Summary
Denne protokol beskriver en procedure af fisk sperm vurdering ved hjælp af computer-assisteret sædanalyse og afkøling enheder. Softwaren giver en hurtig, nøjagtig og kvantitativ analyse af fisk sædkvalitet baseret på sædcellerne motilitet, som kan være et nyttigt redskab i akvakultur at forbedre reproduktion succes.
Abstract
For evaluering af kvaliteten af gamet er der innovative, hurtig og kvantitative teknikker, der kan give nyttige oplysninger for akvakultur. Edb-systemer til sædanalyse blev udviklet til at måle flere parametre og en af de mest almindeligt målte er sperm motilitet.
Oprindeligt, designet denne computerteknologi til pattedyrarter, selv om det kan også bruges til fisk sædanalyse. Fisk har specifikke egenskaber, der kan påvirke sædcellerne vurdering som en kort motilitet tid efter aktivering og i nogle tilfælde tilpasning til lavere temperaturer. Det er således nødvendigt at ændre både software og hardware komponenter for at effektivisere motilitet analyse for fisk sædanalyse. For pattedyr sperm bruges den varme plade til at opretholde optimale temperaturer på sædcellerne. Men for nogle fiskearter, det er fordelagtigt at bruge en lavere temperatur til at forlænge varigheden af motilitet, da spermen forbliver aktive i mindre end 2 min. Det er derfor nødvendigt at nedkøle prøver ved konstant temperatur over tid af analyse, herunder på optisk mikroskop afkøling enheder. Denne protokol beskriver analysen af fisk sperm motilitet ved hjælp af software til sædanalyse og ny afkøling enheder for at optimere resultaterne.
Introduction
Effekten af reproduktion afhænger af kvaliteten af både mælke-(æg og sædceller)1,-2. Dette er den vigtigste faktor, der bidrager til vellykket befrugtning, giver mulighed for udvikling af levedygtige afkom3,4. Praktisk evaluering af gamet kvalitet er det bedste redskab til at definere frugtbarhed potentiale af et prøveeksemplar.
Blande sperm fra flere hanner er en fælles praksis i produktionen af mange akvatiske kommercielle arter4. Men sperm variabiliteten mellem hanner kan føre til sperm konkurrence, og derfor ikke alle mænd lige så bidrager til genpulje5. I denne forstand er den korrekte vurdering af individuelle ejakulere/sædcellerne funktioner, såsom motilitet, grundlæggende at indhente diskriminerende oplysninger vedrørende individuelle mandlige fertilitet potentielle. Direkte observation af sædkvalitet kan producere upræcise og subjektive data, da det kræver tid og erfaring, hvilket fører til en mangel på konsekvens og uforenelighed af resultater6,7. Men der er mange innovative, hurtig og kvantitative teknikker, der kan give en pålidelig sæd kvalitet analyse2,4.
Computerstøttet sædanalyse blev udviklet for at tilbyde nøjagtige data om sæd kvalitet8. Denne teknologi omfatter udvikling af software forbundet med en fase kontrast mikroskop, der giver mulighed for vurdering af sædkvalitet. Men en begrænsende faktor for motilitet parameter er frame rate af den video kameraet. Enkelte sædcellerne baner er baseret på sædcellerne hoved barycentrum position i på hinanden følgende frames på video-optagelser, som er korreleret med flagellaternes bevægelse mønstre3,9,10, 11. de vigtigste kinetiske parametre måles er lineær hastighed (VSL), krum hastighed (VCL) og gennemsnitlig sti hastighed (VAP). VSL er afstanden mellem start og end-point taget af sædcellerne divideret med tiden. VCL er den reelle hastighed langs den præcise bane truffet sædcellerne. VAP er hastighed langs en afledt glattes sti bane. Disse parametre giver mulighed for yderligere kinetic oplysninger, herunder linearitet (LIN), rethed (STR), wobble (WOB) og slå målinger som amplitude af lateral hoved bevægelse (ALH) og beat-cross frekvens (BCF)4,10.
Sperm analysesystem blev oprindeligt brugt til pattedyrarter, og et af kravene til systemet er at operere ved kropstemperatur af donor (ca. 37 ° C). Denne software kan også bruges til fiskearter; selv om det er nødvendigt at foretage nogle tilpasninger at reducere fejl af sperm analyseresultater. I nogle fiskearter såsom laksefisk og ål8,12, sker befrugtning ved lav temperatur (ca. 4 ° C)2,4. Således, køling enheder bør udvikles for at undgå ubehagelige arbejdsbetingelser. Derudover fisk sædcellerne er immotile i sædvæsken og kræver en osmotisk chok at aktivere motilitet. Ferskvandsfisk har activator medium hypotonic osmolalitet, mens for marine arter medium bør hypertonisk. Men for nogle arter, som laksefisk, ion koncentration kunne også være vigtigt3,4,9. Efter aktivering, er fisk sæd kendetegnet ved en hurtig nedgang af motilitet (mindre end 2 min)13,14 , og høj hastighed, er afgørende for at bestemme den optimale billedhastighed at få pålidelige data15.
Formålet med denne undersøgelse er at designe og anvende køleanlæg for fisk sperm prøver. Derudover definerer denne protokol hvordan til at bestemme de optimale frame rates til etablering af standardprotokoller dyrearten. Anvendelse af denne protokol åbner nye døre i forbindelse med fisk skelsættende evaluering, ved hjælp af den europæiske ål som en model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurer, der involverer dyr emner har været godkendt (2015/VSC/ærter/00064) af den generelle retning af landbrugsproduktionen og husdyr på Universitat Politècnica de Valencia.
1. indsamle sæd fra modne europæiske ål i fangenskab
Bemærk: Brug europæiske ål hanner vedligeholdes i tanke med havvand og en recirkulation system ved konstant temperatur (20 ° C). Behandling med hormoner gennem ugentlige intraperitoneal injektion (humant choriongonadotropin (hCG), 1,5 IE pr. g fisk kropsvægt). Akklimatisere fisk gradvist begyndende med 3 dage i ferskvand efterfulgt af udskiftning med havvand (1/3 af den samlede vand i tanken) hver 2 dage indtil nå en saltholdighed på 37.0 g/mL.
- Bedøver ål 24 h efter hormon injektion til at få prøver med bedre sædkvalitet.
- Forberede anæstesi på forhånd: tilføje 300 mg af benzocain til 100 mL med 70% ethanol. Bland godt og opbevares ved 4 ° C.
- Fortynd benzocain i en fleksibel spand med 5 L system vand at få en endelig koncentration på 60 mg/L og blandes ordentligt.
- Overføre fisken til spanden med system vand og benzocain. Vent et par minutter indtil fisken roligt ned.
- Ryd kønsdelene med vand og tør med absorberende papir til at undgå forurening af sperm prøver af fæces, urin eller havvand.
- Anvende blide tryk i maveregionen og indsamle sperm prøver i 15 mL plastik rør ved hjælp af en vakuumpumpe. Sperm volumen op til 6-7 mL, afhængigt af mandlige.
- Holde sædceller prøver ved 4 ° C i mindst 1 time, indtil motilitet analyse er foretaget.
2. opbevares i køleskab og fortyndet sæd prøver
- Forberede den diluter løsning på forhånd.
Bemærk: Sperm prøver skal fortyndes i opløsningen extender specifikke for hver art.- Forberede ål sperm prøver (P1 medium) ikke-aktivator medium. Tilføje 0,42 g natriumbicarbonat, 1.828 g natriumchlorid, 0.127 g magnesiumchlorid, 0,56 g kaliumchlorid og 0.037 g af calcium chlorid til 250 mL destilleret vand. Bland godt at opløse. Opbevares ved 4 ° C.
- Angiv den køligere blok ved 4 ° C at opretholde prøver ved en konstant temperatur. Vent, indtil temperaturen stabiliserer.
- Fortynd de sperm prøver ved hjælp af det diluter løsning specifikt for hver art.
Bemærk: Fortyndingsforholdet er artsspecifikke og skal være defineret til at standardisere protokollen. Først beregne koncentrationen af sædceller baseret på den koncentration, der er opnået i den forudgående analyse af motilitet ved hjælp af software, som forklaret i trin 3 og 4. Med denne analyse er det også muligt at vælge de bedste sperm prøver baseret på andelen af motilitet. Efter dette, kan forskeren begynde at indsamle data til eksperimentet ved hjælp af de bedste prøver med den korrekte koncentration.- Fortynd ål sperm prøver i P1 medium med et forhold på 1:50. For at forberede 500 µL af ål fortyndet sæd, tilsæt 50 µL af de friske sædprøve og 450 µL af P1. Bland godt.
3. evaluere Sperm motilitet parametre
-
Set-up modulet motilitet af softwaren
- Sætte køligere scenen ved 4 ° C og vente, indtil det stabiliserer.
- Åbn softwaren, og vælg Motilitet modul. Oprette Brugernavn og adgangskode, hvis det er nødvendigt.
- Vælg Egenskaber og vælg de ønskede parametre før du starter en sædanalyse.
- Klik på arter | Fisk.
- Vælg de Billeder i sekundet og Antallet af billeder, afhængigt af de bedste tekniske betingelser for hver art. Angive begge indstillinger på 120 billeder pr. sekund.
- Vælge negative kontrast. Det er obligatorisk for nøjagtige genopbygningen af sædcellerne baner16.
- Vælg tilsvarende Tælle kammer og omfanget af den video kameraet. Kalibrere videokamera for forstørrelse linsen bruges i eksperimentet. Angiv SpermTrack10 som tælle kammer og 10 X skala.
Bemærk: generelt en dybde på 10 µm i salen, optælling og en forstørrelse linsen af 10 X er de anbefalede betingelser da de giver en bedre fokusering af alle sædcellerne og fange det højeste antal celler. Men, det anbefales at foretage en tidligere undersøgelse af de optimale betingelser for motilitet analyse af hver art. - Justere Partikel område og tilslutningsmuligheder for hver art. Sat minimum partikel område på 2 µm2 og tilslutning på 7 µm.
Bemærk: For fisk, den mindste værdi af partikler område spænder mellem 2-5 µm, og connectivity afhænger af sædcellerne hastighed og framerate. - Gem set-up.
- Vælg fange.
-
Analysere europæiske ål Sperm med Software
- Forbered aktivator løsning (kunstigt havvand) ved at tilføje 0.946 g af kommercielle salt til 25 mL destilleret vand med 2% BSA.
- 500 ml af aktivator løsning (kunstigt havvand) og placere i de køligere blok.
Bemærk: I almindelighed, fisk sæd er aktiveret af en osmotisk chok begivenhed, selv om for nogle arter ion koncentration kunne også være vigtigt. Ferskvandsfisk har activator medium hypotonic osmolalitet, mens for marine arter medium bør hypertonisk. - Sætte den tælle kammer under den kølende fase og vente, indtil temperaturen stabiliserer til 4 ° C.
- Bland aktivator og fortyndet sæd til at aktivere sædcellerne og starte motilitet videooptagelsen mellem 5-10 s efter aktivering.
- Tage 4 µL af aktivator løsning og sted i salen, tælle.
- Forsigtigt homogeniseres den fortyndede sæd ved at ryste microcentrifuge 3 gange for at undgå skader i sædcellerne celler.
- Tage 0,5 µL fortyndede sæd, bland med aktivator og Sæt dækslet i salen, tælle hurtigt.
Bemærk: Dette trin bør ikke tage mere end 5 s at starte analysen hurtigst muligt. - Fokusere på sædcellerne celler og finde den bedste visuelle område, som er defineret af et lavt antal sædceller (150 til 200 celler) at undgå aflytning mellem cellerne (supplerende figur 1A). Vælg Capture Video til at opnå sædceller spor, som er adskilt efter hastighed.
- Vælg fange at få 3 til 7 felter, der er den optimale interval til at opnå en lavere variation i resultaterne, og fortsætte som før. Optag videoer indtil 120 s efter aktivering for at undgå kondens på forsiden af den tælle kammer.
- Vælg Exit at have et overblik over alle felterne.
4. opnå motilitet Data
- Vælg felter, | Delvis | Gem og vælge et filnavn. Klik på Gem.
Bemærk: Regnearket indeholder gennemsnitsværdier delvise data, diagrammer og billeder af sædcellerne spor. - Vælg generelle Data | Fil navn | Gemme.
Bemærk: Dataene giver kinetic værdier for individuelle sædcellerne af alle felter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse af tid effekt på sædkvalitet
For den europæiske ål, procentdelen af statisk sædcellerne steg fra 15 s til 120 s efter aktivering (fra 24,4% 40,7%), og procentdelen af mobile progressive sædcellerne faldet (fra 36,9% til 20,9%) (Figur 1A og 1B). Baseret på hastighed, sædcellerne celler viste et fald i hastigheden over tid (figur 1 c og 1 D) faldet. Procentdelen af sædcellerne med hurtig hastighed faldt omkring 23% (fra 49,4% til 26,6%) og procentdelen af sædcellerne med medium hastighed steget omkring 7%.
Effekten af den indramme sats og tælle kammer
Forskellige arter kræver forskellige billedfrekvenser for optimale resultater. Diamantstør kræver 150 frames per sekund (fps; Figur 2A); almindelig karpe kræver 100 fps (figur 2B); og for Stalling, 200 fps var ikke nok til at opnå optimal kinetic resultater (figur 2 c). Disse resultater var ikke afhængig af dybden af optællingen kammer testet (figur 2A-2 C).
Sperm delpopulationer struktur
Identifikation af sæden delpopulation er baseret på statistisk analyse. Det første trin er bestemmelsen af principal komponenter (principal komponent analyse; PCA) fra det komplette sæt af motilitet data. Derefter, de klyngedannelse procedurerne udføres med sæd-afledte indeksene fremstillet efter partnerskabs-og samarbejdsaftalen.
For denne undersøgelse, brugte vi atlanterhavslaks sæd, som viste fire forskellige delpopulationer, opkaldt: langsom nonlinear (lav LIN, STR og VCL), fast nonlinear (lavere STR, høj VCL), hurtigt lineær (høj LIN, STR og VCL) og hurtigste lineær (højeste LIN, STR og VCL). Fordelingen af disse delpopulationer varierede langs generationer fra vilde dyr opdrættet dem (figur 3).
Figur 1 : Effekt af tid efter aktivering om progressivitet og motilitet af europæiske ål sædceller. A og B) procentdel af progressivitet på 15 og 120 s, henholdsvis; og C og D) procentdelen af motilitet baseret på hastighed over tid (15 og 120 s efter aktivering, henholdsvis). Progressivitet var opdelt i tre grupper: progressive motile celler (hvide; VCL betyde værdi ± SD: 114,5 ± 18.2 og 101.4 ± 34,5 µm/s 15 og 120 s, henholdsvis), ingen progressiv motile celler (grå; VCL betyde værdi ± SD: 84.8 ± 17,4 µm/s for 15 s og 84.6 ± 16,5 µm/s for 120 s), og statisk sædcellerne (sort). Sædcellerne hastighed var opdelt i 4 grupper: hurtig (VCL betyde værdi ± SD: 119,3 ± 13,7 µm/s for 15 s og 118.9 ± 13.3 µm/s for 120 s, hvid), medium (VCL betyde værdi ± SD: 79,7 ± 15,5 µm/s for 15 s og 79,6 ± 15,5 µm/s for 120 s, lys grå) , langsom (VCL betyde værdi ± SD: 32.9 ± 6.5 µm/s for 15 s og 32,6 ± 6.6 µm/s for 120 s; mørk grå) og statiske (sort). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Effekten af framerate og tælle kammer i tre ferskvandsfisk arter: (A) Diamantstør b almindelig karpe og c Stalling. Sædanalyse foregik på 50, 100, 150 og 200 fps, ved hjælp af to kommercielle tælle kamre med forskellige dybder (10-20 µm). Den sorte cirkel repræsenterer den bedste frame rate for hver art. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Sperm delpopulationer struktur af tre generationer af atlanterhavslaks: vilde mænd (F0) og de første to generationer produceret i fangenskab (F1 og F2). Efter cluster analyse, fire delpopulationer observeret: langsom nonlinear sædcellerne (lav LIN, STR og VCL; klynge 1, sort), fast nonlinear sædcellerne (lavere STR, høj VCL klynge 2; mørk grå), hurtigt lineær sædcellerne (høj LIN, STR og VCL; klynge 3; mellemliggende grå) og hurtigste lineær sædcellerne (højeste LIN, STR og VCL; klynge 4, lys grå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1. Forskellige visuelle områder fra motilitet analyse af europæiske ål sperm defineret som (A) bedste og b værste celle koncentration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sperm analyse software, der anvendes i denne protokol er blevet brugt af forskere på verdensplan for forskellige arter, herunder fisk. Fisk har dog nogle specifikke funktioner, der kan påvirke sædcellerne vurdering. Fisk sædcellerne viste høj hastighed i øjeblikket aktivisering hvilke falder hurtigt og fører til en kort tid af motilitet efter aktivering. Desuden temperatur reproduktionshandlinger er arter-afhængige, og i nogle tilfælde kunne være ca. 4 ° C2,4,8,12. Det er således nødvendigt at foretage nogle tilpasninger til at forbedre effektiviteten af et edb-system for fisk sædanalyse. Det grundlæggende princip om parameteren motilitet er erhvervelse og analyse af flere på hinanden følgende billeder af motile sædceller. De fleste systemer bruger standard billedhastigheder (16, 25, 30, 50 eller 60 fps) på grund af begrænsninger af hardware og software17,18,19,20,21,22. Nogle undersøgelser viste imidlertid, at en højere billedhastighed øger nogle hastighed parametre, såsom VCL, STR, BCF15,23,24. Dette er især vigtigt, når det er nødvendigt at vurdere hyperactivation af sædceller og finde den maksimale hastighed af sædcellerne11,17,18,19, 25. med hensyn til temperatur af analyse, en afkøling plade for optisk mikroskop, og en ny teknologi at nedkøle prøver ved konstant temperatur kunne også forbedre analysen over tid. Den nuværende arbejde tilbyder en tilgang til at løse to af de vigtigste problemer i forbindelse med fisk sperm motilitet analyse og temperatur sensibilitet. Trods resultaterne med fokus på nogle ferskvandsarter, kunne denne metode bruges til marine arter, selv om aktivisering mediet bør tilpasses for hver art.
I markedet er der en række produkter eller endda forskellige versioner af den samme vare. Selv om systemerne kan have den samme princip, har hver enkelt forskellige detaljer resulterer i uforenelighed af resultater26,27,28. Desuden kan evalueringen af fisk sædkvalitet stadig har metodologiske og tekniske begrænsninger. Sperm aktivering teknik og tidspunktet for analyse efter aktivering er to afgørende faktorer, der påvirker sperm kvalitet evaluering29,30. Tid mellem aktivering af sperm prøver og stabilisering af image for video-optagelser bør være omkring 5 s siden de første sekunder (tidsinterval på 5-20 s) giver den mest nyttige data2,4. Tidspunktet for sædanalyse kan være begrænset på grund af kondensproblemer på glas dias. Dog forbliver fisk sædcellerne aktive med en kraftig bevægelse for mindre end to minutter2. På det tekniske plan er det nødvendigt at kende den "optimale" billedhastigheden til at indhente nærmere oplysninger, der giver en nøjagtig rekonstruktion af sædcellerne baner15. På lavere billedhastigheder er detaljerne i bane tabt, især for hurtig og ikke-lineære sædcellerne, hvorimod på højere rammehastigheder, oplysningerne bliver overflødige15,31. For visse fiskearter, rammen Vurder (op til 250 fps) kunne ikke være nok til at finde den maksimale hastighed af sædcellerne for visse fiskearter, som Stalling og laks. Denne variation er artsspecifikke og skal defineres for hver art til at standardisere protokollen og opnå pålidelige resultater15,23,24. Dybden af tælle kammer kan begrænse bevægelsen af den store fimrehår fisk og sædcellerne ikke kunne nå maksimale hastighed11,32,33. Softwaren kan desuden har visse begrænsninger i afsløring af de virkelige sædcellerne, når der er en skæring af celler.
Klassisk vurdering af sædkvalitet er en subjektiv analyse baseret på vurdering af koncentration og procent af motilitet, som kan producere variation på resultaterne. Men et edb-system giver hurtig, præcis og kvantitative målinger af motilitet parametre. Dette objektiv analyse giver en stor mængde data og reducerer variabiliteten af resultater34,35,36,37. Svar af sperm motilitet adfærd afhænger af temperaturen i analysen og varierer blandt arter38,39,40. Optimal temperatur af sædanalyse kunne give sperm hastighed og motilitet varighed svarer til naturforhold reproduktion38,40. Derfor forbedrer sperm analyse software med afkøling enheder evaluering af fisk sædkvalitet.
Resultaterne af sæd kvalitet analyse kunne forbedre viden om fisk sæd egenskaber og kvalitet baseret på sæd delpopulationer, som kan være fremtiden for sperm evaluering i alle dyrearter41,42. På et praktisk niveau, denne teknik kan være en indikator for høj kvalitet opdrættere og hjælper med at få flere oplysninger om sæd udvælgelsesproces, skelsættende doser beregning for kunstig befrugtning, sperm konkurrence baseret på hastighed og progressivitet og fertilitet potentielle. Al denne viden kan anvendes til forskellige forskningsområder, herunder akvakultur og bevarelse programmer, som stimuleret interessen for fisk sperm opbevaring og kryopræservering i de sidste årtier2,13. Toksikologiske effekter også får særlig interesse på grund af miljøproblemer, samt undersøgelser udviklingen af phylogenetical undersøgelser baseret på sperm motilitet karakteristika43,44.
Dette arbejde har vist, hvordan optimering af en automatisk software for fisk sperm motilitet analyse forbedrer resultaterne. Standardisering af protokollen skal der tages hensyn til temperaturen i analyse og billedhastighed, hvilket kunne være forskellige afhængigt af arterne. Analyse af fisk sædkvalitet har dog to vigtige skridt at forskeren bør være opmærksomme på. Sperm samling er det første vigtige skridt, der kan ødelægge prøven på grund af forureninger af fæces, urin og vand (saltvand eller ferskvand). Det andre kritiske punkt er knyttet til tidspunktet for sperm aktivering og begyndelsen af video-optagelser. Dette skridt bør ske så hurtigt som muligt for at indsamle data, når sædcellerne har energisk bevægelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette projekt har modtaget støtte fra foreningen omkostninger (fødevarer og landbrug COST Action FA1205: AQUAGAMETE, og EUs Horisont 2020 forskning og innovation program under Marie Sklodowska-Curie projekt IMPRESS (GA No 642893). Vi vil gerne takke det videnskabelige team af PROiSER, specielt til studerende Alberto Vendrell Bernabéu, for hans aktive deltagelse i videooptagelsen af dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
- Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
- Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
- Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
- Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
- Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
- Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
- Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
- Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout - the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
- Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis? Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
- Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
- Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
- Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
- Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
- Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
- Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
- Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
- Holt, W. V., O'Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
- Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
- Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
- Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
- Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
- Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
- Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
- David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
- Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
- Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
- Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
- Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
- Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
- Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
- Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
- Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
- Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).
