma yapmak için tavsiye edilir. - Parçacık alanı ve bağlantı her tür için ayarlayın. En küçük parçacık alan 2 µm2 ve 7 µm, bağlantı ayarlayın.
Not: balık için parçacıklar alan aralıkları 2-5 µm ve bağlantı arasında en küçük değerini sperm elde hız ve kare hızı bağlıdır. - Set-up kaydedin.
- Yakalamaseçin.
-
Avrupa yılan balığı Sperm yazılım ile analiz
- İçin bir çözüm aktivatör (yapay deniz suyu) 25 mL distile su ile % 2 BSA 0.946 g ticari tuz ekleyerek hazırlayın.
- 500 mL aktivatör çözeltisi (yapay deniz suyu) alın ve soğutucu blok içinde yerleştirin.
Not: bazı türlerin iyonu konsantrasyonu da önemli olabilir, ancak genel olarak, balık sperm bir ozmotik şok olay tarafından devreye girer. Deniz canlıları için orta hipertonik gerekirken tatlı türler için harekete geçirmek orta hipotonik osmolalite, olmalıdır. - Sayım odası soğutma sahne altında koymak ve sıcaklık stabilize 4 ° C'ye kadar bekleyin
- Harekete geçirmek ve sperm hücreleri etkinleştirmek ve harekete geçirmek sonra 5-10 s arasında kayıt hareketliliği videoyu başlatmak için seyreltilmiş sperm karıştırın.
- Bir çözüm aktivatör ve yer 4 µL sayım odasına götür.
- Hafifçe sulandırılmış sperm sperm hücreleri zarar görmemesi için 3 kez microcentrifuge sallayarak lunaparkçı.
- 0.5 µL seyreltilmiş sperm almak, harekete geçirmek ile karıştırın ve hızlı sayım odasında kapak koymak.
Not: Bu adım 5'ten fazla almamalıdır s analiz en kısa zamanda başlamak için. - Sperm hücreleri üzerinde odaklanmak ve az sayıda sperm hücreleri (Tamamlayıcı şekil 1A) arasındaki durdurma önlemek için hücreleri (150 ila 200 hücreleri) tarafından tanımlanan en iyi görsel alan bulun. Video yakalama hızı göre ayrılır sperm hücreleri parça elde etmek için seçin.
- Sonuçları daha düşük bir değişkenlik elde etmek ve daha önce olduğu gibi devam etmek için en iyi aralığı vardır 3-7 alanları elde etmek için yakalama seçin. Sayım odasının kapak yoğunlaşma önlemek için 120 s etkinleştirme sonrası kadar kayıt videoları.
- Tüm alanların genel bir görüntülemek için Çıkış ' ı seçin.
4. hareketliliği verileri elde etmek
- Alanları seçin | Kısmi | Kaydet ve bir dosya adı seçin. Kaydet' i tıklatın.
Not: Elektronik kısmi veriler, grafikler ve görüntülerin sperm hücreleri parça ortalama değerleri sağlar. - Genel verileri seçmek | Dosya adı | Kaydetmek.
Not: Veri tüm alanları tek tek sperm için kinetik değerleri sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sperm motilitesi zaman etkisi analizi
Avrupa yılan balığı söz konusu olduğunda, statik sperm yüzdesi artmış 15 s 120 s sonra harekete geçirmek (den % %40.7 24,4) ve mobil ilerici sperm yüzdesi düşmüştür (den %36,9 %20,9) (Şekil 1A ve 1B). Hızına göre sperm hücreleri hızlı bir düşüş zamanla azalmıştır (Şekil 1 c ve 1 D) gösterdi. Hızlı hız ile sperm elde yüzdesi yaklaşık % 23 (den %49.4 %26,6) azalmış ve orta hızlı ile sperm elde yüzdesi yaklaşık % 7 artış.
Kare hızı ve sayım odası
Farklı türlerin en iyi sonuçlar için farklı kare hızları gerektirir. Rus mersin balığı 150 kare / saniye (fps; gerektirir Şekil 2A); sazan gerektirir 100 fps (Şekil 2B); ve gölge balığı için 200 fps en uygun kinetik sonuçları (Şekil 2C) elde etmek yeterli değildi. Bu sonuç sayma derinlik üzerinde bağımlı değildi oda test (Şekil 2A-2 C).
Sperm altgrupları yapısı
Sperm subpopulation tanımlaması istatistiksel analize dayalı. Müdür tayini ilk adımdır bileşenleri (asıl bileşen analizi; PCA) hareketliliği veri kümesinin tamamı üzerinden. O zaman, küme yordamları PCA sonra elde edilen sperm elde edilen endeksleri ile gerçekleştirilir.
Bu çalışma için biz adlı dört farklı altgrupları gösterdi Atlantik somonu sperm kullanılan: doğrusal olmayan yavaş (düşük LIN, STR ve VCL), doğrusal olmayan (alt STR, yüksek VCL), hızlı hızlı doğrusal (yüksek LIN, STR ve VCL) ve en hızlı doğrusal (en yüksek LIN, STR ve VCL). Bu altgrupları için vahşi hayvanlardan nesiller boyunca çeşitli dağıtım olanlar (Şekil 3) çiftlik.
Resim 1 : Progressivity ve Avrupa yılan balığı sperm hareketliliği zaman etkinleştirme sonrası etkisi. A ve B) yüzde 15 ile 120 s, progressivity, sırasıyla; ve C ve D) hareketliliği yüzdesine dayanarak hızına zamanla (15 ve 120 s etkinleştirme sonrası, sırasıyla). Progressivity üç gruba ayrıldı: progresif hareketli hücreler (beyaz; VCL demek ± SD değeri: 114.5 18,2 ve 101.4 ± ± 34.5 µm/s 15 ve 120 s, sırasıyla), hiçbir progresif hareketli hücreler (gri; VCL demek ± SD değeri: 84,8 ± 17,4 µm/s 15 s ve 84.6 ± 16,5 µm/s için 120 s) ve statik sperm hücreleri (siyah). Sperm elde hız 4 gruba ayrıldı: hızlı (VCL demek ± SD değeri: 119.3 ± 13,7 µm/s 15 s ve 118.9 ± 13.3 µm/s için 120 s; beyaz), Orta (VCL demek ± SD değeri: 79,7 ± 15,5 µm/s 15 s ve 79,6 ± 15,5 µm/s için 120 s; açık gri) , yavaş (VCL demek ± SD değeri: 32,9 ± 6.5 µm/s 15 s ve 32,6 ± 6,6 µm/s için 120 s; koyu gri) ve statik (siyah). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Kare hızı ve üç tatlı su balık türlerinin sayım odasında etkisi: (A) Rus mersin balığı (B) ortak sazan ve (C) gölge balığı. 50, 100, 150 sperm analizi yapıldı ve iki ticari sayma kullanarak 200 fps odaları farklı derinliklerde (10 ve 20 µm) ile. Siyah daire her türün en iyi kare hızını temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Sperm altgrupları yapısını Atlantik somon, üç kuşak: vahşi erkek (F0) ve esaret (F1 ve F2) üretilen ilk iki kuşak. Küme analizi sonra dört altgrupları gözlenmiştir: yavaş doğrusal olmayan sperm hücreleri (düşük LIN, STR ve VCL; küme 1; siyah), hızlı doğrusal olmayan sperm hücreleri (alt STR, yüksek VCL küme 2; koyu gri), hızlı doğrusal sperm hücreleri (yüksek LIN, STR ve VCL; 3; küme Orta Gri) ve en hızlı doğrusal sperm hücreleri (en yüksek LIN, STR ve VCL; küme 4; açık gri). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 1. İyi (A) ve (B) en kötü hücre konsantrasyonu tanımlanan Avrupa yılan balığı sperm hareketliliği analiz farklı görme bölgelerine. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol için kullanılan sperm analiz yazılımı araştırmacılar tarafından Dünya çapında balık da dahil olmak üzere farklı türler için kullanılmıştır. Ancak, balık sperm değerlendirmesi etkileyen belirli bazı özellikleri var. Balık sperm hücreleri yüksek hızlı hızlı düşüşler ve hareketliliği, için kısa bir süre sonra harekete geçirmek yol harekete geçirmek anında gösterdi. Ayrıca, üreme sıcaklığını tür bağlıdır ve bazı durumlarda, yaklaşık 4 ° C2,4,8,12olabilir. Böylece, balık sperm analizi için bir bilgisayar sistemi verimliliğini artırmak için bazı uyarlamalar yapmak gereklidir. Motilite parametre temel prensibi toplama ve Analizi hareketli sperm art arda gelen görüntülerin var. Çoğu sistem donanım ve yazılım17,18,19,20,21,22sınırlamaları nedeniyle standart kare hızları (16, 25, 30, 50 veya 60 fps) kullanır. Ancak, bazı çalışmalar daha yüksek bir kare hızı VCL, STR, gibi bazı hız parametreleri arttığını gösterdi BCF15,23,24. Sperm hyperactivation değerlendirmek ve maksimum hız sperm hücreleri11,17,18,19, bulmak gerekli olduğunda bu özellikle önemlidir 25. analiz sıcaklık ile ilgili olarak, optik mikroskop ve sabit sıcaklıkta örnekleri soğutmak için yeni bir teknoloji için soğutma bir tabak da zaman içinde analiz artırabilirsiniz. Mevcut çalışma iki balık sperm hareketliliği Analizi ve sıcaklık hassasiyet ile ilişkili ana sorunları çözmek için bir yaklaşım sunmaktadır. Harekete geçirmek orta her tür için adapte olmalı rağmen bazı tatlı türler üzerinde odaklanarak sonuçlar rağmen bu metodoloji deniz türleri için kullanılabilir.
İçinde belgili tanımlık çarşı, bir ürün yelpazesi veya aynı ürünün bile farklı sürümleri vardır. Sistemleri aynı prensip olabilir bile, her biri farklı ayrıntıları sonuçları26,27,28uyuşmazlığı kaynaklanan vardır. Ayrıca, balık sperm kalitesinin değerlendirilmesi hala metodolojik ve teknik sınırlamaları olabilir. Sperm etkinleştirme tekniği ve aktivasyon sonra analiz zaman sperm kalitesi değerlendirme29,30etkileyen iki önemli faktör vardır. Sperm örnekleri etkinleştirme ile görüntü sabitleme arasındaki süre video kayıtları 5 civarında olmalıdır s ilk saniye (zaman aralığı 5-20 s) beri sağlar en yararlı veri2,4. Sperm analizi zaman cam slayt üzerinde yoğunlaşma sorunları nedeniyle sınırlı olabilir. Ancak, balık sperm hücreleri iki dakika2katını ile güçlü bir hareketi etkin kalır. Teknik bir düzeyde, Sperm hücreleri yörüngeleri15doğru bir inşası verir ayrıntılı bilgi edinmek için "en iyi" kare hızı bilmek gereklidir. Yüksek kare hızlarında bilgileri gereksiz15,31duruma gelir, ancak daha düşük kare hızlarında yörünge ayrıntılarını, özellikle hızlı ve doğrusal olmayan sperm kaybolur. Bazı balık türleri için çerçeve oranı (ilâ 250 fps) Grayling ve somon gibi bazı balık türleri için maksimum hız sperm bulmak için yeterli olamazdı. Bu varyasyon belirli türdür ve protokol standartlaştırmak ve güvenilir sonuçlar15,23,24elde etmek her tür tanımlanmış olmalıdır. Sayım odasının derinlik balık büyük kamçı hareketi sınırlayabilir ve sperm hücreleri maksimum hız11,32,33ulaşamadı. Ayrıca, bir kavşak hücre olduğunda yazılım gerçek sperm algılama içinde bazı sınırlamalar olabilir.
Klasik sperm kalitesinin değerlendirilmesi konsantrasyon tahmini ve değişkenlik sonuçlar üretebilir hareketliliği yüzdesini temel öznel bir analizidir. Ancak, bir bilgisayar sistemi hızlı, doğru ve nicel ölçümler hareketliliği parametreleri sağlar. Bu tarafsız analiz veri büyük miktarda verir ve sonuçları34,35,36,37değişkenliği azaltır. Yanıt sperm hareketliliği davranış analizi sıcaklığına bağlıdır ve türler38,39,40arasında değişir. Sperm analizinin en uygun sıcaklık sperm hızı ve üreme38,40doğal koşullara benzer hareketliliği döneminin süresi sağlayabilir. Bu nedenle, sperm analizi yazılım soğutma cihazları ile balık sperm kalitesinin değerlendirilmesi geliştirir.
Sperm kalitesi analizi sonuçlarını balık sperm özellikleri ve sperm altgrupları üzerinde hangi-ebilmek var olmak tüm hayvan türlerinin41,42değerlendirilmesinde sperm geleceği göre kalitesi hakkında bilgi artırabilirsiniz. Pratik bir düzeyde bu tekniği yüksek kaliteli damızlık ve seçim süreci, seminal doz hesaplama Suni tohumlama, hız ve progressivity göre sperm rekabet için sperm hakkında daha fazla bilgi almak için yardımcı olur bir göstergesi olabilir ve doğurganlık potansiyel. Bu bilgi balık sperm depolama ilgi ve dondurma geçen yıl2,13' te teşvik su ürünleri yetiştiriciliği ve koruma programları da dahil olmak üzere farklı araştırma alanlarına uygulanır. Toksikolojik etkileri de özel ilgi alanlarına yönelik çalışmalar gibi çevresel sorunlar nedeniyle phylogenetical çalışmalar sperm hareketliliği özellikleri43,44tarihinde dayalı gelişimi alıyorsanız.
Bu eser nasıl balık sperm hareketliliği analizi için otomatik bir yazılım optimizasyon sonuçları geliştirir göstermiştir. Standardizasyon Protokolü'nün analiz ve tür bağlı olarak farklı olabilir kare hızı dikkate almanız gerekir. Ancak, balık sperm motilitesi Analizi araştırmacı özen iki kritik adımı vardır. Sperm contaminations nedeniyle örnek dışkı, idrar ve su tarafından tahrip edebilir ilk kritik adım oluşur (deniz suyu veya tatlı su). Diğer kritik nokta anı sperm etkinleştirme ve video kayıtları başlangıcı ile ilişkilidir. Bu adım en kısa zamanda sperm elde güçlü hareket olduğunda veri toplamak için yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu proje maliyet Birliği'nden fon aldı (Gıda ve tarım maliyet eylem FA1205: AQUAGAMETE ve Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı Marie Sklodowska-Curie altında proje Impress (GA No 642893). PROiSER, bilimsel ekibin öğrenci Alberto Vendrell Bernabéu, onun etkin katılımı video kayıt bu proje için özel olarak teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
- Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
- Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
- Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
- Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
- Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
- Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
- Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
- Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout - the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
- Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis? Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
- Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
- Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
- Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
- Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
- Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
- Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
- Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
- Holt, W. V., O'Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
- Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
- Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
- Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
- Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
- Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
- Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
- David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
- Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
- Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
- Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
- Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
- Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
- Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
- Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
- Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
- Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).
