Summary
Dit protocol beschrijft een procedure van vis sperma evaluatie met behulp van computer-assisted sperma-analyse en koelingsapparaten. De software geeft een snelle, nauwkeurige en kwantitatieve analyse van vis spermakwaliteit gebaseerd op de beweeglijkheid van de spermacellen, die kan hierbij een nuttig instrument in de aquacultuur te verbeteren reproductie succes.
Abstract
Voor de evaluatie van de kwaliteit van de gameet zijn er innovatieve, snelle en kwantitatieve technieken die bruikbare gegevens op voor de aquacultuur levert kunnen. Geïnformatiseerde systemen voor sperma analyse werden ontwikkeld voor het meten van verschillende parameters en een van de meest gemeten is de beweeglijkheid van de zaadcellen.
In eerste instantie is deze computertechnologie ontworpen voor soorten zoogdieren, maar kan ook worden gebruikt voor fish sperma analyse. Vissen hebben specifieke kenmerken die sperma beoordeling zoals een korte motiliteit tijd na activering en, in sommige gevallen, aanpassing beïnvloeden kunnen aan lagere temperaturen. Dus, is het noodzakelijk zowel software als hardware onderdelen motiliteit analyse om efficiënter te maken voor fish sperma analyse te wijzigen. Voor zoogdieren sperma, wordt de verwarmingsplaat gebruikt voor het handhaven van optimale temperaturen voor spermacellen. Het is echter voor sommige vissoorten, voordelige met een lagere temperatuur te verlengen van de duur van de motiliteit, aangezien het sperma actief gedurende minder dan 2 minuten blijft. Dus, koeling apparaten zijn nodig om de monsters op constante temperatuur te koelen na verloop van de tijd van analyse, met inbegrip van de optische Microscoop. Dit protocol beschrijft de analyse van de beweeglijkheid van de zaadcellen van de vis met behulp van software voor sperma-analyse en nieuw koelingsapparaten voor het optimaliseren van de resultaten.
Introduction
De werkzaamheid van reproductie, hangt af van de kwaliteit van beide gameten (eieren en sperma)1,2. Dit is de belangrijkste factor die aan een succesvolle bevruchting bijdraagt, waardoor de ontwikkeling van levensvatbare nakomelingen3,4. De gunstige evaluatie van gameet kwaliteit is het beste instrument voor het definiëren van het potentieel van de vruchtbaarheid voor een specimen.
Mengen van sperma van meerdere mannetjes is een gangbare praktijk in de productie van veel commerciële waterdieren4. Echter de sperma variabiliteit tussen mannetjes kan leiden tot sperma competitie en, bijgevolg, niet alle mannen zijn even bij te dragen tot de genenpoel5. In die zin is is de correcte evaluatie van de individuele ejaculaat/spermacellen functies, zoals de motiliteit, fundamenteel voor het verkrijgen van discriminerende informatie over individuele mannelijke vruchtbaarheid potentieel. Directe observatie van de beweeglijkheid van de zaadcellen kan onjuist en subjectieve gegevens opleveren, aangezien het vereist tijd en ervaring, die tot een gebrek aan consistentie en onverenigbaarheid van resultaten6,7 leidt. Er zijn echter vele innovatieve, snelle en kwantitatieve technieken die voor een betrouwbare sperma kwaliteit analyse2,4 zorgen kunnen.
Computer-assisted sperma analyse werd ontwikkeld om bieden nauwkeurige gegevens over sperma kwaliteit8. Deze technologie omvat de ontwikkeling van software die is gekoppeld aan een fasecontrastmicroscoop waarmee de beoordelingvan de beweeglijkheid van de zaadcellen. Een beperkende factor van beweeglijkheid parameter is echter de framesnelheid van de videocamera. Individuele spermacellen trajecten zijn gebaseerd op spermatozoa hoofd centroid positie in opeenvolgende frames van de video-opnamen, zijn, die is gecorreleerd met de flagellar verkeer patronen3,9,10, 11. de belangrijkste kinetische parameters gemeten zijn de lineaire snelheid (VSL), kromlijnige snelheid (VCL) en gemiddelde pad snelheid (VAP). VSL is de afstand tussen de begin- en eindpunt door de spermacellen gedeeld door tijd genomen. VCL is de echte snelheid langs de precieze traject genomen door de spermacellen. VAP is de snelheid langs een afgeleide afgevlakte pad van traject. Deze parameters kunnen extra kinetische informatie, met inbegrip van de afstraffing metingen zoals amplitude van laterale hoofd verkeer (ALH) en beat-cross frequentie (BCF)4,10, lineariteit (LIN), rechtheid (STR) en wiebelen (WOB).
Het sperma analysesysteem werd oorspronkelijk gebruikt voor soorten zoogdieren, en een van de vereisten voor het systeem is om te werken op de lichaamstemperatuur van de donor (ongeveer 37 ° C). Deze software kan ook worden gebruikt voor vissoorten; Hoewel, het is noodzakelijk om enkele aanpassingen om de fout van de resultaten van de analyse van de zaadcellen. In sommige vissoorten, zoals zalmachtigen en paling8,12, optreedt bevruchting bij lage temperatuur (rond 4 ° C)2,4. Dus, koelingsapparaten moet worden ontwikkeld om te voorkomen dat ongemakkelijk arbeidsomstandigheden. Daarnaast vis spermacellen zijn immotile in zaadvocht vloeistof en vereisen een osmotische schok te activeren beweeglijkheid. Voor de zoetwater soorten moeten het medium activator hypotone osmolaliteit, terwijl voor mariene soorten het medium hypertonic moet. Echter voor sommige soorten zou zoals zalmachtigen, de ion-concentratie ook belangrijk3,4,9. Na activering, wordt vis sperma gekenmerkt door een snelle daling van de motiliteit (minder dan 2 min)13,14 en hoge snelheid, wordt van vitaal belang voor het bepalen van de optimale framesnelheid te verkrijgen van betrouwbare gegevens15.
De doelstellingen van deze studie zijn ontwerpen en toepassen van koelsystemen voor vis spermastaaltje. Bovendien, definieert dit protocol hoe om te bepalen van de optimale framesnelheid voor de oprichting van standaardprotocollen afhankelijk van de soort. Het gebruik van dit protocol opent nieuwe deuren in het kader van vis rudimentaire evaluatie, met behulp van de Europese aal als een model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures met betrekking tot dierlijke onderwerpen geweest goedgekeurd (2015/VSC/PEA/00064) door de algemene richting van landbouwproductie en vee op de Universitat Politècnica de València.
1. het verzamelen van sperma van volwassen Europese aalstand in gevangenschap
Opmerking: Gebruik Europese aal mannetjes gehandhaafd in tanks met zeewater en een recirculatiesysteem bij constante temperatuur (20 ° C). Behandelen met hormonen door per intraperitoneale injectie (humaan choriongonadotrofine (hCG); 1.5 IU per g vis lichaamsgewicht). Acclimatiseren langzamerhand met 3 dagen in zoetwater vis gevolgd door vervanging met zeewater (1/3 van de totale hoeveelheid water in de tank) om de 2 dagen tot het bereiken van een zoutgehalte van 37.0 g/mL.
- Anesthetize de aal 24 h na het hormoon inspuiten te verkrijgen van monsters met een betere kwaliteit van het sperma.
- De anesthesie tevoren bereiden: 300 mg benzocaïne toevoegen aan 100 mL 70% ethanol. Meng goed en bewaren bij 4 ° C.
- Verdun benzocaïne in een flexibele emmer met 5 L systeem water om een eindconcentratie van 60 mg/L en meng goed.
- De vis overbrengen in de emmer met water van het systeem en benzocaïne. Wacht enkele minuten totdat de vis kalmeren.
- Schakel het genitale gebied met water en droog met absorberend papier om te voorkomen dat besmetting van spermastaaltje door uitwerpselen, urine of zeewater.
- Toepassing van zachte druk in de buikstreek en verzamelen van het spermastaaltje in 15 mL kunststof buizen met behulp van de vacuümpomp. Sperma volume tot 6-7 mL, afhankelijk van het mannetje.
- Houden spermastaaltje bij 4 ° C gedurende ten minste 1 uur tot motiliteit analyse wordt uitgevoerd.
2. koelen en Verdun het spermastaaltje
- Bereid de verdunningsreeks oplossing vooraf.
Opmerking: Het spermastaaltje moeten worden verdund in de extender oplossing specifiek voor elke soort.- Het niet-activator medium voorbereiden op paling spermastaaltje (P1 medium). Voeg 0,42 g natriumbicarbonaat, 1.828 g natriumchloride, 0.127 g magnesiumchloride, 0.56 g kaliumchloride en 0.037 g van calciumchloride tot 250 mL gedestilleerd water. Mix goed te ontbinden. Bewaren bij 4 ° C.
- Stel het koeler blok bij 4 ° C te handhaven van de monsters bij een constante temperatuur. Wacht totdat de temperatuur stabiliseert.
- Verdun het spermastaaltje met behulp van de verdunningsreeks oplossing specifiek voor elke soort.
Opmerking: De verdunningsverhouding is soort specifieke en moet worden vastgelegd teneinde te standaardiseren van het protocol. Eerst, schatten sperma concentratie op basis van de concentratie verkregen in de voorafgaande analyse van beweeglijkheid met behulp van software, zoals uitgelegd in stap 3 en 4. Met deze analyse is het ook mogelijk om te selecteren van de beste spermastaaltje gebaseerd op het percentage van de motiliteit. Na dit, kunt de onderzoeker beginnen met het verzamelen van gegevens voor het experiment met behulp van de beste monsters met de juiste concentratie.- Verdun paling spermastaaltje in het medium van de P1 met een verhouding van 1:50. Ter voorbereiding van 500 µL van paling verdunde sperma, voeg 50 µL van het vers spermastaaltje en 450 µL van P1. Meng goed.
3. Evalueer de Parameters van de beweeglijkheid van sperma
-
Set-up het Motility-Module van de Software
- De koeler decor bij 4 ° C en wacht totdat het stabiliseert.
- Open de software en selecteer Motility Module. Gebruikersnaam en wachtwoord maken indien nodig.
- Selecteer Eigenschappen en kies de gewenste parameters voordat de sperma-analyse.
- Klik op soorten | Vis.
- Selecteer de Frames Per seconde en Aantal van afbeeldingen, afhankelijk van de beste technische voorwaarden voor elke soort. Beide opties instellen op 120 beelden per seconde.
- Negatief contrast kiezen. Het is verplicht voor nauwkeurige wederopbouw van de spermacellen trajecten16.
- Selecteer de overeenkomstige Tellen kamer en de schaal van de videocamera. Kalibreren van de videocamera voor de lens van de vergroting gebruikt in het experiment. SpermTrack10 als tellen kamer en 10 X schaal instellen
Opmerking: In het algemeen een diepte van 10 µm tellen aanwezig en de lens van een vergroting van 10 X zijn de aanbevolen voorwaarden omdat ze bieden beter richten van alle spermatozoïden en vangen het hoogste aantal cellen. Het is echter raadzaam een eerdere studie van de optimale voorwaarden voor analyse van de beweeglijkheid van elke soort te maken. - Pas de Particle gebied en connectiviteit voor elke soort. Minimale deeltje gebied vastgesteldop op 2 µm2 en connectiviteit tegen 7 µm.
Opmerking: Voor vis, de minimumwaarde van deeltjes gebied varieert tussen 2-5 µm en connectiviteit is afhankelijk van de spermacellen snelheid en de framerate. - Sla de set-up.
- Selecteer vastleggen.
-
Analyseren van Europese aal sperma met Software
- Bereid de activator oplossing (kunstmatig zeewater) door 0.946 g voor commerciële zout toe te voegen aan 25 mL gedestilleerd water met 2% BSA.
- Neem 500 mL activator oplossing (kunstmatig zeewater) en plaats in het koelere blok.
Opmerking: In het algemeen, vis sperma wordt geactiveerd door een gebeurtenis osmotische schok, hoewel voor sommige soorten de ion concentratie ook belangrijk kan zijn. Voor de zoetwater soorten moeten het medium activator hypotone osmolaliteit, terwijl voor mariene soorten het medium hypertonic moet. - Zet de tellen kamer onder de koeling fase en wachten tot de temperatuur tot 4 ° C. stabiliseert
- Meng de activator en verdunde sperma te activeren van spermatozoïden en de motiliteit en videoopname tussen 5-10 s na activering start.
- Nog 4 µL van activator oplossing en plaats in het tellen vergaderzaal.
- Meng voorzichtig de verdunde sperma door schudden van de microcentrifuge 3 keer om schade in spermacellen cellen te voorkomen.
- Neem 0,5 µL van verdunde sperma, meng met de activator, en zetten de cover in de tellen zaal snel.
Opmerking: Deze stap moet niet meer dan 5 s om te beginnen met de analyse zo spoedig mogelijk. - Focus op de spermacellen cellen en vind de beste visuele gebied, die wordt gedefinieerd door een laag aantal spermacellen (150 tot 200 cellen) om te voorkomen dat de interceptie tussen cellen (aanvullende figuur 1A). Selecteer Video vastleggen te verkrijgen van de spermacellen tracks, die volgens de snelheid worden gescheiden.
- Selecteer vastleggen te verkrijgen van 3 tot en met 7 gebieden, die de optimale interval te verkrijgen van een lagere variabiliteit in de resultaten, als voorheen. Record video's tot 120 s Activering achteraf om te voorkomen dat condensatie op de cover van de tellen kamer.
- Selecteer Afsluiten om een algemeen beeld van alle velden.
4. het verkrijgen van gegevens van de motiliteit
- Velden selecteren | Gedeeltelijke | Sla en kies de naam van een bestand. Klik op Opslaan.
Opmerking: Het werkblad biedt gemiddelde waarden van partiële gegevens, grafieken en afbeeldingen van spermatozoïden tracks. - Selecteer algemene gegevens | Bestandsnaam | Opslaan.
Opmerking: De gegevens bevatten kinetische waarden voor individuele spermacellen van alle velden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse van het effect van de tijd op de beweeglijkheid van de zaadcellen
In het geval van de Europese aal, steeg het percentage van de statische spermacellen van 15 s tot 120 s na activering (van 24,4% tot 40,7%) en het percentage mobiele progressieve spermacellen daalde (van 36,9% tot 20,9%) (Figuur 1A en 1B). Gebaseerd op snelheid, spermacellen cellen toonde een afname van de snelheid na verloop van tijd (Figuur 1 c en 1 D) daalde. Het percentage spermacellen met snelle snelheid daalde met ongeveer 23% (van 49,4% naar 26,6%) en het percentage spermacellen met middellange snelheid verhoogd ongeveer 7%.
Het effect van de framesnelheid en tellen kamer
Verschillende soorten vereisen verschillende beeldsnelheden voor optimale resultaten. Russische steur vereist 150 frames per seconde (fps; Figuur 2A); karper vereist 100 fps (figuur 2B); en voor de grayling, 200 fps was niet voldoende om optimale kinetische resultaten (figuur 2C) te verkrijgen. Deze resultaten waren niet afhankelijk van de diepte van het tellen kamer getest (figuur 2A-2 C).
Sperma subpopulaties structuur
De identificatie van sperma subpopulatie is gebaseerd op statistische analyse. De eerste stap is de bepaling van de belangrijkste componenten (belangrijkste componenten analyse; PCA) van de volledige gegevensset beweeglijkheid. Vervolgens worden de clustering procedures uitgevoerd met de zaadcellen afkomstige indices verkregen na het PCA.
We hebben voor deze studie, Atlantische zalm zaadcellen waaruit bleek vier verschillende subpopulaties, met de naam gebruikt: niet-lineaire langzaam (lage LIN, STR en VCL), niet-lineaire (lagere STR, hoge VCL), snel snel lineaire (hoge LIN, STR en VCL) en snelst lineaire (hoogste LIN, STR en VCL). De verdeling van deze subpopulaties gevarieerd langs generaties van wilde dieren aan gekweekte degenen (Figuur 3).
Figuur 1 : Effect van tijd na activering op de geleidelijkheid en de beweeglijkheid van sperma van Europese aal. A en B) Percentage van progressiviteit bij 15 en 120 s, respectievelijk; en C en D) het percentage van de motiliteit gebaseerd op snelheid na verloop van tijd (15 tot 120 na activering van de s, respectievelijk). De progressiviteit was verdeeld in drie groepen: progressieve motile cellen (wit; VCL betekent waarde van ± SD: 114.5 ± 18.2 en 101.4 ± 34,5 µm/s voor 15 en 120 s, respectievelijk), geen progressieve motile cellen (grijs; VCL betekent waarde van ± SD: 84.8 ± 17,4 µm/s voor 15 s en 84.6 ± 16,5 µm/s voor 120 s), en statische spermacellen (zwart). De spermacellen snelheid was onderverdeeld in 4 groepen: snelle (VCL betekent waarde van ± SD: 119.3 ± 13,7 µm/s voor 15 s en 118.9 ± 13,3 µm/s voor 120 s; wit), medium (VCL betekent waarde van ± SD: 79.7 ± 15,5 µm/s voor 15 s en 79.6 ± 15,5 µm/s voor 120 s; lichtgrijs) , traag (VCL betekent waarde van ± SD: 32.9 ± 6,5 µm/s voor 15 s en 32.6 ± 6.6 µm/s voor 120 s; donkergrijs) en statische (zwart). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Het effect van de framesnelheid en de tellen kamer in drie soorten van zoetwater vis: (A) Russische steur (B) karper en (C) vlagzalm. Sperma-analyse werd gedaan op 50, 100, 150 en 200 fps, met behulp van twee commerciële tellen kamers met verschillende diepten (10 en 20 µm). De zwarte cirkel vertegenwoordigt de beste beeldfrequentie op voor elke soort. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Sperma subpopulaties structuur van drie generaties van Atlantische zalm: wilde mannetjes (F0), en de eerste twee generaties geproduceerd in gevangenschap (F1 en F2). Na clusteranalyse, vier subpopulaties werden waargenomen: niet-lineaire spermacellen langzaam (lage LIN, STR en VCL; cluster 1; zwart), niet-lineaire spermacellen (lagere STR, hoge VCL cluster 2; donkergrijs) snel, snel lineaire spermacellen (hoge LIN, STR en VCL; cluster 3; tussentijdse grijs) en snelst lineaire spermacellen (hoogste LIN, STR en VCL; cluster 4; lichtgrijs). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende Figuur 1. Verschillende visuele gebieden van de analyse van de beweeglijkheid van sperma van Europese aal gedefinieerd als beste (A) en (B) het slechtste geval cel concentratie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De sperma-analysesoftware die wordt gebruikt in dit protocol is gebruikt door onderzoekers wereldwijd voor verschillende soorten, met inbegrip van vis. Vissen hebben echter enkele specifieke functies die invloed kunnen zijn op de beoordeling van de zaadcellen. Vis spermacellen toonde hoge snelheid in het moment van activering die snel daalt en leidt tot een korte tijd van beweeglijkheid na activering. Bovendien, de temperatuur van reproductie is afhankelijk van de soorten en, in sommige gevallen kan ongeveer 4 ° C2,4,-8,12. Het is dus noodzakelijk om enkele aanpassingen ter verbetering van de efficiëntie van een geautomatiseerd systeem voor fish sperma analyse. Het basisprincipe van de motiliteit-parameter is de overname en de analyse van opeenvolgende beelden van motile spermacellen. De meeste systemen gebruiken standaard framesnelheid (16, 25, 30, 50 of 60 fps) te wijten aan de beperkingen van de hardware en software17,18,19,20,21,22. Sommige studies bleek echter dat een hogere framesnelheid sommige snelheid parameters, zoals VCL, STR toeneemt, BCF15,23,24. Dit is vooral belangrijk wanneer het nodig is te evalueren van de hyperactivering van spermatozoïden en vinden de maximale snelheid van spermatozoïden11,17,18,19, 25. met betrekking tot de temperatuur van de analyse, een koeling plaat voor de optische Microscoop, en een nieuwe technologie om te koelen van de monsters bij constante temperatuur kan ook verbeteren de analyse na verloop van tijd. Het huidige werk biedt een benadering om op te lossen twee van de belangrijkste problemen in verband met de vis sperma motiliteit analyse en de temperatuur gevoeligheid. Ondanks de resultaten gericht op sommige zoetwater soorten, kan deze methode worden gebruikt voor mariene soorten, hoewel het medium van de activering aangepast voor elke soort worden moet.
In de markt zijn er een aantal producten of zelfs verschillende versies van hetzelfde product. Zelfs als de systemen kunnen hetzelfde principe, heeft elk verschillende details tot de onverenigbaarheid van resultaten26,27,28. Bovendien, de evaluatie van de kwaliteit van het sperma van de vis kan nog methodologische en technische beperkingen. De techniek van de activering zaadcellen en het tijdstip van de analyse na activering zijn twee essentiële factoren die sperma kwaliteit evaluatie29,30 beïnvloeden. De tijd tussen de activering van een spermastaaltje en de stabilisatie van het beeld voor video-opnamen moet ongeveer 5 s sinds de eerste seconden (tijdsinterval van 5-20 s) biedt de meest nuttige gegevens2,4. De tijd van sperma-analyse kan worden beperkt als gevolg van condensatie problemen op het glasplaatje. Vis spermacellen blijven echter actief met een krachtige beweging voor minder dan twee minuten2. Op technisch niveau is het noodzakelijk om te weten de "optimale" framerate Detailinformatie waarmee een nauwkeurige reconstructie van de spermacellen trajecten15te verkrijgen. Bij lagere framesnelheid zijn de details van de baan verloren, met name voor snelle en niet-lineaire spermacellen, terwijl bij hogere framesnelheid, de informatie overbodig15,31 wordt. Voor sommige vissoorten, stem op het frame (maximaal 250 fps) zou niet genoeg zijn om de maximale snelheid van spermacellen te vinden voor sommige vissoorten, zoals vlagzalm en zalm. Deze variatie is soort specifieke en moet worden gedefinieerd voor elke soort voor het standaardiseren van het protocol en het verkrijgen van betrouwbare resultaten15,23,24. De diepte van tellen kamer kan beperken het verkeer van de grote flagellum van vis en de spermacellen maximumsnelheid11,32,33niet kon bereiken. Bovendien, de software wellicht enkele beperkingen in de opsporing van de echte spermacellen wanneer er een snijpunt van cellen.
Klassieke beoordeling van de kwaliteit van het sperma is een subjectieve analyse op basis van de schatting van de concentratie en het percentage van de motiliteit, die variabiliteit op de resultaten produceren kan. Echter, een geautomatiseerd systeem biedt snelle, nauwkeurige en kwantitatieve metingen van de parameters van de motiliteit. Deze objectieve analyse geeft van een grote hoeveelheid gegevens en vermindert de variabiliteit van resultaten34,35,,36,,37. De reactie van sperma motiliteit gedrag hangt af van de temperatuur van de analyse en varieert per soort38,39,40. Optimale temperatuur van de sperma-analyse kan een sperma snelheid en duur van de motiliteit vergelijkbaar met de natuurlijke omstandigheden van reproductie38,40. Daarom, sperma analysesoftware met koeling apparaten verbetert de evaluatie van de kwaliteit van het sperma van de vis.
De resultaten van de analyse van de kwaliteit van de zaadcellen kunnen verbeteren van de kennis over vis sperma kenmerken en kwaliteit gebaseerd op sperma subpopulaties, die de toekomst van sperma-evaluatie in alle diersoorten41,42kan worden. Op praktisch niveau, zou deze techniek een indicator van kwalitatief hoogwaardige fokkers en helpt om meer informatie over sperma selectieproces, baanbrekende doses berekening voor kunstmatige inseminatie, sperma concurrentie gebaseerd op snelheid en geleidelijkheid en vruchtbaarheid potentiële. Al deze kennis kan worden toegepast op verschillende onderzoeksgebieden, met inbegrip van de aquacultuur en behoud programma's, die gestimuleerd het belang bij de sperma-opslag van vis en cryopreservatie in de laatste decennia2,13. Toxicologische effecten krijgen speciale belang als gevolg van milieuproblemen, evenals studies ook de ontwikkeling van phylogenetical studies op basis van sperma motiliteit kenmerken43,44.
Dit werk heeft aangetoond hoe het optimaliseren van een automatische software vis sperma motiliteit p.a. de resultaten verbetert. Normalisatie van het protocol moet rekening worden gehouden met de temperatuur van de analyse en de frame rate, die afhankelijk van de soort afwijken kan. Echter, de analyse van de beweeglijkheid van de zaadcellen van de vis heeft twee kritische stappen dat de onderzoeker aandacht moet besteden. Sperma collectie is de eerste kritieke stap die het monster als gevolg van de verontreinigingen door feces, urine en water vernietigen kan (zeewater of zoetwater). Het andere kritieke punt is gekoppeld aan het moment van activering van sperma en het begin van de video-opnamen. Deze stap moet zo spoedig mogelijk worden gedaan om het verzamelen van gegevens wanneer de spermacellen krachtige beweging hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project heeft financiering ontvangen van de associatie van de kosten (voedsel en landbouw kosten actie FA1205: AQUAGAMETE, en de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma onder de Marie Sklodowska-Curie project IMPRESS (GA No 642893). We zouden graag bedanken het wetenschappelijke team van PROiSER, specifiek voor de student Alberto Vendrell Bernabéu, voor zijn actieve deelname in de video-opname van dit project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
- Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
- Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
- Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
- Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
- Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
- Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
- Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
- Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout - the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
- Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis? Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
- Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
- Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
- Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
- Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
- Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
- Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
- Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
- Holt, W. V., O'Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
- Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
- Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
- Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
- Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
- Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
- Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
- David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
- Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
- Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
- Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
- Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
- Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
- Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
- Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
- Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
- Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).
