Summary
Le présent protocole décrit une procédure d’évaluation de sperme du poisson à l’aide de spermogramme assistée par ordinateur et de dispositifs de refroidissement. Le logiciel donne un rapide, précis et l’analyse quantitative de la qualité du sperme poisson basée sur la motilité des spermatozoïdes, qui peut être un outil utile pour l’aquaculture afin d’améliorer le succès de la reproduction.
Abstract
Pour l’évaluation de qualité de gamètes, il y a des techniques innovantes, rapides et quantitatives pouvant fournir des données utiles pour l’aquaculture. Systèmes informatisés pour l’analyse du sperme ont été développées pour mesurer plusieurs paramètres et un du plus souvent mesurée est la motilité des spermatozoïdes.
Au départ, cette technologie informatique a été conçue pour les espèces de mammifères, mais il peut également être utilisé pour l’analyse de sperme des poissons. Les poissons ont des caractéristiques spécifiques qui peuvent affecter le sperme évaluation comme un temps de motilité court après l’activation et, dans certains cas, adaptation aux températures inférieures. Ainsi, il est nécessaire de modifier les composants logiciels et du matériel pour faire l’analyse de motilité plus efficace pour l’analyse du sperme poisson. Pour des spermatozoïdes chez les mammifères, la plaque chauffante est utilisée pour maintenir les températures optimales de spermatozoïdes. Toutefois, pour certaines espèces de poissons, il est avantageux d’utiliser une température plus basse pour prolonger la durée de la motilité, étant donné que les spermatozoïdes restent actives pendant moins de 2 min. Dispositifs de refroidissement sont donc nécessaires de réfrigérer les échantillons à température constante pendant la durée de l’analyse, le microscope optique. Ce protocole décrit l’analyse de la motilité de sperme du poisson à l’aide de logiciels pour l’analyse du sperme et de nouveaux dispositifs afin d’optimiser les résultats de refroidissement.
Introduction
L’efficacité de la reproduction dépend de la qualité de ces deux gamètes (oeufs et du sperme)1,2. C’est le principal facteur qui contribue à une fécondation réussie, permettant le développement d’une descendance viable3,4. L’évaluation pratique de la qualité des gamètes est le meilleur outil pour définir le potentiel de fécondité d’un spécimen.
Mélange de spermatozoïdes provenant de plusieurs mâles est une pratique courante dans la production de nombreuses espèces commerciales aquatique4. Cependant, la variabilité de sperme entre mâles peut conduire à la compétition spermatique et, par conséquent, pas tous les hommes contribuent également au pool génétique5. En ce sens, l’évaluation correcte des fonctionnalités de chaque éjaculat/spermatozoïdes, tels que la motilité, est fondamentale pour obtenir des informations au sujet de la fertilité masculine individuelle potentiel discriminatoires. L’observation directe de la motilité des spermatozoïdes peut produire des données inexactes et subjectives car elle nécessite temps et l’expérience, ce qui conduit à un manque d’uniformité et d’incompatibilité des résultats6,7. Cependant, il y a beaucoup de techniques innovantes, rapides et quantitatives qui peut fournir un sperme fiable qualité analyse2,4.
Spermogramme assistée par ordinateur a été développé pour offrir des données précises sur la qualité de sperme8. Cette technologie comprend le développement d’un logiciel associé à un microscope à contraste de phase qui permet l’évaluation de la motilité des spermatozoïdes. Cependant, un facteur limitatif du paramètre de la motilité est la fréquence d’images de la caméra vidéo. Spermatozoïdes individuels trajectoires sont basés sur les spermatozoïdes tête position centroïde dans images consécutives d’enregistrements vidéo, qui est en corrélation avec le mouvement flagellaire patrons3,9,10, 11. les principaux paramètres cinétiques mesurés sont la vitesse linéaire (VSL), la vitesse curviligne (VCL) et la vitesse moyenne des chemins (VAP). VSL est la distance entre le début et le virage pris par les spermatozoïdes divisés par le temps. VCL est la vitesse réelle le long de la trajectoire exacte prise par les spermatozoïdes. VAP est la vitesse sur un tracé lissée dérivée de trajectoire. Ces paramètres permettent de plus d’informations cinétiques, y compris linéarité (LIN), rectitude (STR), wobble (WOB) et battant mesures comme l’amplitude de mouvement latéral de la tête (ALH) et la fréquence de battement-Croix (BCF)4,10.
Le système d’analyse de sperme a été initialement utilisé pour les espèces de mammifères, et l’une des exigences pour le système doit fonctionner à la température du corps du donneur (environ 37 ° C). Ce logiciel pourrait également être utilisé pour les espèces de poissons ; mais, il est nécessaire de faire quelques adaptations afin de réduire l’erreur des résultats d’analyse de sperme. Chez certaines espèces de poissons, tels que les salmonidés et les anguilles8,12, la fécondation a eu lieu à basse température (environ 4 ° C)2,4. Ainsi, les dispositifs de refroidissement devraient être élaboré afin d’éviter des conditions de travail pénibles. En outre, les spermatozoïdes de poissons sont immobiles dans le liquide séminal et nécessitent un choc osmotique pour activer la motilité. Pour les espèces d’eau douce, le milieu de l’activateur devrait avoir osmolalité hypotonique, tandis que les espèces marines, le milieu doit être hypertonique. Toutefois, pour certaines espèces, comme les salmonidés, la concentration en ions pourrait également être important3,4,9. Après activation, poisson sperme est caractérisé par une rapide diminution de la motilité (moins de 2 min)13,14 et haute vitesse, étant essentiel pour déterminer la fréquence d’images optimale afin d’obtenir des données fiables15.
Cette étude vise à concevoir et appliquer des systèmes de réfrigération pour les échantillons de sperme de poissons. En outre, ce protocole définit comment déterminer la cadence optimale pour la mise en place de protocoles normalisés selon les espèces. L’utilisation de ce protocole ouvre de nouveaux horizons dans le cadre de l’évaluation séminal du poisson, à l’aide de l’anguille européenne comme un modèle.
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Protocol
Procédures avec des sujets animaux ont été approuvées (2015/VSC/pois/00064) par la Direction générale de la Production agricole et l’élevage à l’Universitat Politècnica de València.
1. recueillir des spermatozoïdes d’anguilles européennes matures en captivité
Remarque : Utilisation anguille européenne les mâles maintenus dans des réservoirs avec l’eau de mer et un système de recirculation à température constante (20 ° C). Traiter avec des hormones par injection intrapéritonéale hebdomadaire (gonadotrophine chorionique humaine (hCG) ; 1,5 UI / g de poids poisson). Acclimater les poissons graduellement à partir de 3 jours en eau douce suivie de remplacement avec l’eau de mer (1/3 de l’eau dans le réservoir) tous les 2 jours jusqu'à arriver à une salinité de 37,0 g/mL.
- Anesthésier l’anguille 24 h après l’injection d’hormones pour prélever des échantillons avec une meilleure qualité de sperme.
- Avant l’anesthésie au préalable : ajouter 300 mg de benzocaïne à 100 mL d’éthanol à 70 %. Bien mélanger et conserver à 4 ° C.
- Diluer dans un seau flexible avec 5 L d’eau du système pour obtenir une concentration finale de 60 mg/L et de mélanger correctement la benzocaïne.
- Transférer le poisson dans le seau d’eau de système et de la benzocaïne. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que le poisson se calme.
- Effacer les parties génitales avec de l’eau et sécher avec du papier absorbant pour éviter la contamination des échantillons de sperme par les matières fécales, urine ou l’eau de mer.
- Appliquez une légère pression dans la région abdominale et recueillir des échantillons de sperme dans des tubes en plastique 15 mL à l’aide de la pompe à vide. Volume de sperme jusqu'à 6-7 mL, dépendant de l’homme.
- Conserver les échantillons de sperme à 4 ° C pendant au moins 1 h jusqu'à ce que la motilité analyse est effectuée.
2. conserver au réfrigérateur et de diluer les échantillons de sperme
- Préparer la solution DILUTEUR au préalable.
Remarque : Les échantillons de sperme doivent être dilués dans la solution d’extension spécifique pour chaque espèce.- Préparer le milieu non-activator pour les échantillons de sperme anguille (P1 moyen). Ajouter 0,42 g de bicarbonate de sodium, 1,828 g de chlorure de sodium, 0,127 g de chlorure de magnésium, 0,56 g de chlorure de potassium et 0,037 g de chlorure de calcium à 250 mL d’eau distillée. Mélange bien à dissoudre. Conserver à 4 ° C.
- Définir le bloc refroidisseur à 4 ° C pour conserver les échantillons à une température constante. Attendez que la température se stabilise.
- Diluer les échantillons de sperme à l’aide de DILUTEUR solution spécifique pour chaque espèce.
Remarque : Le coefficient de dilution est spécifique à l’espèce et doit être défini afin de standardiser le protocole. Tout d’abord, évaluer la concentration des spermatozoïdes après la concentration obtenue dans l’analyse préalable de la motilité utilisant le logiciel, comme indiqué dans les étapes 3 et 4. Avec cette analyse, il est également possible de sélectionner les meilleurs échantillons de sperme selon le pourcentage de la motilité. Après cela, le chercheur peut commencer à collecter les données de l’expérience en utilisant les meilleurs échantillons avec la concentration correcte.- Diluer les échantillons de sperme anguille dans le milieu de la P1 avec un ratio de 01:50. Pour préparer 500 µL de sperme anguille dilué, ajouter 50 µL de l’échantillon de sperme frais et 450 µL de P1. Bien mélanger.
3. évaluer les paramètres de la motilité de sperme
-
Mise en place du Module de motilité du logiciel
- Préparer un refroidisseur à 4 ° C et attendre qu’il se stabilise.
- Ouvrez le logiciel et sélectionnez Le Module de motilité. Créer le nom d’utilisateur et mot de passe si nécessaire.
- Sélectionnez Propriétés et choisissez les paramètres souhaités avant de commencer l’analyse du sperme.
- Cliquez sur espèces | Poissons.
- Sélectionnez Nombre d’Images, Images par seconde et selon les meilleures conditions techniques pour chaque espèce. Définissez les deux options à 120 images par seconde.
- Choisissez le contraste négatif. Il est obligatoire pour une reconstruction exacte des spermatozoïdes trajectoires16.
- Sélectionnez la correspondante Chambre de comptage et l' échelle de la caméra vidéo. Calibrer la caméra vidéo pour la lentille de grossissement utilisée dans l’expérience. Définir SpermTrack10 comme chambre de comptage et échelle de X 10.
Remarque : en général, une profondeur de 10 µm dans la chambre de comptage et une lentille de grossissement de 10 X sont les conditions recommandées car elles fournissent la meilleure mise au point de tous les spermatozoïdes et capturent le plus grand nombre de cellules. Toutefois, il est recommandé de réaliser une étude précédente sur les conditions optimales pour l’analyse de la motilité de chaque espèce. - Ajustez la Zone de particules et de la connectivité pour chaque espèce. Définir zone minimale de particules à 2 µm2 et la connectivité à 7 µm.
Remarque : Pour les poissons, la valeur minimale de la plage s’étend entre 2 à 5 µm et la connectivité des particules dépend de la vélocité des spermatozoïdes et la cadence. - Enregistrer la mise en place.
- Sélectionnez Capture.
-
Analyse de sperme anguille européenne avec le logiciel
- Préparer la solution d’activateur (eau de mer artificielle) en ajoutant 0,946 g de sel commercial à 25 mL d’eau distillée avec 2 % de BSA.
- Prenez 500 mL de solution d’activateur (eau de mer artificielle) et placer dans le bloc refroidisseur.
Remarque : en général, poisson sperme est activé par un événement choc osmotique, bien que pour certaines espèces, la concentration en ions pourrait aussi être importante. Pour les espèces d’eau douce, le milieu de l’activateur devrait avoir osmolalité hypotonique, tandis que les espèces marines, le milieu doit être hypertonique. - Mettre la chambre de comptage dans l’étape de refroidissement et attendez que la température se stabilise à 4 ° C.
- Mélanger le déclencheur et le sperme dilué pour activer les spermatozoïdes et lancer la vidéo de la motilité d’enregistrement entre 5-10 s après l’activation.
- Prendre 4 µL de solution d’activateur et place dans la chambre de comptage.
- Homogénéiser doucement le sperme dilué en secouant la microcentrifugeuse 3 fois pour éviter des dommages dans les cellules des spermatozoïdes.
- Prendre 0,5 µL de sperme dilué, mixer avec l’activateur et mettez le couvercle dans la chambre de comptage rapidement.
Remarque : Cette étape ne devrait pas prendre plus de 5 s pour commencer l’analyse dès que possible. - Mettre l’accent sur les cellules des spermatozoïdes et trouver la meilleure zone visuelle, qui est définie par un faible nombre de spermatozoïdes (150 à 200 cellules) pour éviter l’interception entre les cellules (Supplemental Figure 1 a). Sélectionnez Capture vidéo pour obtenir les pistes de spermatozoïdes, qui sont séparées en fonction de la vitesse.
- Sélectionnez capturer pour obtenir 3 à 7 champs, qui sont l’intervalle optimal pour obtenir une faible variabilité dans les résultats et procédez comme ci-dessus. Enregistrer des vidéos jusqu'à 120 s après l’activation afin d’éviter la condensation sur le couvercle de la chambre de comptage.
- Appuyez sur Exit pour avoir une vue générale de tous les champs.
4. obtenir des données de motilité
- Sélectionnez les champs de | Partielle | Enregistrer et choisir un nom de fichier. Cliquez sur Enregistrer.
NOTE : La feuille de calcul donne des valeurs moyennes des données partielles, des graphiques et des images de morceaux de spermatozoïdes. - Sélectionnez les données générales de | Nom du fichier | Enregistrer.
NOTE : Les données fournissent les valeurs cinétiques pour les spermatozoïdes individuels de tous les champs.
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Representative Results
Analyse de l’effet du temps sur la motilité des spermatozoïdes
Dans le cas de l’anguille européenne, le pourcentage de spermatozoïdes statiques est passée de 15 s à 120 s après l’activation (à partir de 24,4 % à 40,7 %) et le pourcentage de spermatozoïdes progressives mobiles a diminué (passant de 36,9 % à 20,9 %) (Figure 1 a et 1 b). Basé sur la vitesse, cellules spermatozoïdes ont montré une diminution de la vitesse au fil du temps (Figure 1C et 1D) a diminué. Le pourcentage de spermatozoïdes avec la vitesse rapide a diminué de 23 % environ (de 49,4 % à 26,6 %) et augmenté le pourcentage de spermatozoïdes avec une vitesse moyenne d’environ 7 %.
L’effet de la cadence et la chambre de comptage
Différentes espèces nécessitent différentes cadences pour des résultats optimaux. Esturgeon russe exige 150 images par seconde (i/s ; Figure 2 a) ; carpe commune nécessite 100 fps (Figure 2 b) ; et pour les ombres, 200fps ne suffisait pas obtenir des résultats optimaux de cinétiques (Figure 2). Ces résultats n’étaient pas dépendantes de la profondeur de la comptant chambre mis à l’essai (Figure 2 a-2 C).
Structure de sous-populations de sperme
L’identification de la sous-population de sperme est basée sur l’analyse statistique. La première étape est la détermination des principaux composants (analyse en composantes principales ; PCA) de l’ensemble des données de motilité. Puis, les procédures de gestion de clusters sont effectuées avec les indices de dérivés de sperme obtenus après l’APC.
Pour cette étude, nous avons utilisé le sperme de saumon de l’Atlantique qui a montré quatre différentes sous-populations, nommées : ralentir non linéaire (faible LIN, STR et VCL), fast non linéaire (STR inférieur, VCL élevé), rapide linéaire (haut LIN, STR et VCL) et plus rapide linéaire (plus haute LIN, STR et VCL). La distribution de ces sous-populations variés le long des générations provenant d’animaux sauvages d’élevage ones (Figure 3).
Figure 1 : Effet de l’activation dans les délais sur la progressivité et la motilité des spermatozoïdes de l’anguille européenne. A et B) pourcentage de progressivité à 15 et 120 s, respectivement ; et C et D) le pourcentage de la motilité basé sur la vitesse au fil du temps (activation après 15 et 120 s, respectivement). La progressivité est divisée en trois groupes : les cellules mobiles progressifs (blanc ; VCL moyenne ± écart-type de la valeur : 114,5 ± 18.2 et 101,4 ± 34,5 µm/s pour 15 et 120 s, respectivement), aucune cellule motiles progressive (gris ; VCL moyenne ± écart-type de la valeur : 84,8 ± 17,4 µm/s à 15 s et 84,6 ± 16,5 µm/s 120 s) et les spermatozoïdes statiques (noir). La vélocité des spermatozoïdes a été divisée en 4 groupes : rapide (VCL moyenne ± écart-type de la valeur : 119,3 ± 13,7 µm/s à 15 s et 118,9 ± 13,3 µm/s 120 s ; blanc), médium (VCL moyenne ± écart-type de la valeur : 79,7 ± 15,5 µm/s à 15 s et 79.6 ± 15,5 µm/s 120 s ; gris clair) , lente (VCL moyenne ± écart-type de la valeur : 32,9 ± 6,5 µm/s à 15 s et 32,6 ± 6,6 µm/s 120 s ; gris foncé) et statiques (noir). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’effet de la cadence et la chambre de comptage chez trois espèces de poissons d’eau douce : (A) esturgeon russe b carpe et (C) l’ombre. Spermogramme a été effectuée à 50, 100, 150 et 200 images par seconde, en utilisant le comptage commercial deux chambres de différentes profondeurs (10 à 20 µm). Le cercle noir représente la meilleure cadence pour chaque espèce. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Structure de sous-populations de sperme de trois générations de saumon de l’Atlantique : les mâles sauvages (F0) et les deux premières générations produites en captivité (F1 et F2). Après analyse typologique, quatre sous-populations ont été observées : ralentir les spermatozoïdes non linéaires (faible LIN, STR et VCL ; groupe 1 ; noir), rapide des spermatozoïdes non linéaires (STR inférieur, VCL haute cluster 2 ; gris foncé), rapide des spermatozoïdes linéaires (LIN haute, STR et VCL ; cluster 3 ; les intermédiaires gris) et plus rapide des spermatozoïdes linéaires (plus haut LIN, STR et VCL ; groupe 4 ; gris clair). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La Figure 1. Différentes aires visuelles de l’analyse de la motilité des spermatozoïdes de l’anguille européenne définie comme meilleur (A) et (B) pire la concentration cellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le logiciel d’analyse de sperme utilisé dans le présent protocole a servi par des chercheurs dans le monde entier pour les différentes espèces, y compris les poissons. Cependant, les poissons ont certaines caractéristiques spécifiques qui peuvent influer sur l’évaluation de sperme. Spermatozoïdes de poissons a montré la grande vitesse au moment de l’activation qui décline rapidement et mène à une courte période de motilité après activation. En outre, la température de reproduction dépend de l’espèce et, dans certains cas, il pourrait être autour de 4 ° C2,4,8,12. Ainsi, il est nécessaire de faire quelques adaptations pour améliorer l’efficacité d’un système automatisé pour l’analyse de sperme des poissons. Le principe de base du paramètre la motilité est l’acquisition et l’analyse d’images successives des spermatozoïdes. Plupart des systèmes utilisent des fréquences d’images standard (16, 25, 30, 50 ou 60 fps) en raison de limitations matérielles et logicielles17,18,19,20,21,22. Cependant, certaines études ont montré qu’une cadence supérieure augmente certains paramètres de vitesse, tels que de la VCL, STR, BCF15,23,24. Ceci est particulièrement important lorsqu’il est nécessaire d’évaluer l’hyperactivation des spermatozoïdes et de trouver la vitesse maximum de spermatozoïdes11,17,18,19, 25. en ce qui concerne la température de l’analyse, une plaque de refroidissement pour le microscope optique et une nouvelle technologie pour réfrigérer les échantillons à température constante pourrait également améliorer l’analyse au fil du temps. Le présent ouvrage propose une approche pour résoudre deux problèmes principaux associés avec la poisson spermatozoïdes motilité analyse et température de sensibilité. Malgré les résultats en se concentrant sur quelques espèces d’eau douce, cette méthode pourrait servir pour les espèces marines, bien que le support d’activation doit être adapté pour chaque espèce.
Sur le marché, il y a une gamme de produits ou même différentes versions d’un même produit. Même si les systèmes peuvent avoir le même principe, chacun a des détails différents, ayant pour résultat l’incompatibilité des résultats26,27,28. En outre, l’évaluation de la qualité du sperme poisson pourrait encore avoir des limitations méthodologiques et techniques. La technique d’activation de sperme et le temps d’analyse après l’activation sont deux facteurs essentiels qui influent sur la qualité de sperme pour évaluation29,30. Le délai entre l’activation des échantillons de sperme et la stabilisation d’image pour les enregistrements vidéo doit être environ 5 s depuis les premières secondes (intervalle de temps de 5 à 20 s) fournit les données plus utiles2,4. Le temps de l’analyse du sperme peut être limité en raison de problèmes de condensation sur la lame de verre. Toutefois, les spermatozoïdes de poissons restent actives avec un vigoureux mouvement pour moins de deux minutes2. Au niveau technique, il est nécessaire de connaître la fréquence d’images « optimal » pour obtenir des informations de détail qui donne une reconstruction exacte des spermatozoïdes trajectoires15. À une vitesse plus faible, les détails de la trajectoire sont perdus, en particulier pour les spermatozoïdes rapides et non linéaires, considérant que, à une vitesse plus élevée, l’information devient redondant15,31. Pour certaines espèces de poissons, le frame rate (jusqu'à 250 fps) pourrait ne pas suffire pour trouver la vitesse maximum de spermatozoïdes pour certaines espèces de poissons, comme l’ombre et le saumon. Cette variation est spécifique à l’espèce et doit être définie pour chaque espèce de standardiser le protocole et obtenir des résultats fiables15,23,24. La profondeur de la chambre de comptage peut limiter les mouvements du flagelle grand de poissons et les spermatozoïdes n’a pas peuvent atteindre la vitesse maximale de32,11,33. En outre, le logiciel peut avoir quelques limitations dans la détection des spermatozoïdes réels lorsqu’il y a une intersection des cellules.
Évaluation classique de la qualité du sperme est une analyse subjective basée sur l’estimation de la concentration et le pourcentage de la motilité, qui peut produire la variabilité des résultats. Toutefois, un système informatisé fournit des mesures rapides, précises et quantitatives des paramètres de motilité. Cette analyse objective donne une grande quantité de données et réduit la variabilité des résultats34,35,36,37. La réponse du comportement de la motilité de sperme dépend de la température de l’analyse et varie selon les espèces38,39,40. La température optimale de l’analyse du sperme pourrait fournir vitesse de sperme et la durée de la période de motilité semblable aux conditions naturelles de reproduction38,40. Par conséquent, logiciel d’analyse de sperme avec dispositifs de refroidissement améliore l’évaluation de la qualité du sperme poisson.
Les résultats des analyses de qualité de sperme pourraient améliorer les connaissances sur les caractéristiques de sperme de poisson et de la qualité issu des sous-populations de sperme, qui peut être l’avenir de l’évaluation de sperme dans toutes les espèces animales41,42. Au plan pratique, cette technique pourrait être un indicateur des éleveurs de haute qualité et permet d’obtenir plus d’informations sur les spermatozoïdes du processus de sélection, Calcul séminal doses à l’insémination artificielle, basée sur la vitesse et de la progressivité de la compétition spermatique et fertilité potentielle. Toutes ces connaissances peut être appliqué aux champs de recherche différents, y compris les programmes de conservation et de l’aquaculture, qui a stimulé l’intérêt pour le stockage de sperme de poissons et la cryoconservation dans les dernières décennies2,13. Les effets toxicologiques deviennent également un intérêt particulier en raison de problèmes environnementaux, ainsi que des études le développement des études phylogénétiques basées sur la motilité de sperme caractéristiques43,44.
Ce travail a montré comment l’optimisation d’un logiciel automatique pour l’analyse de la motilité de sperme poisson améliore les résultats. Normalisation du protocole doit tenir compte de la température de l’analyse et la fréquence d’images, qui peut différer selon les espèces. Cependant, l’analyse de la motilité des spermatozoïdes poisson a deux étapes cruciales que le chercheur doit faire attention. Prélèvement du sperme est la première étape critique qui peut détruire l’échantillon en raison de contaminations par les fèces, l’urine et l’eau (eau de mer ou d’eau douce). L’autre point critique est associée au moment de l’activation des spermatozoïdes et le début des enregistrements vidéo. Cette étape doit être faite dès que possible pour recueillir des données lorsque les spermatozoïdes ont vigoureux mouvement.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a reçu un financement de l’Association de coût (l’alimentation et l’Agriculture coût Action FA1205 : AQUAGAMETE et programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne en vertu de la Marie Sklodowska-Curie du projet IMPRESS (GA No 642893). Nous tenons à remercier toute l’équipe scientifique de PROiSER, plus précisément à l’étudiant Alberto Vendrell Bernabéu, pour sa participation active dans l’enregistrement vidéo de ce projet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
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