Summary
Her presenterer vi en protokoll for å evaluere effekten av peptider på overføringen av bronkial epitelceller. Denne metoden gir rask og svært reproduserbar obtainment av kvantitative data på hastigheten av celle migrasjon og såret nedleggelse.
Abstract
Formålet med dette arbeidet er å vise en roman metode for å vurdere muligheten for noen immunmodulerende molekyler, som antimikrobielle peptider (ampere), å stimulere celle migrasjon. Viktigere, er celle migrasjon en hastighetsbegrensning hendelse under sårhelende prosessen å reetablere integritet og normal funksjon av vev lag etter skader. Fordelen med denne metoden over klassisk analysen, som er basert på en manuelt laget ripe i en celle monolayer, er bruk av spesielle silikon kultur setter gir to avdelinger for å opprette en celle-fri pseudo såret felt med en godt definert bredde (500 μm ). I tillegg, på grunn av en automatiserte image analyse plattform er det mulig å raskt få kvantitative data på hastigheten på såret nedleggelse og celle migrasjon. Mer presist, vises effekten av to frosk-hud forsterkere på overføringen av bronkial epitelceller. Videre, forbehandling av disse cellene med bestemte hemmere vil gi informasjon om molekylære mekanismer underliggende slike hendelser.
Introduction
Det er hovedsakelig kjent at sårheling i dyr er en grunnleggende prosess å reetablere integritet og normal funksjon av vev lag etter skade1. Til tross for epithelial overflater utsatt for eksterne miljøet (f.eks, hud, luftveier, og mage traktater) danner en beskyttende barriere fra fysiske og kjemiske fornærmelser, dannelsen av sår oppstår lett, spesielt etter kirurgi eller mikrobielle infeksjoner2. Eksempel fører kolonisering av lungevev av opportunistiske bakteriell patogen Pseudomonas aeruginosa, spesielt i cystisk fibrose (CF) lider, til skade av luftveiene epitel med påfølgende respirasjonssvikt3, 4. Sårheling er en kompleks vert reparasjon mekanisme for å gjenopprette en skadet vev5normal arkitektur. Det er preget av første betennelse, etterfulgt av en fornyelse perioden omfatter epithelialization, angiogenese og vev remodeling med kollagen produksjon og celle differensiering6,7,8 . Sikre epithelial integritet og kontrollere mikrobiell spredning, produsere alle levende organismer forsvar molekyler, inkludert antimikrobielle peptider (ampere)9,10. Såret helbredelsesprosessen er svært vanskelig å simulere i vitro skyldes mangel på celle rusk og komplekse interaksjoner mellom ulike celletyper. Men i vitro evne til et peptid å akselerere nedleggelsen av en pseudo såret ved å stimulere migrering av epitelceller er et tegn på sin evne til å helbrede en kompromittert epitel. Faktisk celle migrasjon er en hastighetsbegrensning hendelse i sårheling, og studere faktorer som kan påvirke celle migrasjon vil bidra til å mål terapi for forbedret sårtilheling.
Her, gis en svært reproduserbar eksperimentelle analysen basert på spesielle silikon kultur setter å vurdere celle migrasjon i vitro. Den er basert på etablering av et 500 μm gap (pseudo såret) på en confluent celle monolayer. Cellene på kanten av kunstige "såret" feltet starter overføring til celle-fri området, forming nye celle-celle kontakter. Sett inn kultur representerer et nytt verktøy for rask sårheling eksperimenter. To reservoarer med en 500 μm vegg tilbys, og de kan være riktig plassert i en 3 cm rett plate eller av en 12-vel plate. Fylle hvert kammer av sette med en celle suspensjon kan cellene vokse i hver angitte området til samløpet, mens fjerning av sette vil skape en ren celle-fri avstand på ca 500 μm (samme bredde som separasjon veggen). Et riktig celle kultur medium med en test forbindelse kan deretter legges til parabolen plate/godt. Etterpå kan gapet nedleggelsen visualiseres i forskjellige tidsintervaller under en invertert mikroskop, fortrinnsvis en utstyrt med et videokamera for bildeopptak. Til slutt, måling av endringer i celle-dekket området av webbaserte automatiserte image analyseprogrammet tillater kvantifisering av hastigheten på såret nedleggelse og celle migrasjon. Total, denne metoden er et skritt fremover med hensyn til klassisk analysen, der en ripe gjøres manuelt ved incising confluent celle monolayers med en steril nål eller en pipette tips11. Faktisk den siste fremgangsmåten kan ødelegge plast bunnen av parabolen plate/godt og overflatebehandlingen, opprette rynker. I tillegg har "såret" området ikke en godt definert bredde langs hele lengden av gapet, som dette er svært avhengig av stort trykk som brukes av forskere til pinne-spissen. Videre kan forskyves cellene danne klumper av levende og døde celler på kantene av scratch; Videre kan spredning av levende celler i området "såret" påvirke hastigheten av celle migrasjon, genererer ikke reproduserbare resultater12.
I tillegg takket være en ripe bildet analyse plattform, kan brukere raskt motta (i minutter) kvantitative data på hos de merkede cellene uten nødvendigheten av å skaffe ekstra programvare. Denne plattformen er dugelig å analysere fase kontrast mikroskopi bilder av lav (~ 5 X), medium (~ 10 X) og høy (~ 20 X) forstørrelse. Etter å ha lastet en zip-fil med bilder (i *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff format) utføres analyse automatisk for å generere en Sammendrag-fil som viser prosentandelen av både celle-dekket områder og bunnen og hastigheten på cellen migrasjon, med forskjellige tidsintervaller.
I dette arbeidet, ved hjelp av en frosk-hud AMP-avledet dvs Esc(1-21) og dens diastereomer Esc(1-21) - 1 c13og en bronkial cellen linje uttrykke funksjonelle CF transmembrane konduktans regulator (CFTR)14,15, et eksempel på peptid-indusert celle migrasjon med ubehandlet (kontroll) eksempler er gitt. Merk at airway epitel og CFTR spille en avgjørende rolle i å opprettholde lungefunksjonen og såret reparasjon16. Videre gjennom selektiv hemmere (f.eks AG1478)17 av epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), bevis på at overføringen av bronkial celler forårsaket av de nevnte peptidene innebærer aktivering av EGFR12, 18 er rapportert.
Oppsummert er er målet med denne prosedyren å vise hvordan bruken av slike silikon kultur setter representerer en rask og lett tilgjengelig analysen å nøyaktig fastslå migrering av tilhenger celler (f.eks bronkial epitelceller) og den molekylære mekanismer som styrer slike hendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle forberedelse
- Frø 2.5x106 celler i 10 mL av Minimum viktig Medium (MEM) med 2 mM glutamin (MEMg), pluss 10% fosterets bovin serum (FBS), antibiotika (0,1 mg/mL av penicillin og streptomycin) og puromycin (0,5 µg/mL for valg og vedlikehold av den celle linje) i en MT75 bolle. Inkuber kolbe på 37 ° C og 5% CO2 i 2 dager. Før du starter eksperimentet, sjekk der celler under en invertert mikroskop.
Merk: Cellene som brukes for eksperimentet er udødeliggjort menneskelige bronkial epitelceller transduced med en lentiviral vektor overdragelse motstand mot puromycin. De uttrykke stabilt en funksjonell CFTR14,15. - Når cellene samløpet har nådd 90-100%, Sug opp mediet kolbe og kaste den i en avfall flaske under en biologiske sikkerhetskabinett CAB klasse II. Vask cellene med 6 mL av fosfat bufret saltvann uten kalsium og magnesium (CMF-PBS). Forsiktig rock kolbe manuelt og kast CMF-PBS.
Merk: Være forsiktig med å ta den cellen monolayer med pipette. - Tilsett 10 mL CMF-PBS og ruge kolbe på 37 ° C og 5% CO2 i 10 min.
- Sug opp CMF-PBS og kaste den. Deretter legge til 2 mL trypsin/EDTA kolbe.
- Forsiktig rock kolbe, slik at løsningen å coat cellene, og ruge kolbe på 37 ° C og 5% CO2 i 10 min før cellene er synlig frittliggende under et mikroskop.
Merk: På slutten av inkubasjon tiden, cellene skal vises avrundet og ikke festet til plast overflaten. Hvis cellene ikke godt frittliggende, kan manuell agitasjon være nødvendig. - Legge til 10 mL MEMg pluss 10% FBS å deaktivere trypsin og samle celler ved å vaske bunnen av flasken. Overfør volumet til en konisk 50 mL tube.
- Sentrifuge røret i 5 min på 80 x g.
- Sug opp nedbryting og å suspendere cellene i 6 mL av MEMg pluss 10% FBS. Pipetter gjentatte ganger for å bryte opp noen klumper.
- Ta ut 10 µL av cellen hjuloppheng med brønnene og injisere volumet under cover glasset tidligere satt over en Burker eller Neubauer kammer.
- Beregne cellen.
2. celle Seeding i kultur setter inn
- I hver brønn av en 12-vel plate, overføre kultur innsatsen med sterilt pinsett (figur 1). Bruke pinsett trykke mørkegrønt og setter inn for å fikse dem på overflaten av platen.
Merk: Setter inn har en klissete undersiden som gir vedheft.
Figur 1 : Skjematisk fremstilling av silikon kultur skivene, riktig inn brønner av en 12-vel plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Riktig fortynne celle suspensjon i MEMg pluss 10% FBS. Fyll hver avdeling av sette med 70 µL av cellen suspensjon (om 3.5x104 celler/kammer).
Merk: Tettheten av celler brukt i hvert kammer, avhenger av typen celler. Det anbefales å bruke en celle tetthet som fører til fullføre samløpet innen 24 timer. - Under mikroskopet, kontroller at cellene ikke lekker fra sett inn seksjonene og ruge platen 12-og 24 h 37 ° C og 5% CO2.
3. pseudo såret helbredende analysen
- Etter inkubasjon visualisere cellene under mikroskopet inverterte bekrefte at confluent celle monolayers er dannet.
- Nytt avbryte testen forbindelser (f.eks ampere) 1 mL av MEMg.
Merk: Forberede frisk forsterkere fortynninger fra lager løsningen lagret på 20 ° C. - Fjern skivene av sterile pinsett. Vær forsiktig med å bryte celle monolayers. Overføre skivene på absorberende papir.
Merk: Hvis du vil bruke samme skivene, sperre i 70% etanol minst 3 h. Det anbefales å kaste dem vekk etterpå. - For å fjerne ikke-tilhenger celler, Legg 1 mL av MEMg per godt med brønnene. Lukk platen og rist den forsiktig.
Merk: Ikke Legg medium direkte på cellen monolayers å unngå deres avbrudd. - Sug opp mediet og erstatte den med 1 mL av MEMg per brønn. Lukk platen og visualisere celle-fri hullene (laget av skivene) under invertert mikroskopet på 4 X forstørrelse, utstyrt med et videokamera. Hente bilder ved tidspunkt null (T0) og lagre dem i en jpg-format.
- Fjerne mediet fra brønnene, vaske dem med 1 mL av PBS og kaste den.
- Legge til test forbindelser (forberedt på punkt 3.2) i brønnene. For ubehandlet kontroll prøver, Legg 1 mL av MEMg. Inkuber platen på 37 ° C og 5% CO2.
- Etter 15, 20 og 24 h behandling, observere celle migrasjon under mikroskopet på 4 X forstørrelse og hente bilder.
Merk: I dette trinnet, prøv å ta bilder i samme områder som for T0. Valg av tidsintervaller der bildene er tatt avhenger av celle migrasjon hastigheten. - For å studere effekten av noen selektiv hemmere, i.e. AG1478, på celle migrasjon, Sug opp mediet hvert sett inn skuffen før du fjerner setter inn.
- Vask hver seksjon med ferske MEMg og fylle den med 70 µL av MEMg med AG1478.
- Etter 30 min med inkubering på 37 ° C og 5% CO2, kan du fortsette som beskrevet fra punkt 3.3.
Merk: Under vask trinn og forbehandling av celle monolayers med de bestemte hemmere, være forsiktig ikke for å fjerne skivene.
4. bildeanalyser
- Ved ferdigstillelse av eksperimentet, Velg bilder av de mest representative eksemplene på de ulike eksperimentelle gruppene, og opprette en zip arkiv inneholder enkeltbilder ved T0, T15, T20 og T24 t.
Merk: Enkelte bilder er tatt på valgte tidsintervallene for alle prøvene. Kjør triplicates for hver eksperimentet, som gjentas minst tre ganger. På slutten, for alle eksperimentelle grupper, minimum 3 bilder ("a", "b", "c", etc., avledet fra hver uavhengige eksperimentet) på hvert tidspunkt er analysert. - Laste opp zip-filen til bildet analyseprogramvare som gir automatisk via e-post en oppsummering regnearkfil som inneholder eksperimentelle data av celle-dekket og bunnen områder (i prosent) på valgte points.
Merk: Anerkjennelse av ledende og gapet området er hovedsakelig basert på kanten gjenkjennings-metoden (rettet mot identifisere punkter hvor bildelysstyrke kraftig endres). - Lagre dataene og samle dem. Normalisere alle data vedrørende middelverdien ved tidspunkt null. Beregne gjennomsnittsverdien av normalisert data for alle replikater ved hvert punkt og relativ standardfeilen (SEM). Ved hjelp av toveis variansanalyse (ANOVA), kan du utføre statistisk analyse med en skikkelig statistikk programvare. Forskjeller mellom peptid-behandlet og kontroll grupper på ulike tidsintervaller anses å være statistisk significant for en p< 0,05.
- Tegne innhentet data inn i et diagram som et histogram, som viser prosentandelen av celle-dekket område av alle prøve grupper versus valgte tidsintervallene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen ble brukt til å bestemme sårheling effekten av Esc(1-21) og Esc(1-21) - 1 c i form av celle migrasjon aktivitet indusert på bronkial epitelceller uttrykke den funksjonelle CFTR. I denne analysen, kultur setter ble plassert i brønner av en 12-vel plate, og hvert kammer var sådd med 35 000 celler i MEMg med 10% FBS. Cellene nådd komplett samløpet innen 24 h. etterpå, en 500 μm gap ble generert og hver godt var fylt med MEMg som inneholder peptid i ulike konsentrasjoner. Forsøket ble gjentatt fire ganger. Som vist i figur 2, ble nesten komplett nedleggelsen av pseudo såret feltet produsert i celle monolayer indusert ved to peptidene innen ~ 20 h, på optimal konsentrasjoner av 1 μM og 10 μM for Esc(1-21) - 1 c og Esc(1-21), henholdsvis. Dette indikerer at Esc(1-21) - 1 c er mer effektiv i å fremme ny epithelialization av et pseudo sår i bronkial celler.
Figur 2 : Effekten av esculentin-1a avledet forsterkere på nedleggelsen av en pseudo såret opprettet i en monolayer av bronkial epitelceller. Celler var frø inne hver avdeling av silikon kultur sette og etter fjerning, celler ble fotografert for bevis av celle migrasjon 15, 20 og 24 timer etter at peptider. Prosentandelen av celle-dekket området hver gang punkt ble beregnet sammenlignet med ubehandlet kontroll cellene (Ctrl) og rapporteres på y-aksen. Alle data er midler fra fire uavhengige eksperimenter ± SEM, og er Hentet fra en tidligere studie14. Statistisk betydning for tester mellom kontrollen og behandlet eksempler er: *p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,001, og ***p< 0,0001. Micrographs viser representant resultater før (T0) og 20 h etter behandling av celler med hver peptid på konsentrasjonen av 1 μM, i forhold til kontrollen, rapporteres også. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Du kan kontrollere om aktivering av EGFR spilte en rolle i Esc-indusert såret nedleggelsen, ble bronkial celler preincubated i 30 min med 5 μM av AG1478, en selektiv inhibitor av EGFR, før sett inn fjerning. Siden prosentandelen av celle-dekket området ble betydelig redusert i alle tidsintervaller sammenlignet resultatene når cellene var ikke forbehandlet med hemmer tidligere peptid administrasjonen (Figur 3), dette påpeker at peptid-indusert celle migrasjon innebærer aktivering av EGFR. Men vil videre studier være nødvendig å avklare de molekylære hendelsene som utløses av Esc-peptider (f.eks direkte EGFR aktivisering eller trans-aktivisering formidlet av metalloproteases, som har vist seg å holde seg membran-forankret EGFR ligander 19).
Figur 3 : Effekten av AG1478 hemmer på peptid-indusert migrering av bronkial epitelceller. Før sett inn fjerning, celler var pre inkubert med 5 μM AG1478 i 30 min og deretter behandlet med peptid alene på samme konsentrasjonen. Alle data er midler fra fire uavhengige eksperimenter ± SEM og er tatt fra våre tidligere arbeidet14. Statistisk betydning for tester mellom de angitte gruppe prøvene er: *p< 0,05; p< 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Celle migrasjon er en viktig prosess i mange fysiologiske og patologiske arrangementer inkludert sårheling, embryonale utvikling og kreft metastasering. Den grunnleggende prosedyren å studere celle migrasjon i vitro innebærer: (i) etableringen av en celle monolayer, (ii) produksjon av et pseudo sår i confluent laget av celler, (iii) erobringen av bilder på ulike tidsintervaller til såret nedleggelse er nådd , og (iv) analyse av bildesekvens for å kvantifisere overføringshastighet de valgte cellene.
Resultatene har vist at anvendelsen av kultur setter inn er en objektiv og pålitelig eksperimentelle teknikk for kvantitativ vurdering av celle migrasjon egenskaper. Denne analysen kan utføres av en forskningsgruppe med grunnleggende laboratorieutstyr. Men anses noen avgjørende skritt av protokollen å oppnå reproduserbarhet. For eksempel er det viktig å definere, av piloten eksperimenter, nøyaktig antall celler å frø i hver avdeling for å få den samme grad av samløpet i alle personlige prøver. Til dette målet er har celler med en synkronisert syklus fase og unngå celle klumper før såing avgjørende. En mulig måte å minimere klumper er en mild passasjen av cellen suspensjon gjennom en sprøyte nål. Imidlertid vil øke størrelsen på prøver vesentlig bidra til redusere variasjon mellom cellene.
I tillegg er etableringen av et hull med en godt definert bredde i alle prøvene avgjørende. For dette formålet, bør silikon setter ikke brukes på nytt mer enn to ganger. Videre bør veksten av celler under silikon separasjon veggen unngås. For å unngå dette problemer, mykt Trykk på ins, når plassert i fatet plate/Vel, gjeldt manuelt ved hjelp av sterile pinsetter å øke vedheft av sette plast. Forsiktig fjerning av sette vil også hemme utvidelse av celle-fri overflaten med avbrudd i celle monolayer.
Men når innsatsen er riktig forskyves og et pseudo sår produseres perfekt, kan noen linjer løsne fra plast overflaten, spesielt hvis de er ruges i media uten serum- eller kosttilskudd som vitaminer, aminosyrer og vekstfaktorer. Fravær av disse faktorene i en celle kultur medium kan være diktert av det faktum at de kan forstyrre sårhelende fremme aktiviteten til test forbindelser. For å omgå dette problemet, anbefales rasjonelt valg av kultur medium komposisjon.
En annen avgjørende skritt å vurdere før du setter opp denne sårheling prosedyren er forskjellige migrasjon hastigheten som finnes blant forskjellige celletyper. Også i dette tilfellet må foreløpige eksperimenter planlegges å bestemme riktig tidsintervallene som bilder har tatt til fange. Det er også nødvendig å vurdere at en begrensning knyttet til denne metoden er at slike kultur setter ikke kan ansettes for å studere migrering av celler som vokser i suspensjon (f.eks polymorfonukleære leukocytter).
Til tross for sårhelende analyser utført med silikon kultur setter er dyrere enn klassisk scratch analysen, de tillater en rask og nøyaktig gjengivelse av data på celle migrasjon aktivitet. Viktigere, når systemet er satt opp, kan det brukes til å utvide kunnskap på molekylære mekanismen underliggende sårheling aktivitet stimulert av endogene eller ytre faktorer. Dette kan forbehandling av celle monolayers med bestemte molekyler (f.eks hemmere) utføres før du oppretter pseudo såret. Et eksempel er gitt av forbehandling av celler med (i) celle spredning blokkering mitomycin C å utforske om nedleggelsen av "såret" feltet av forsterkere påvirkes av celledeling rate20 eller (ii) metalloprotease hemmere bekrefte den bidrag av metalloproteases i aktivering av EGFR-mediert signalnettverk veien12.
Viktigere, under såret nedleggelsen forarbeide, eksempler kan være fast og behandlet med aktuelle flekk for cytoskjelett og kjerner (phalloidin og DAPI, henholdsvis) å visualisere endringer i den morfologiske aspekten av celler (f.eks den dannelse av lamellipodia på stolpe) av fluorescerende/AC confocal mikroskopi. Videre kan behandling av celler med en fluorescerende-merket AMP aktivere visualisering av mobilnettet distribusjon (membran overflaten eller intracellulær/intranuclear lokalisering) på forskjellige tider, siden begynnelsen av cellen vandrende aktiviteten. Videre kan disse setter utnyttes for å analysere sår helbredelse aktivitet på polarisert og differensiert epitelceller (f.eks, primære bronkial celler opprettholdt på luft-flytende grensesnittet) etter å ha plassert dem på passende transwell permeable støtter.
Avslutningsvis har metoden beskrevet betydelig potensial til å forbedre forståelsen vandrende funksjonene av forskjellige typer tilhenger dyr celler/epithelial vev samt valg av den mest lovende sårhelende arrangører og/eller hemmere, innen kort tid og med stor nøyaktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Sapienza Universitetet i Roma og italienske cystisk fibrose Research Foundation (Project FFC #11/2014 vedtatt av FFC delegasjoner fra Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny og Pavia). Del av dette arbeidet ble også støttet av FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Vi er takknemlige for Dr. Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Italia) for å tilby bronkial epitelceller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
References
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens? Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
- Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
- Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
- Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
- Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
- Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
- Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
- Zasloff, M.
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
- Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing? PLoS One. 10, e0128663 (2015).
- Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
- Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
- Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
- Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
- Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
- Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
- Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
- Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).
