Funktionel billeddannelse af Viral transskription fabrikker ved hjælp af 3D Fluorescens mikroskopi
Summary
Viral transcriptional fabrikker er diskrete strukturer, der er beriget med cellulære RNA polymerase II at øge virale gen transskription under genaktivering. Her, er en metode til at finde websteder af aktivt transskribere viral kromatin i 3D nukleare plads ved en kombination af immunofluorescens farvning og i situ RNA hybridisering beskrevet.
Abstract
Det er velkendt at rumlige og tidsmæssige reguleringen af gener er en integreret del af for ordentlig genekspression. Derfor er det uvurderligt at forstå, hvor og Hvornår transskription finder sted inden for nuklear plads og at visualisere forholdet mellem episomes smittet inden for den samme cellekernen. Her både immunofluorescens (IFA) og RNA-fisk har været combinedto identificere aktivt transskribere Kaposis sarkom-associerede herpesvirus (KSHV) episomes. Ved farvning KSHV latency-associerede nukleare antigen (LANA), er det muligt at lokalisere hvor viral episomes findes i kernen. Derudover ved at designe RNA-fisk sonder at målrette regionen intronnet af et virale gen, som er udtrykt kun under produktive infektion, kan spirende RNA udskrifter være placeret. Med denne kombination af molekylære sonder, er det muligt at visualisere samling af store viral transskription fabrikker og analysere den rumlige regulering af viral genekspression under KSHV reaktivering. Af herunder anti-RNA polymerase II antistoffarvning, kan man også visualisere tilknytningen mellem RNA-polymerase II (RNAPII) aggregering og KSHV transskription under genaktivering.
Introduction
Det er blevet stadig mere klart, at den spatiotemporelle organisation af kernen spiller en vigtig rolle i modulerende fint afstemt genekspression i eukaryoter. De fleste væv specifikke gener er fordelt på mange kromosomer og skal reguleres synkront for at reagere på specifik stimuli i en koordineret1. Celler konstruere aktive kromatin hubs (ACH) som en måde at samle gener og deres cis-regulerende komponenter til en bestemt nukleare plads1.
Det er også blevet påvist af forskellige undersøgelser, at selv om kernen synes meget tætte og tyktflydende, biologisk aktive molekyler kan krydse kernen ret hurtigt via diffusion2. Som følge af denne kortvarige ejendom springe de fleste DNA-bindende proteiner’ ‘ fra bindende site bindende site, føle deres måde omkring den nukleare plads, som giver mulighed for en meget adaptive og alsidig kerne2.
Trods denne dynamiske opførsel af biomolekyler i kernen, nukleare organer uden membraner såsom (men ikke begrænset til) den nucleolus, Cajal organer og promyelocyt leukæmi nukleare organer (PML-NB) stadig eksisterer. Det er gennem en række mekanismer som tandem DNA gentager (nucleolus), rRNA (nucleolus) og strukturelle proteiner som Merete (Cajal organer) eller PML proteiner (PML-NB) der holder disse konstruktioner sammen3,4,5 . Disse strukturer og andre menigheder såsom transskription fabrikker tjene som stilladser, der ikke kun øger den lokale koncentration af nødvendige komponenter, men også regulere sammensætningen af proteiner og nukleinsyrer inden for dem i sidste ende oprette et centrale websted for effektiv cellulære funktioner6.
Visualisering, hvornår og hvor nukleare strukturer form giver et væld af oplysninger til forskere studerer Epigenetik. Fra en virologi perspektiv, reaktivering af latent inficerede vira, såsom KSHV, væsentligt ændrer landskabet af kernen og distribution af nukleare enzymer til at flytte transskription primært fra cellulære gener til virale gener, i sidste ende til producere fuldt funktionel viral afkom7,8. Hvordan KSHV manipulere cellulære gen expression maskiner at lette viral genekspression? Sådanne oplysninger kunne også kaste lys over tidsmæssige cellulære gen reguleringsmekanismer.
Ligesom alle andre herpesvirus har KSHV to livscyklusser kaldet lytisk replikering og ventetid. KSHV primært er bosat i stadiet ventetid, hvor hovedparten af sin virale gen expression er tavshed, undtagen latency forbundet gener9,10. Under latency KSHV producerer forbundet latency nukleare antigen (LANA), som constitutively binder de virale genomer og bindsler viral kromatin til menneskets kromosom11. På grund af LANAS intime forhold med den virale genom er det muligt at bruge IFA og DAPI pletten og lokalisere hvor de virale episomes var i forhold til værten kromatin.
For at studere KSHV reaktivering ved enkelt episome niveau og sammenslutning med andre virale episomes i en inficeret celle, er der opstillet en strategi til at lokalisere aktivt transskribere viral kromatin i situ . I overensstemmelse hermed, LANA og RNAPII IFA med intron RNA-fisk blev kombineret, ved at generere RNA-fisk sonder, der binder til regionen intron (nøjagtige sonde sekvenser kan findes i Izumiya lab’s seneste publikation8) KSHV K-Rta-den nøglen viral protein, der er nødvendigt og tilstrækkeligt for KSHV reaktivering-det var muligt at identificere hvor transskription faktisk finder sted8,11,12,13,14,15 . Denne intron RNA-fisk teknik gør det muligt for forskere at visualisere, hvor mRNA er ved at blive transskriberet umiddelbart før det er splejset og eksporteres til cytoplasma16,17.
KSHV kan genaktiveres af forskellige kemiske stimuli herunder phorbol estere såsom 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) og Histon deacetylase hæmmere såsom natrium butyrat, desuden KSHV kan tilskyndes til at genaktivere ved overekspression af den virale transkriptionsfaktor, K-Rta19. Forskere har med held øget effektivitet af KSHV reaktivering ved at synkronisere den celle cyklusser før inducerende reaktivering18. Således, for disse særlige undersøgelser, celler blev synkroniseret ved hjælp af en dobbelt thymidine blok (protokollen beskrevet nedenfor) og inkuberes med TPA og doxycyclin (Dox) i en kort tid. Doxycyline blev brugt, fordi den cellelinie, udnyttes i disse eksperimenter har en doxycyclin-inducerbar K-Rta kassette, som var klonet fra cDNA og ikke indeholder intron region af K-Rta. Selv om det er muligt at reaktivere KSHV bruger kun induceret K-Rta udtryk, det er blevet bevist af andre forskere, at K-Rta udtryk alene på grund af en lang række forskellige biokemiske faktorer viser sig for at være et svagt reaktivering stimuli20. Ved at kombinere alle disse, og ved at begrænse drug inkubationer til en kort periode, blev en robust, men ikke alt for kunstig KSHV reaktivering opnået for billeddannelse.
Efter mærkning LANA, RNAPII, K-Rta introner og DNA som beskrevet i denne hvidbog, 3D fluorescens imaging blev udført ved hjælp af en widefield deconvolution mikroskop. Efter behandling med imaging software, kan den geografiske fordeling af aktive viral episomes evalueres ordentligt. Brug af denne teknik, kan de centrale spørgsmål vedrørende den grundlæggende karakter af dannelsen af aktive kromatin hubs og andre nukleare strukturer studeres. At have identiske viral episomes i en enkelt celle, der behandler de samme regulerende elementer kan udgøre en unik forskningsværktøj til at uddybe forståelsen af spatiotemporelle gen reguleringsmekanismer.
En begrænsning af imaging flere celle prøver fast på forskellige tidspunkter for at karakterisere en i sagens natur dynamiske molekylære proces er at subtile eller små ændringer i fluorescens distribution er uopdaget eller anses for ubetydelig. Dette gælder medmindre i de sjældne tilfælde, hver celle iagttaget viser den samme subtile ændring. Således, det fuld spatiotemporelle forholdet mellem aktive viral transskription og andre nukleare strukturer kan ikke kritisk evalueres ved hjælp af faste billedbehandling. For at imødegå disse tekniske udfordringer, er den bedste fremgangsmåde at billedet levende celler, der har markeret viral episomes og følge placeringen af vigtige cellulære enzymer over tid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er nogle aspekter af protokollen, som kan blive ændret for at imødekomme usædvanlige omstændigheder. Valget af fiksation og permeabilization buffere kan også ændres. Til fiksation buffere, PARAFORMALDEHYD er også effektiv og ethanol kan anvendes til permeabilization.
Quenching formaldehyd med glycin PBS er anbefales, da det forhindrer formaldehyd i deaktivering af antistoffer i mangel af bovint serumalbumin (BSA), men hvis coverslips er skyllet grundigt nok, glycin PBS skridt kan ho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health grant (R01-DE025985) og en American Cancer Society forskning Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Dette arbejde blev også støttet af tilskud fra den amerikanske Department of Agriculture (2015-67015-23268 og 2014-67015-21787) og ny forskning initiativ tilskud fra University of California, Davis.
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
- Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
- Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
- Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi’s sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
- Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
- Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
- Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
- Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
- McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
- Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
