Summary
바이러스 성 transcriptional 팩터리는 세포질 RNA 중 합 효소 II 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 전사를 증가 함께 풍성 하 게 이산 구조. 여기, 적극적으로 면역 형광 얼룩이 지 고 제자리에서 RNA 교 잡의 조합에 의해 3D 핵 공간에서 바이러스 성 염색 질을 속기의 사이트를 찾을 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
그것은 잘 알려진 유전자의 공간과 일시적인 규칙 경 세 적절 한 유전자 발현의 중요 한 부분입니다. 따라서, 어디 고 때 전사 일어나 핵 공간 내에서 이해 하 고 episomes 같은 세포의 핵 내에서 감염 사이 관계를 시각화 하기 위해 중요 한 아니다. 여기, 면역 형광 검사 (IFA)와 RNA-물고기 왔다 combinedto 식별 적극적으로 속기 Kaposi의 육 종 관련 herpesvirus (KSHV) episomes. KSHV 대기 시간 관련 핵 항 원 (라 나), 얼룩이 지기에 의해 바이러스 episomes는 핵 내에서 존재 하는 곳을 찾을 수입니다. 또한, 생산적인 감염 동안에 표시 됩니다, 바이러스 성 유전자의 intron 지역 대상으로 RNA-물고기 프로브를 설계 하 여 초기 RNA 사본 있을 수 있습니다. 이 조합의 분자 프로브를 사용 하 여, 큰 바이러스 성 녹음 방송 공장 조립 시각화 하 고 분석 KSHV 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 발현의 공간 규정 가능 하다. 포함 하 여 안티-RNA 중 합 효소 II 항 체 얼룩이 지기, 하나 또한 RNA 중 합 효소 II (RNAPII) 집계 및 재 활성화 하는 동안 KSHV 전사 사이 협회를 시각화할 수 있습니다.
Introduction
그것은 점점 더 분명 핵의 spatiotemporal 조직 진핵생물에서 정밀 하 게 조정 된 유전자 발현 조절에 중요 한 역할을 담당 하 게 되었다. 대부분 조직의 특정 유전자 많은 염색체를 통해 배포 됩니다 하 고 동기적으로 조정된 방식으로1특정 자극에 반응 하기 위하여 통제 될 필요가 있다. 셀 활성화 chromatin 허브 (ACH)을 함께 데리고의 유전자 및 그들의 cis 규정 구성 요소 특정 핵 공간1방법으로 생성 합니다.
그것은 또한 입증 되었습니다 다양 한 연구에 의해 그 핵 보이지만 매우 조밀 하 고 점성, 생물학적 활성 분자 통과할 수 핵 오히려 신속 하 게 보급2를 통해. 이 임시 속성 때문 대부분 DNA 의무적인 단백질 ' 점프 '를 그들의 길은 매우 적응 하 고 다양 한 핵2수 있는 핵 공간 느낌 사이트 바인딩 사이트 바인딩에서.
생체 내에서 핵의이 동적 동작에도 불구 하 고 핵 기관 막 없이 같은 (하지만에 국한 되지 않음) 핵소체 Cajal 몸과 promyelocytic 백혈병 핵 시체 (PML-NB) 여전히 존재. 그것은 탠덤 DNA 반복 (핵소체), rRNA (핵소체) 및 coilin (Cajal 몸) 또는 PML 등 구조 단백질 같은 메커니즘의 다양 한 통해 단백질 (PML-NB)는 이러한 구문을 함께3,4,5 . 이러한 구조와 전사 공장 등 다른 교회 역할 뿐만 아니라 필수 구성 요소의 현지 농도 증가 하지만 단백질 및 궁극적으로 만들 그들 내에서 핵 산의 구성 조절 건설 기계는 효율적인 세포 기능6중앙 사이트입니다.
머릿속으로 하는 핵 구조 형태 epigenetics 공부 하는 연구원에 게 풍부한 정보를 제공 언제, 어디. 바이러스학의 관점에서 KSHV, 같은 latently 감염된 바이러스의 재 활성화 크게 변경 핵의 풍경과 전사 세포 유전자에서 주로 바이러스 성 유전자, 궁극적으로 이동 핵 효소의 분포를 완전 한 기능 바이러스 자손7,8생산. KSHV는 바이러스 성 유전자 발현을 촉진 하기 위하여 세포 유전자 식 기계를 어떻게 조작 합니까? 이러한 정보에는 일시적인 세포 유전자 규제 메커니즘에 빛 창 고 수 있습니다.
다른 모든 herpesviruses KSHV는 용균성 복제 및 지연 시간 이라는 두 개의 라이프 사이클. KSHV는 주로 대기 시간 관련 유전자9,10를 제외 하 고는 대부분의 바이러스 성 유전자의 식 입 막 음, 대기 시간 단계에 상주 합니다. KSHV 생산 대기 시간 동안 대기 핵 항 원 (라 나), constitutively 바이러스 성 게놈을 결속 하 고 인간 염색체11에 바이러스 chromatin tethers 관련. 바이러스 성 게놈과 라 나의 친밀 한 관계 때문에 IFA와 DAPI를 사용 하 여 얼룩을 바이러스 성 episomes 호스트 chromatin 관계 했다 찾을 수 있다.
공부 하 고 단일 episome 수준과 감염 된 세포에 바이러스 성 다른 episomes와 협회에 KSHV 재 활성화, 적극적으로 베 끼 기 바이러스 chromatin에 제자리에 찾을 전략 설립 되었습니다. 따라서, 라 나 및 RNAPII IFA intron RNA-물고기와 결합 했다, KSHV K Rta는 주요 바이러스 성 단백질의 intron 지역 (정확한 프로브 시퀀스 이즈미 야 연구소의 최신 간행물8에서 찾을 수 있습니다)에 바인딩되는 RNA-물고기 프로브를 생성 하 여 필수 고 KSHV 다시 활성화-그것은 식별 가능한 충분 한 전사 찍고 실제로 어디 장소8,11,12,,1314,15 . 이 intron RNA-물고기 기술 연구원을 어디 mRNA 접합 이며 세포질16,17수출 직전 변하게 되는 시각화 수 있습니다.
KSHV phorbol 에스테 르 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) 등을 포함 한 다양 한 화학적 자극에 의해 활성화 될 수 있습니다 및 또한 KSHV 낙 산 염 나트륨 같은 히스톤 deacetylase 억제 물의 overexpression에 의해 활성화 유도 될 수 있다 바이러스 성 녹음 방송 인수, K-Rta19입니다. 연구원은 성공적으로 다시 활성화18유도 전에 셀의 사이클을 동기화 하 여 KSHV 재 활성화의 효율성 증가. 따라서, 이러한 특정 연구에 대 한 셀 더블 티 미 딘 블록 (아래에 설명 된 프로토콜)를 사용 하 여 및 짧은 시간에 대 한 TPA와 아목시실린과 (Dox) 알을 품을 동기화 했다. Doxycyline는 이러한 실험에 활용 셀 라인 doxycycline 유도할 수 있는 K-Rta 카세트 cDNA에서 복제 했다 하 고 K-Rta의 intron 지역에 포함 되지 않습니다 때문에 사용 되었다. 다시 활성화할 수 있지만 K-Rta 식 유도 KSHV 사용 하 여, 그것은 입증 된 다른 연구자는 다양 한 다른 생 화 확 적인 요인으로 인해 K-Rta 식 혼자 판명 미약한 재 자극20. 이들의 모두를 결합 하 여, 시간의 짧은 기간에 마약 외피를 제한 하 여 강력한 하지만 지나치게 인공 KSHV 재 이미징 달성 되었다.
라 나, RNAPII, 라벨링 후 K-Rta introns 그리고 DNA로이 문서에 설명 된, 3D 형광 이미징 widefield deconvolution 현미경을 사용 하 여 수행 되었다. 이미징 소프트웨어와 처리 후 활성 바이러스 episomes의 공간적 분포는 제대로 평가할 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여, 활성 chromatin 허브 및 다른 핵 구조 형성의 근본적인 성격에 관한 중앙 질문 공부 될 수 있다. 동일한 규제 요소를 처리 하는 단일 셀에 있는 동일한 바이러스 episomes spatiotemporal 유전자 규제 메커니즘의 이해를 깊게 하는 독특한 연구 도구를 나타낼 수 있습니다.
이미징 여러 세포 표본을 다른 시간 지점에서 고정 본질적으로 동적 분자 과정의 특성의 한계는 형광 분포에서 미묘한 또는 소규모 변화 감지 되지 않습니다 또는 하 찮은 것으로 간주. 희소 한 경우에 모든 세포 관찰 같은 미묘한 변화를 표시 하지 않는 한 이것은 사실 이다. 따라서, 활성 바이러스 성 전사 및 다른 핵 구조의 전체 spatiotemporal 관계 비판적으로 계산 해야 고정 된 이미지를 사용 하 여 합니다. 이러한 기술적 과제를 해결 하기 위해 가장 좋은 방법은 이미지 라이브 세포 바이러스 episomes을 표시 하 고 시간이 지남에 주요 세포질 효소의 위치에 따라입니다.
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Protocol
주의:이 절차에 사용 된 셀 라인 전염 성 바이러스를 포함, 조심 하 고만 레벨 2 BSL 시설 이상 진행.
1. 세포 준비 및 유지 보수
- 문화 체육-K-RTA BCBL-1 셀 (또는 다른 KSHV 감염 PEL 셀 라인) 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린 스 글루타민 솔루션 보충 RPMI1640 매체에.
- 지속적으로 성장 하 고 2-4 일 마다 1: 4의 비율에 의해 셀을 분할 하려면 확인 하 고 5% 이산화탄소 (CO2), 37 ° C에서 세포 성장.
- 모니터 셀 문화는 가벼운 현미경으로 매일 좋은 세포 성장 및 형태학, 그렇지 않으면 것이 좋습니다 세포 배양을 다시 시작 하거나 셀 문화 조건에 따라 조정할 것인지.
2. 티 미 딘 동기화 및 용균성 유도
- 10 cm 배양 접시, 접시 TREx-K-Rta BCBL-1 셀에 갓 준비 미디어 (미디어의 1 x 106 셀/2 mL)
- 200mm 티 미 딘을 추가 (최종 농도: 2 mM) 요리, 혼합 하 고 18 h에 품 어.
- 원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 갓 준비한 미디어 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 갓된 미디어에 resuspend.
- 8 h S-단계를 종료를 셀 수 있습니다.
- 티 미 딘을 추가 (최종 농도: 2 mM), 혼합 및 16 h에 대 한 품 어.
- 원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 갓 준비한 미디어 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 갓된 미디어에 resuspend.
- 바이러스 재 활성화를 유도, 세포 배양에 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, 최종 농도 20 ng/mL)와 아목시실린과 (DOX, 최종 농도가 100 ng/mL)을 추가 하 고 혼합 4 h에 대 한 품 어. K-Rta 유도할 수 있는 카세트 없이 셀 라인, TPA (최종 농도 20 ng/mL 및 나트륨 낙 산 염 (1mm))를 사용 하 여 다시 활성화 자극.
- 원심 분리기 500 x g.에서 5 분 동안 셀 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀, 다시, 원심 및 완전 한 문화 미디어에 셀 resuspend 3 세척의 총에 대 한 반복 합니다. 완전 한 문화 미디어에 resuspend.
- 24 h에 대 한 성장 하는 세포 수 있습니다.
3. 고정 및 Permeabilization
참고: 계속 하기 전에 확인 고정 솔루션 (DEPC 처리 PBS에 3.7% 포름알데히드), diethyl pyrocarbonate 처리 인산 염 버퍼 식 염 수 (DEPC-PBS), 글리신 DEPC PBS (글리신의 최종 농도: 100 m m) permeabilizating 솔루션 (50% 아세톤, 50% 메탄올) 준비 된다. 일반적으로, 각 슬라이드 필요 적어도 0.5 백만 셀, 필요한 경우 증식 되며 포함 다시 추가 셀 위 세포가 건강 한 경우에 특히.
- Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포를 수집 합니다.
- 원심 200 x g. 세척에서 2 분 동안 셀 셀 3 번 살 균 DEPC PBS의 1 mL. DEPC PBS의 1.2 ml에서 resuspend.
- 6 잘 플레이트의 바닥에 coverslips (실험적인 체제에 의해 결정)의 적절 한 수를 놓습니다.
- 플라스틱 셀에 각 coverslip DEPC PBS 혼합물의 200 µ L, 각 슬라이드에 적어도 0.5 백만 셀 인지 확인 합니다. 2 분 해결 하기 위해 세포를 허용 하 고 발음만 세포의 얇은 층을 떠나 초과 DEPC PBS. 그것은이 과정에서 제거 되 고 셀에 대 한 정상입니다.
주의: PFA는 독성, 적절 한 보호를 착용. - 신중 하 게 각 커버 슬립 솔루션 (DEPC PBS에 3.7% 포름알데히드) 해결의 1 mL를 추가 합니다. 10 분에 대 한 해결 하기 위해 셀 수 있습니다.
- Coverslips DEPC PBS로 3 회 세척.
- 글리신 DEPC PBS의 1 mL를 신중 하 게 추가 (글리신의 최종 농도: 100 mM) 각 커버 슬립. 5 분 동안 담금질 하기 위해 셀 수 있습니다.
- 1 분 Aspirate 초과 DEPC PBS에 단단히 하지만 부드럽게 손을 흔들 또는 5 분 통에 DEPC PBS와 어느 곳의 1.5 mL를 추가 합니다. 수 셀을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 3 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.
- 신중 하 게 각 커버 슬립 솔루션 (50% 아세톤, 50% 메탄올) permeabilizing의 1 mL를 추가 합니다. 15 분 동안 permeabilize를 셀 수 있습니다.
참고:이 시점에서 coverslips는 더 이상 일주일에 보다는-20 ° C 냉장고에 저장할 수 없습니다. 동결 방지 하거나 이미지 품질을 신속 하 게 저하 될 수 있습니다 냉동 실에서 보낸 시간을 최소화 합니다. 있는지 확인 그 때 셀 남아 냉장고에에서 젖은 고는 그들이 제대로 리하이드레이션 DEPC PBS를 가진 후 냉장고에서 제거 하 고 메탄올/아세톤에 덮여. - 5 분 통에 어느 장소와 DEPC PBS의 1.5 mL를 추가 또는 단단히 악수 하지만 손에 부드럽게 1 분에 대 한 발음 초과 DEPC PBS, 셀을 방해 하지 않도록 주의 하십시오. 3 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.
4. 아일랜드와 RNA-물고기
참고: RNA 물고기 프로브 라벨 및 준비에 관한: 대는 K-Rta 959 기본적인 쌍, 31 다른 프로브 intron 했다 생성 약 50%의 콘텐츠 20 기본적인 쌍 각, GC를 포함 했다. 프로브 및 재고 솔루션 각각 100 µ M와 2.5 µ M 농도, aliquoted 했다.
- 필요한 실험 정보 레이블 현미경 슬라이드 또는 구별할 수 라벨의 일종.
- 축축한 종이 수건으로 sealable 플라스틱 컨테이너의 하단 라인.
-
1 차적인 항 체 솔루션을 준비 (1.5 µ L 라 나 항 체, RNA Pol II 항 체의 0.75 µ L, 베이커의 3 µ L의 tRNA, 30 µ L까지 DEPC PBS 효 모), 각 coverslip 존재에 대 한 제조 법을 곱하면. 각에 1 차적인 항 체 솔루션의 장소 30 µ L 현미경 슬라이드 표시.
- 처음 관심의 1 차적인 항 체를 적정 하 고 최적의 금액을 사용 합니다. 반드시 사용 순화 IgG, 세럼 (ascites 액체) RNase의 다량을 포함할 수 있습니다.
- 레이블이 지정 된 현미경 슬라이드에 coverslip (셀 솔루션을 직면 하 고)를 놓고 축축한 종이 수건으로 컨테이너에 슬라이드를 이동 합니다. 조심 하지 거품을 소개 합니다. 커버 플라스틱 랩으로 컨테이너의 외관. 1 시간 동안 37 ° C로 설정 하는 인큐베이터에 컨테이너를 이동 합니다.
- 준비 물고기 워시 버퍼 (2 x 염 분 나트륨 구 연산 염 버퍼 (SSC) (최종), 10 %formamide, 90% DEPC dH2O).
- 준비 하는 교 잡 버퍼 x 2 (4 x SSC, 20 %dextran 황산).
- 이차 항 체와 물고기 intron 프로브 버퍼 준비 (2 교 잡 버퍼 (최종 1 Hyb 버퍼 x) x의 20 µ L, 베이커의 효 모의 4 µ L tRNA (최종 10%), formamide (마지막 10%), K-Rta intron 프로브의 4 µ L (최종 125 nM), 0.8 µ g의 이차 항 체, DEPC dH2 최대 40 µ L O)입니다. 필요한 모든 슬라이드에 대 한 제조 법을 곱하면 됩니다.
- 부 화, 후 3 번 5 분 6 잘 플레이트에서 DEPC PBS로 세포 세척.
- 3 시간 5 분 대 한 물고기 워시 버퍼 씻어. 물고기 세척까지 버퍼에 유지 coverslip 혼합물의 둘째 항 체와 intron 프로브 (단계 4.7) 준비 완료.
- 깨끗 한 유리 슬라이드 교 잡에 대 한 1 차적인 항 체 외피에 대 한 사용.
- 이차 항 체와 물고기 intron 프로브 솔루션 각 유리 슬라이드에 포함 된 40 µ L를 배치 합니다.
- 거품을 소개를 하지 않도록 주의 수 버퍼, 위에 셀 면 슬라이드에 세포와 coverslips을 놓습니다.
- 하단에 축축한 종이 수건으로 플라스틱 용기에 슬라이드를 놓습니다. 최초의 플라스틱 포장 및 알루미늄 호 일 플라스틱 용기 포장.
- 16-24 h에 대 한 37 ° C에서 슬라이드와 컨테이너를 품 어.
- 부 화, 후 신중 하 게는 coverslip 유리 슬라이드 가장자리에서 슬라이드 다시 위로 향하도록 6 잘 플레이트에 넣어 그리고 물고기 워시 버퍼 3 회에서 5 분 동안 6 잘 플레이트 세포를 씻어.
- 2 번 2와 셀 세척 x SSC.
- 2로 DAPI (1:1, 000)를 추가 x SSC 및 실 온에서 5 분 동안 앉아 있게.
- 2 번 2와 셀 세척 x SSC.
- 교 잡, 사용 유리 슬라이드를 청소 하 고 유리 슬라이드에 솔루션 설치 10 µ L을 추가.
- 장착 솔루션에 coverslips 뒤집어를 놓습니다. 조심 하지 거품을 소개 합니다.
- 연구소 조직으로 부드럽게 셀 스쿼시 주의 초과 설치 솔루션을 제거 합니다.
- 매니큐어를 사용 하는 coverslips의 가장자리 주위에 충분 한 레이어를 적용 하 고 건조를 허용.
- 형광 현미경 검사 법 수행을 계속 진행 합니다.
5. 3D 형광 현미경 검사 법
참고: 프로토콜 사용 하는 형광 현미경 시스템의 유형을 변화할 것 이다, 하는 동안 다음 단계 정량 분석에 대 한 최적의 이미지 데이터의 수집을 위해 도움이 됩니다.
- 고정된 샘플을 pretreat 고 형광 photobleaching 이미징 동안 지연 방지 페이드 미디어에 탑재.
- 모든 셀 (또는 셀 핵)을 캡처할 수 있습니다 (예: 60 X 1.42 한다 기름 침수 렌즈), 높은 품질 목표를 사용 하 여 보기의 필드에.
- 노출 매개 변수 (예를 들어, 전원을, 노출 시간 긍정 및 부정적인 컨트롤 샘플을 사용 하 여 각 형광 색 채널에 대 한) 설정 합니다. 형광 이미지를 취득 합니다.
참고: 하나의 형광 라벨을 포함 하는 긍정적인 컨트롤 샘플도 색상 채널 사이 "누화"의 레벨을 사용 해야 합니다. 이미지 고정된 셀 표본에 대 한 형광 전원을 줄일 수 있습니다 (약간 더 긴 노출 시간)와 photobleaching를 최소화 하기 위해. - 이미징 프로토콜 설정 된 후 유지 동일한 노출 매개 변수 연구에서 모든 샘플에 대 한 일관성 있는-이미지 데이터를 정확 하 게 분석 하 고 비교할 수 있도록.
- 사후 수집 이미지 처리 및 3 차원 재구성을 수행 합니다. 식별 RNA 물고기 신호 (적색)에 의해 K-Rta 사본, 면역 형광 (녹색), 및 핵 chromatin 라 나 분자 (해당 되는 경우) DAPI (파란색)으로 물.
참고: 있는 K-Rta와 라 나 공동 클러스터는 세포 핵의 지역 따라서 바이러스 성 녹음 방송 공장 및 복잡 한 복제와 관련 된 것으로 믿어진다.
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Representative Results
BCBL-1 셀 사용 되 고 라 나와 K-Rta RNA (그림 1) 스테인드 했다 약간 요약된 프로토콜 수행 되었다. 이 실험 검사 바이러스 episomes 적극적으로 베 끼고는 및 셀의 인구에 KSHV 재 자극에 응답의이를 수 있습니다. 그림 1에서 화살표로 표시 된 셀에 밀접 하 게 일치 (로 표시 라 나) 바이러스 episomes의 분포 지역에 고유 K Rta 형광 KSHV 게놈 가까이 일어나 활성 전사에 대 한 증거입니다. 동일한 샘플에서는 그림 1 에서 화살촉에 의해 의미 하는 것과 같은 셀 관찰할 수 있습니다, 많은 약한 및 확산 K Rta 형광 크게 중복 되지 않는 그 라 나로 전시 하는. 이것은 일반적인 찾는 내 세포의 인구는 다시 활성화 자극에 응답의 정도에 상당한 변화 보여줍니다.
그림 1: 바이러스 episomes의 활성 전사 시각화. IFA과 RNA BCBL-1 셀에서 수행 되었다. BCBL-1 셀 동기화 되지 했지만 4 헤 라를 사용 하 여 immunostaining에 대 한 TPA와 나트륨 낙 산 염으로 치료, 바이러스 성 게놈 RNA-물고기 K Rta introns 빨간색에서 위치 활성 전사를 대상으로 수행 하는 동안 녹색, 시각화 했다. 세포질 chromatin 게시물 고정 및 permeabilization DAPI와 스테인드 했다. K-Rta intron와 라 나 얼룩 함께 합병 했다. 전체 화살표는 완전히 활성화 하 고 VTFs를 형성 하는 셀을 가리킵니다. 화살촉만 활성화 하 고, 시작 하는 셀을 가리키는 동안 약한 K Rta 신호에 의해 제안. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
다음 티 미 딘 동기화의 효과 바이러스 성 단백질 K-Rta (그림 2)의 표현을 시각화 하 여 시험 되었다. 앞에서 설명한 프로토콜 수행 후 이중 티 미 딘 블록 TREX BCBL-1 셀 g 1/S 상전이에 동기화를 수행, (라 나 및 RNAPII 없이 얼룩). K-Rta 얼룩을 검사 하 여 동기화 된 셀 비동기화 인구 보다 재 자극에 더 반응 명확 하 게 분명 하다. 이즈미 야 연구소 (데이터 표시 되지 않음)에서 실시 하는 이전 연구, 그것을 RNAPII도 colocalizes 더 자주 K-Rta와 세포 주기 동기화 후 검증 않았습니다.
그림 2: 티 미 딘 효과. RNA-물고기 TREX K-Rta BCBL-1 셀에서 수행 되었다. 셀 (표시는 "2 배 네" 제목) 더블 티 미 딘 블록 동기화 했다. 모두 동기화 하 고 동기화 된 세포 인구 4 h. K Rta introns RNA 물고기 프로브 때 교배 했다 대 한 TPA와 DOX 치료 했다. 균일 하 게 밝은 레드 셀 K Rta overexpressing 하지은, 대신 그들은 죽은, (표시 되지) 얼룩 DAPI 검증. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
일반 노트,이 프로토콜을 수행할 때 DAPI 셀 얼룩 매우 중요 하다. Apototic 세포는 핵 분열에 의해 blebbing 쉽게 인식할 수 있습니다. 무거운 유도 자극 및 일반 셀 문화 관행을 감안할 때, 일부 죽은 세포를 볼 수에 대 한 일반적입니다. 라이브 및 죽은 세포 사이 분별 하는 기본 방법으로 항상 DAPI와 얼룩에 중요 하다. 때로는 항 체 또는 RNA 프로브 apoptotic 세포에 잡힐 것 이다 신호를 생성, 따라서 그 세포 분석에서 제외 하는 것이 중요 하다. DAPI 얼룩 여러 추가 기능을 사용할 수 있습니다 예를 들어 그림 3, 그것은 분명 화살표가 표시 된 개체는 실제로 세 개의 별도 셀 하나를 대신.
그것은 중요 그림 3 및 그림 4 에 표시 된 이미지 더 punctate 패턴 만들 deconvolved 했다. RNAPII 얼룩을 검사 하 여 셀의 차이 화살표로 표시 하 고 다른 주변 세포를 볼 수 있습니다. 그것은 RNAPII 신호 deconvolution 때문에 정상 보다 발음 훨씬 더 말할 것도 주목 된다입니다.
이 기술은 함께 3D 현미경을 사용 하 여 RNAPII, 라 나, 그리고 K-Rta 사이의 공간 관계를 심문 수 있습니다. 예를 들어 그림 4, KSHV 게놈 주변에 점선으로 고리 모양의 RNAPII 구조를 볼 수 있습니다. 녹음 방송 공장을 개발 하는 셀에 RNAPII와 라 나 일반적으로 colocalizes 일반적으로 그러나, 라 나 점의 모든 RNAPII, 함께 연구는 4를 포함 하 여 colocalize번째 차원 (시간)이 표현이 형을 명확히 해야 할 것 이다. 그것은 K-Rta 신호 colocalize 하지 않는 몇 가지 라 나 점 개별 셀 (그림 4) 내 에서도 재 자극에 응답에서 episomal이 나타내는 추가 해야 합니다.
그림 3: 결합 IFA 및 intron RNA-물고기. IFA와 RNA-물고기 TREX K-Rta BCBL-1 셀에서 수행 되었다. 바이러스 성 게놈 있었다 라 나 (녹색), 녹음 방송 RNA-물고기 K Rta mRNA (노란색)의 intron 영역의 가시화 했다, RNAPII (레드) 교회 IFA와 함께 표시 했다 및 셀 이미지 DAPI를 사용 하 여 스테인드 마침내 했다 활성의 immunostaining와 함께 DNA (파란색)입니다. TREx K-RTA BCBL-1 셀 셀 4 h, TPA와 DOX 인큐베이션을 통해 활성화 된 다음 더블 티 미 딘 블록을 사용 하 여 동기화 된 그리고 24 시간 후 셀 고정 했다, permeabilized, 더 이미징에 대 한 준비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 바이러스 성 녹음 방송 공장의 3D 시각화. Intron RNA-물고기 K Rta intron 프로브 (밝은 파랑), RNAPII (레드)와 라 (녹색), DAPI DNA (진한 파란색) 얼룩의 immunostaining를 사용 하 여. Deconvolved Z 스택 현미경에 촬영 하 고, 처리 하 고 상용 이미징 소프트웨어에의 3D 렌더링 (재료의 표 참조). TREx K-Rta BCBL-1 셀 더블 티 미 딘 동기화 다음 TPA와 4 헤 셀 DOX 처리 후 다시 활성화 자극 했다 28 h는 처리 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
특이 한 상황에 맞게 변경 될 수 있는 프로토콜의 몇 가지 측면을 확인 하 고 있습니다. 고정 및 permeabilization 버퍼의 선택 또한 변경 될 수 있습니다. 고정 버퍼에 대 한 paraformaldehyde도 효과적 이며 에탄올 permeabilization 사용할 수 있습니다.
PBS는 것이 좋습니다 그것 포름알데히드 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 부재에 항 체를 사용 하지 않도록 설정 하지만 글리신 PBS 단계를 건너뛸 수 있습니다 경우에 coverslips은 철저 하 게 충분 한 세척 된다, 글리신과 포름알데히드를 냉각 하 고 프로토콜에서 차단 솔루션으로 서 소 혈 청 알 부 민을 사용 하지 않습니다. 파일럿 연구는 RNA 저하 때문에 아마도 약한 RNA 물고기 신호를 보여준 이즈미 야 실험실에서 실시. 1 차 항 체에 대 한 차단, 필요한 경우 RNase 무료 BSA를 사용 하는 것이 좋습니다. 과거의 경험, 그것은 발견 되었다 항 체 특정 경우에, BSA의 포함은 필요 하지 않다고는 반응. 그러나, 그것 항상 효 모든 외피에 tRNA 단계를 초과 하는 금액을 포함 것이 좋습니다 RNA 저하 방지. 그것은 tRNA를 사용 하 여 에이전트를 차단으로 특정 RNA 물고기 신호 증가 발견 했다.
세포 주기 동기화 보다 효율적이 고 동기 KSHV 재를 생산 하기 위해 구현 되었습니다. 세포 주기 동기화, hydroxyurea 또는 혈 청 기아 대체 방법을 수 있습니다. 비록 혼자 hydroxyurea와 인큐베이션 닫혔는지 KSHV 약하게 그 hydroxyurea는 티 미 딘 블록을 사용 하 여 효과적으로 확인 됐다.
어떻게이 기술에 적용할 수 있는 다른 연구? 이즈미 야 연구소의 가장 최근의 출판물에 적극적으로 KSHV episomes 및 RNA pol II, RNA 녹음 방송에 대 한 필수적인 효소를 속기의 그 colocalization을 보였다. 그러나, KSHV 유전자 규칙에서 포함 된 공동 활성 제, 공동 repressors 및 셀룰러 transcriptional 요인의 수는 알려져 있습니다. 양적 RT-PCR는 역사적으로 사용 되었다 경작된 한 세포의 인구 (재 활성화와 잠의 혼합물)에 바이러스 성 성적을 측정 하 고 바이러스 성 유전자 발현에 미치는 영향을 평가. 위에서 설명한 방법을 사용 하 여, 분석 축소 수 있습니다 검사 바이러스 성 전사 단일 episomal 수준. 따라서, 다른 세포와 바이러스 성 효소의 spatiotemporal 규제 KSHV 재 활성화와 함께 그들의 협회에 대 한 통찰력을 얻기 위해 시험 될 수 있다. 그러나 그것은 또한 그 때문에 RNA intron 지역의 과도 자연 RNA 물고기 프로브 교배 하 고 일반적으로 지역화의 저하에 따라 달라 집니다 어디 활성 전사 일어나, 말할 것도 주목할 만한는 introns는 타락 하지 경우 즉시, 물고기 프로브 신호 활성 전사 항상 부근 하지를 제시할 수 있습니다.
순간, 세포질 녹음 방송 공장의 형성과 그들의 게놈 크기와 세포질 발기인의 구성의 복잡성으로 인해 후속 유전자 발현의 관계를 공부 하기 어렵습니다. 이와 관련, KSHV episomes 그들의 상대적으로 작은 게놈 크기, 분명 RNA Pol II 집계 형성으로 정의 된 재 활성화 메커니즘 결과로 이상적인 도구가 될 수 있습니다. KSHV의 다룰 바이러스 미니 염색체를 사용 하 여 herpesvirology는 독특한 각도에서 셀룰러 epigenetics 연구 분야에 기여할 수 있다.
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Disclosures
이 문서의 저자는 금융 관계 또는 관심사의 경쟁 충돌 있다.
Acknowledgments
이 연구는 미국의 암 사회 연구 학술 상 (RSG-13-383-MPC)와 건강의 국가 학회 교부 금 (R01-DE025985)에 의해 지원 되었다. 이 작품 또한 지원 되었다 미국 농 무부 (2015-67015-23268 및 2014-67015-21787) 및 캘리포니아 대학에서에서 새로운 연구 이니셔티브 부여에서 교부 금에 의해 데이비스.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22x22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
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