Summary
ここでは、ペプチドの気管支上皮細胞の移動に及ぼす影響を評価するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、セル移行および創傷閉鎖の速度に定量的なデータの迅速かつ再現性の高い国又できます。
Abstract
この作業の目的は、抗菌ペプチド (アンペア)、細胞の移動を刺激するなどのいくつかの免疫調節分子の能力を評価する新しい方法を提示することです。重要なは、細胞遊走、傷害後の整合性と組織層の正常な機能に再確立する創傷治癒プロセスの間にレート制限イベントです。手動で作られた単層細胞傷に基づいている古典的な分析上のこのメソッドの利点は、特殊シリコン文化の使用は明確に定義された幅 (500 μ m と無細胞の擬似巻きフィールドを作成する 2 つのコンパートメントを提供するを挿入します).さらに、自動画像解析プラットフォーム、ため急速に創傷閉鎖と細胞移動の速度で定量的なデータを得ることが可能です。正確には、気管支上皮細胞の移動に 2 つのカエルの皮アンプの効果が表示されます。さらに、これらの細胞特異的阻害剤での前処理は分子機構などのイベントに関する情報を提供します。
Introduction
動物の創傷治癒過程がけが1後の整合性と組織層の正常な機能に再確立する基本的なプロセスであることを主として知られています。物理・化学的侮辱から防護壁を形成上皮表面 (例えば、呼吸器、皮膚、消化管) の外部環境にさらされているにもかかわらず、傷の形成が発生しやすく、特に後手術または微生物感染症2。例として、嚢胞性線維症 (CF) 患者において日和見細菌菌緑膿菌、によって肺組織の植民地化とそれに伴う呼吸不全3、気道上皮の損傷につながる 4。創傷治癒は、負傷した組織5通常の建築を復元する複雑なホスト修理メカニズムです。上皮形成、血管新生、コラーゲン産生と細胞分化6,7,8 組織の改造現象を包括的な再生期間続いて初期の炎症によって特徴づけられる.上皮の完全性を確保するため、微生物の増殖を制御するため、すべての生きている有機体は抗菌ペプチド (アンペア)9,10を含む防衛分子を生成します。創傷治癒過程シミュレートの in vitro細胞残屑および異なる種類の細胞間の複雑な相互作用の欠乏のために非常に困難です。ただし、ペプチドの生体外で能力を刺激することによって擬似傷の閉鎖を加速する上皮細胞の移行は侵害された上皮を治癒する能力を示す。確かに、細胞遊走は創傷治癒にレート制限イベントと改良された創傷治癒のためのターゲット治療に役立つ細胞の移動に影響を与える要因を勉強します。
ここでは、再現性の高い実験的試金はセル移行体外を評価する特殊シリコン文化挿入に基づいて提供しています。それは、コンフルエントの細胞膜上に 500 μ m ギャップ (擬似傷) の作成に基づいています。無料のセル領域に移行する、新しい細胞間の接触を形成、人工の「負傷者」のフィールドの端にあるセルが開始されます。文化の挿入は、高速治癒促進実験のための新しいツールを表します。500 μ m の壁で区切られた 2 つの貯水池が提供され、12 ウェル プレートの井戸、3 cm 皿プレートにそれら正しく配置ことができます。挿入の各コンパートメントの細胞懸濁液を充填セル挿入の除去は (分離壁と同じ幅) 約 500 μ m のきれいな無細胞のギャップを生む一方、confluence (コンフルエンス) まで各指定地域で成長することができます。試験化合物を添加した適切な細胞培養液を皿に追加できるプレート/ウェル。その後、ギャップの閉鎖は、好ましくは 1 つの画像取り込みビデオ カメラ搭載、倒立顕微鏡下で異なる時間間隔で視覚化できます。最後に、web ベースの自動画像解析プログラムによってセル面積の変化の測定には、創傷閉鎖と細胞移動の速度の定量化ができます。全体的にみて、この方法は、スクラッチは滅菌した針でコンフルエントの細胞膜を切開によってなされる手動でまたはピペット チップ11クラシックのアッセイに関して一歩前進です。確かに、最後の手順は、皿のプラスチック底を破壊できるプレート/まあ、表面コーティング、しわを作成します。さらに、高針の先端に研究者によって適用される圧力にもよりますので、「負傷者」の領域には、ギャップの全体の長さに沿って明確に定義された幅がありません。さらに、剥がれ細胞が、ゼロの端の生活および死んだ細胞の塊を形成できます。また、「負傷者」の領域に生きている細胞の広がりは、12非再現性のある結果を生成する細胞移動の速度と干渉することができます。
さらに、スクラッチのイメージ解析プラットフォームのおかげでユーザー急速に受信できる (数分) 追加のソフトウェアを取得する必要なく選択したセルの回遊行動の定量的なデータ。このプラットフォームは、低 (~ 5 X) の位相コントラスト顕微鏡画像、中規模 (~ 10 X)、および (~ 20 倍) の高倍率を分析が可能です。セルの速度だけでなく、細胞に覆われたエリアとスクラッチ領域の割合を示すサマリー ファイルを生成する (*.jpg、*.jpeg、*.jp2, *.png, *.gif, *.tiff 形式) で画像の zip ファイルをアップロードした後、分析は自動的に行なわれます移行は、異なる時間間隔で。
カエル皮膚のアンプ誘導体、すなわちEsc(1-21) とそのジアステレオマー Esc(1-21)-1 c13、および機能 CF 膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR)14,15を表現する気管支細胞ラインを使用して、この作業でペプチドによる細胞移行 (無処理) サンプルとの比較の例を示します。気道上皮、CFTR が肺機能を維持するために重要な役割を果たすことに注意してください、修理16を傷します。さらに、による上皮成長因子受容体 (EGFR)、前述のペプチドによる気管支の細胞の移動を含む EGFR12の活性化の証拠の選択的阻害剤 (例えばAG1478)17 18の報告します。
この手順の目標は文化そのようなシリコンを挿入の使用状況が正確に付着性のセル (例えば、気管支上皮細胞) と分子の移行を判断する迅速かつ簡単にアクセスできるアッセイをどのように表現するかを要約すると、このようなイベントを制御するメカニズムです。
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Protocol
1. セル準備
- 10% 牛胎児血清 (FBS)、抗生物質 (ペニシリンとストレプトマイシンの 0.1 mg/mL) およびピューロマイシン プラス 2.5 x 106 10 mL の最小必須培地 (MEM) 2 mM グルタミン (MEMg) を添加した細胞を播く (0.5 μ G/ml の選択と維持のため、行のセル) T75 フラスコ。2 日間の 37 ° C、5% CO2でフラスコを孵化させなさい。実験を始める前に、倒立顕微鏡下で細胞の合流点を確認します。
注: 実験用セルは、レンチウイルスベクターをピューロマイシン耐性で導入した不死化ひと気管支上皮細胞です。安定機能 CFTR14,15を表します。 - セルの合流は 90-100% に達したら、フラスコから培地を吸引し、生物学的安全キャビネット クラス II の下で廃棄ボトルにそれを破棄します。カルシウムとマグネシウム (CMF PBS) なし生理食塩水リン酸緩衝の ml の 6 セルを洗います。優しく、フラスコを手動でロックし、CMF PBS を破棄します。
注: ピペットで細胞膜を触れないように気をつけてください。 - CMF PBS の 10 mL を追加し、10 分間の 37 ° C および 5% の CO2でフラスコを孵化させなさい。
- CMF PBS を吸引し、それを破棄します。トリプシン/EDTA の 2 mL をフラスコに追加します。
- 完全に細胞が顕微鏡の下で目に見えて戸建まで 10 分の CO2を 37 ° C、5% でフラスコをインキュベート細胞をコートしソリューションを許可するフラスコみ合います。
注: インキュベーション時間の終わりに、セルが丸いとプラスチック表面にもアタッチされていないに表示されます。まあ戸ないセルは、手動撹拌が必要かもしれません。 - MEMg プラス 10% の 10 mL を加えてトリプシンを不活化し、フラスコの底を洗浄することにより細胞を収集する政府短期証券。50 mL のコニカル チューブにボリュームを転送します。
- 80 x gで 5 分間チューブを遠心します。
- 上清を吸引し、再 MEMg プラス 10% の 6 mL のセルを中断政府短期証券。ピペット繰り返し任意の塊を破る。
- マイクロ ピペットで細胞を懸濁液の 10 μ L を取り出して、以前 Burker またはノイバウアー室の上に置くカバー ガラスの下でボリュームを挿入します。
- セル数をカウントします。
2. 細胞文化の播種を挿入します。
- 12 ウェル プレートの各ウェル、滅菌ピンセット (図 1) で文化挿入を転送します。板の表面にそれらを修正するために挿入のエッジに沿って押すようにピンセットを使用します。
注: 挿入により接着性粘着性の下側があります。
図 1: 12 ウェル プレートのウェルに正しく入れて、シリコーン文化挿入の略図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- 正しく MEMg プラス 10% の細胞懸濁液を希釈 FBS。細胞懸濁液 (約 3.5x104セル/室) の 70 μ L で、挿入の各区画を入力します。
注: 各区画に適用されるセルの密度は、細胞の種類によって異なります。24 h 内で合流の細胞密度を使用することをお勧めします。 - 顕微鏡で細胞挿入コンパートメントから漏れていないと 37 ° C、5% CO2で 24 時間 12 ウェル プレートを孵化させなさいことを確認します。
3. 擬似創傷治癒アッセイ
- インキュベーション後、コンフルエントの細胞が形成されていることを確認を倒立顕微鏡下で細胞を可視化します。
- 再 1 ml MEMg のテスト混合物 (例えばアンプ) を中断します。
注: 準備新鮮なアンプ希釈原液-20 ° C で保存から始まって - 滅菌ピンセットでチップを慎重に取り外します。細胞膜を壊さないように注意してください。転送吸収紙の上に挿入します。
注: 同じ挿入を再利用するには、滅菌に少なくとも 3 時間の 70% エタノールで。その後にそれらを捨てることをお勧めします。 - 非付着性のセルを削除するには、マイクロ ピペットを使用してあたり MEMg の 1 mL を追加します。プレートを閉じ、そっとそれをロックします。
注: は、混乱を避けるために細胞膜上に直接メディアを追加しないでください。 - 培地を吸引し、ウェルあたり MEMg の 1 mL と置き換えます。プレートを閉じ、ビデオ カメラを装備して、4 倍の倍率で倒立顕微鏡下で (挿入によって作成された) 携帯無料ギャップを可視化します。画像時 0 (T0) を取得し、.jpg 形式で保存します。
- 井戸からメディアを取り出して、1 mL の PBS で洗浄し、それを破棄します。
- 井戸に (3.2 の時点で準備) テスト混合物を追加します。無処理試料 MEMg の 1 mL を追加します。37 ° C と 5% の CO2でプレートを孵化させなさい。
- 15、20、および 24 時間治療後、4 倍の倍率の顕微鏡下で細胞の移動を観察し、画像を取得します。
注: この手順では、T0 は同じエリアの画像をキャプチャする試み。イメージがキャプチャされます時間間隔は、セルの移動速度によって決まります。 - いくつかの選択的阻害薬の効果を研究、すなわちAG1478、細胞移動への挿入を削除する前に各挿入のコンパートメントから媒体を吸引します。
- 新鮮な MEMg と各コンパートメントを洗浄し、AG1478 を添加した MEMg の 70 μ L でそれを埋めます。
- 37 ° C および 5% CO2で潜伏の 30 分後 3.3 ポイントから説明するように進みます。
注意: 洗浄のステップおよび細胞特異的阻害剤単分子膜の前処理中に挿入を削除しないように注意します。
4. 画像解析
- 実験が完了したら、さまざまな実験的グループの最も代表的なサンプルの画像を選択し、T0、T15、T20、T24 h で 1 つの画像を含む zip ファイルを作成します。
注: 単一の画像はすべてサンプルを選択した時間間隔で撮影されます。少なくとも 3 回を繰り返し、それぞれの実験の実行をトリプリケートします。最後に、すべての実験的グループ、("a"、"b"、"c"、等、それぞれの独立した実験から派生する) 3 つの画像の最小の各時点で分析されます。 - 自動的に電子メールで選択した時点で (パーセンテージ) 細胞に覆われたとスクラッチ領域の実験的データを含むスプレッドシートの概要ファイルを提供する画像解析ソフトに zip ファイルをアップロードします。
注: リーディング エッジとギャップ領域の認識は (目的で画像の明るさが大幅に変更された点を識別する) エッジ検出法に基づいて。 - データを保存し、それらを収集します。時間 0 で平均値に対するすべてのデータを正規化します。各時点で相対的標準誤差 (SEM) すべて複製の正規化されたデータの平均値を計算します。双方向分散分析 (ANOVA) を使用して、適切な統計解析ソフトウェアの統計分析を実行します。ペプチド投与群と異なる時間間隔で制御グループの違いと見なされる統計的に重要なpの < 0.05。
- グラフに、選択した時間間隔すべてサンプル グループ対の細胞で覆われた領域のパーセントを示すヒストグラムとして得られたデータをプロットします。
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Representative Results
このプロトコルは創傷治癒機能 CFTR を表現する気管支上皮細胞に誘発される細胞の移行活動の面で Esc(1-21) と Esc(1-21)-1 c の効果を決定するために使用されました。このアッセイで文化挿入された 12 ウェル プレートの井戸に置かれ、各コンパートメントは 35,000 MEMg 10% を添加した細胞が播種された FBS。セルその後 24 時間以内の完全な合流点に達した、500 μ m ギャップが生成された、それぞれはよく異なる濃度でペプチドを含む MEMg と満たされました。実験を 4 回繰り返した。図 2で示したように、単層の細胞で生成される擬似巻きフィールドのほぼ完全な閉鎖はそれぞれ最適な濃度 1 μ M と 10 μ M の Esc(1-21)-1 c と Esc(1-21) のための ~ 20 h 以内 2 ペブチドによって誘起されました。これは Esc(1-21)-1 c が気管支細胞における擬似傷の再上皮化を促進する上でより効率的なことを示します。
図 2: Esculentin 1 a の効果は、気道上皮細胞の単層で作成した擬似傷の閉鎖をアンプを派生します。シリコーン文化挿入の各区画に細胞を播種し、その除去後細胞細胞遊走 15、20、および 24 h の証拠をペプチドの付加の後で撮影されました。ポイントを計算するたびにセル面積の割合は対照細胞 (Ctrl) と比較してし、y 軸に報告されます。すべてのデータは、4 つの独立した実験 ± SEM は、手段し、以前研究14から取得されます。制御と扱われたサンプル テストの統計的有意性のレベルが: *p< 0.05 * *p< 0.01 * * *p< 0.001 と * * *p< 0.0001。コントロールと比較して、1 μ M の濃度で各ペプチドと細胞の治療後 (T0) 前に、代表の結果、20 h を示す顕微鏡写真も報告されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
EGFR の活性化が esc キーによる創傷閉鎖に役割を果たしたかどうかを確認するため気管支の細胞は AG1478、挿入削除する前に、egfr 遺伝子の選択的阻害剤の 5 μ M と 30 分のため虫だった。ペプチド誘導結果見つけたときセルいない前処理は、阻害剤事前ペプチド管理 (図 3)、これは指摘すると比較してすべての時間間隔でセル面積の割合を有意に減少したので細胞の移動には、EGFR の活性化が含まれます。しかし、さらに研究が必要 (例えば、直接 EGFR の活性化またはトランス活性化 EGFR リガンドの膜を切断する示されている分解酵素を介した Esc ペプチドによってトリガーされた分子のイベントを明らかにする19)。
図 3: AG1478 阻害剤の気管支上皮細胞のペプチドによる移行に及ぼす影響します。挿入削除する前にセルが 5 で μ M AG1478 30 分、その後同じ濃度で単独でのペプチドと扱われます。すべてのデータは、4 つの独立した実験 ± SEM から手段し、私たちの以前の仕事14から取得されます。指定されたグループのサンプルの間のテストの統計的有意性のレベルが: *p< 0.05;p< 0.0001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
細胞遊走は、創傷治癒、萌芽期の開発、がんの転移など多くの生理学的および病理学的イベントに欠かせないプロセスです。細胞移行生体外で勉強する基本的な手順を含む: (iii) 傷までのさまざまな時間間隔での画像キャプチャ閉鎖に達する (i) 細胞膜、(ii) 細胞の合流の層で擬似傷の生産の作成、および (iv) 選択したセルの移行速度を定量化するために, 動画像の解析。
我々 の結果は、客観的かつセル移行特性の定量的評価法の信頼性の高い実験的文化挿入のアプリケーションである示されています。このアッセイは、基本的な実験装置とその研究グループによって実行できます。ただし、プロトコルのいくつかの重要なステップは再現性を達成するために考慮する必要があります。たとえば、パイロット実験、細胞のすべての個々 のサンプルの合流の同じ範囲を得るために各区画に種子への正確な数によって定義することが重要です。この目的に同期周期を持つ細胞と播種前に、の細胞塊を避けることが重要です。凝集を最小限にする可能な方法は、注射針で細胞を懸濁液の穏やかな通路です。しかし、サンプル サイズを増やすことによりセル間でのバラツキを減らすこと。
さらに、すべてのサンプルの明確に定義された幅のギャップの作成は重要です。この目的のためシリコンを挿入する必要がありますない再利用 2 倍以上。さらに、シリコーンの分離壁の下の細胞の成長を避けるべきであります。このトラブルを防ぐためには、挿入、上に柔らかい圧力が一度皿に置かれたプレート/まあ、プラスチック チップの接着性を高める滅菌ピンセットによる手動で適用することができます。挿入の慎重な除去はまた細胞自由表面の細胞膜の破壊の拡大を妨げます。
ただし、一度挿入は正しく剥がれ、擬似の傷は完全に生産、いくつかの細胞株は場合は特に、彼らはメディアの血清や成長因子やアミノ酸、ビタミンなどのサプリメントなし孵化させるプラスチックの表面からデタッチできます。細胞培養液中にこれらの要因がない場合は、彼らはテスト混合物の創傷治癒促進活動を妨げることができるという事実によって決定できます。この問題を回避するには、培地組成の合理的な選択をお勧めします。
この治癒促進プロシージャを設定する前に考慮すべきもう一つの重要なステップは、異なる種類の細胞間に存在するさまざまな移行速度です。またこの場合、予備実験を目的の画像がキャプチャされるある正しい時間間隔を決定予定必要。このメソッドに関連付けられている 1 つの制限はそのような文化の挿入懸濁液 (例えば、多形核白血球) で育つ細胞の移動を研究するために雇うことができないことであることを考慮する必要はも。
創傷治癒の試金実行にもかかわらずシリコーン文化と挿入は古典的なスクラッチ試験より高い、細胞移行アクティビティにデータの迅速かつ正確な複製を許可します。重要なは、システムがセットアップ、したら、創傷治癒活動刺激による内因性あるいは外因性要因の分子メカニズムに知識を拡大する使用できます。この目的のためには擬似の傷を作成する前に特定の分子 (例えば、阻害剤) と細胞膜の前処理を行なえます。例は、(i) 細胞増殖ブロッカー マイトマイシン C を確認する細胞分裂率20または (ii) メタロプロテアーゼ阻害剤によるアンペアによって誘起される「負傷者」の閉鎖の影響を受けているかどうかを探索すると細胞の前処理によって与えられる、EGFR を介したシグナル伝達経路の12の活性化におけるメタロプロテアーゼの貢献。
重要なは、創傷閉鎖処理中にサンプルが修正され、骨格と核検出のための適切な汚れと扱われる (ファロイジンと DAPI、それぞれ) 細胞の形態学的側面の変化を可視化する (例えば、前端ケラトサイトの形成) 蛍光/共焦点顕微鏡による。また、蛍光標識アンプ細胞の治療可能性がありますその細胞分布 (膜または細胞内・核内局在) 別の回でセルの渡り鳥の活動の初め以来の可視化を有効にします。さらに、これらのインサートは後適した transwell 上それらを配置を持つ偏光と差別化された上皮細胞 (例えば気液界面で維持される第一次気管支細胞), 創傷治癒活動を分析するため悪用可能性があります。透過性をサポートします。
結論としては、この方法は付着動物細胞/上皮組織のさまざまな種類の渡り鳥の機能だけでなく、最も有望な創傷治癒の選択の理解を改善する大きな可能性プロモーターや阻害剤、短時間かつ高精度。
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Disclosures
著者がある何も開示するには
Acknowledgments
この作品は、ローマ ・ ラ ・ サピエンツァ大学とイタリアの嚢胞性線維症研究財団 (プロジェクト FFC #11/2014 年シエナ、ソンドリオ Valchiavenna、Cerea Il ソリーゾ ・ ディ ・ ジェニー、パヴィア FFC 代表団によって採用) からの資金によって支えられました。この仕事の一部はまたによって FILAS グラント Prot. FILAS-RU-2014-1020 をサポートされていました。
気管支の上皮細胞を提供するため博士ロレッタ フェレーラ (U.O.C. Genetica ・ メディカ、Istituto Giannina ガスリーニ、ジェノバ、イタリア) に感謝しております。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
References
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