3D Floresans mikroskobu kullanılarak Viral transkripsiyon fabrikaların fonksiyonel görüntüleme
Summary
Viral transkripsiyon fabrikalar hücresel RNA polimeraz II viral gen transkripsiyonu yeniden etkinleştirme sırasında artırmak için ile zenginleştirilmiş ayrık yapılardır. Burada, sitelerinden Aktif 3D nükleer alanda viral Kromatin ayirt boyama ve in situ RNA hibridizasyon kombinasyonu tarafından transkripsiyonu birini bulmak için bir yöntem açıklanmıştır.
Abstract
İyi genler kayma ve temporal düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu yöneten ayrılmaz bir parçası olduğu bilinmektedir. Sonuç olarak, nerede ve ne zaman transkripsiyon nükleer alanı içinde yer alıyor anlamak ve aynı hücre çekirdeği içinde enfekte episomes arasındaki ilişkiyi görselleştirmek için çok değerli olduğunu. Burada, ayirt (IFA) ve RNA-balık olmuştur combinedto belirlemek aktif Kaposi sarkomu ilişkili herpesvirus (KSHV) episomes transkripsiyonu. KSHV gecikme süresi ilişkili nükleer antijen (LANA) Boyama tarafından viral episomes çekirdeği içinde bulunduğu bulmak mümkündür. Buna ek olarak, sadece verimli enfeksiyon sırasında ifade edilir, viral bir gen intron bölgesinin hedef için RNA-balık probları tasarlayarak doğmakta olan RNA transkript bulunabilir. Bu moleküler probları birleşimini kullanarak, büyük viral transkripsiyon fabrikalar Meclisi görselleştirmek ve mekansal düzenleme viral gen ekspresyonu KSHV yeniden etkinleştirme sırasında analiz etmek mümkündür. Anti-RNA polimeraz II antikor boyama dahil olarak, bir de RNA polimeraz II (RNAPII) toplama ve KSHV transkripsiyon yeniden etkinleştirme sırasında arasındaki ilişkiyi görselleştirebilirsiniz.
Introduction
Çekirdek kronolojik zamanmekansal organizasyonu hassas bir şekilde ayarlanmış gen ekspresyonu ökaryotlarda oransal olarak önemli bir rol oynar giderek netlik kazanmıştır. Çoğu doku belirli genler üzerinde birçok kromozomlar dağıtılır ve koordine bir şekilde1belirli uyaranlara yanıt için zaman uyumlu olarak düzenlenmiş olması gerekir. Hücreleri aktif Kromatin hub’lar (ACH) genleri ve CIS düzenleyici bileşenleri belirli nükleer alanı1buluşturan bir yolu olarak oluşturun.
Bu da tarafından çeşitli çalışmalar çekirdeği çok yoğun ve yapışkan görünse de, biyolojik olarak aktif molekülleri çekirdeği oldukça hızlı bir şekilde Difüzyon2erişebilen olduğunu kanıtlanmıştır. Sonucu olarak kısa ömürlü bu özellik, çoğu DNA bağlayıcı proteinler ‘için son derece uyumlu ve çok yönlü çekirdek2sağlayan nükleer alanda etrafında kendi yollarını duygu site Bağlayıcısı için site bağlayıcısı üzerinden atlama’.
Biomolecules çekirdeği içinde bu dinamik davranış rağmen nükleer membran gibi organları (ama bunlarla sınırlı olmamak üzere) çekirdekçik, Cajal organları ve promyelötik lösemi nükleer organları (PML-NB) hala mevcut. Bu yapıları birlikte3,4,5 tutun proteinler (PML-NB) çeşitli mekanizmalar tandem DNA yineler (çekirdekçik), rRNA (çekirdekçik) ve Cajal aytac (organları) veya PML gibi yapısal proteinler gibi geçer . Bu yapılar ve diğer cemaat transkripsiyon fabrikalar gibi sadece gerekli bileşenleri yerel konsantrasyonu artırmak, ancak aynı zamanda proteinler ve nükleik asitler sonuçta oluşturmak için bunları içinde kompozisyon düzenleyen iskele olarak hizmet bir verimli hücresel işlevler6için merkezi bir sitedeki.
Nerede ve ne zaman nükleer yapılar formu epigenetik eğitim araştırmacılar için bilgi hazinesi sağlar görselleştirme. Viroloji açısından bakıldığında, KSHV gibi gizlice enfekte virüsler reaktivasyonu önemli ölçüde çekirdeği Peyzaj ve dağıtım nükleer enzimlerin transkripsiyon öncelikle hücresel genlerin viral genler için sonuçta kaydırmaya değiştirir için tamamen işlevsel viral döl7,8üretmek. KSHV viral gen ifadesi kolaylaştırmak için hücresel gen ifade makine nasıl işlemek? Bu bilgileri ayrıca zamansal hücresel gen düzenleyici mekanizmaları ışık.
Diğer herpesviruses gibi KSHV litik çoğaltma ve gecikme süresi olarak adlandırılan iki ömürleri vardır. Gecikme süresi ilişkili genlerin9,10dışında KSHV öncelikle içinde hangi en-in onun viral gen ifade susturulması, gecikme süresi aşamasında yer alır. KSHV üretir gecikme süresi sırasında gecikme süresi yapısal viral genom bağlar ve insan kromozom11viral Kromatin tethers nükleer antijen (LANA), ilişkili. Viral genom ile LANA’ın samimi ilişki nedeniyle IFA ve DAPI leke ve viral episomes ile ilgili olarak ana bilgisayar Kromatin nerede olduğunu bulmak için kullanmak mümkündür.
KSHV reaktivasyonu tek episome düzeyinde ve derneğin diğer viral episomes virüslü bir hücre ile çalışmaya, aktif viral Kromatin situ transkripsiyonu bulmak için bir strateji kurulmuştur. Buna göre LANA ve RNAPII IFA intron RNA-balık ile bu KSHV K-Rta-anahtar viral protein intron bölge (tam sonda dizileri-ebilmek bulunmak Izumiya laboratuar en son yayın8‘) bağlamak RNA-balık probları oluşturarak kombine edilmiştir gerekli ve yeterli KSHV yeniden etkinleştirme-BT tanımlamak mümkün için transkripsiyon aslında alıyordu nerede8,11,12,13,14,15 yere . Bu intron RNA-balık tekniği araştırmacılar spliced ve sitoplazma16,17‘ ye ihraç hemen önce nerede mRNA sentezlenir görselleştirmenizi sağlar.
KSHV tarafından phorbol esterleri gibi 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) dahil olmak üzere çeşitli kimyasal uyaranlara yeniden etkinleştirilebilir ve Histon deacetylase inhibitörleri gibi sodyum bütrat, ayrıca KSHV overexpression tarafından yeniden etkinleştirmek için indüklenen viral transkripsiyon faktörü, K-Rta19. Araştırmacılar başarıyla yeniden etkinleştirme18inducing önce hücre döngüsü eşitleyerek KSHV reaktivasyonu verimliliği artmıştır. Böylece, bu belirli çalışmalar için hücreleri bir çift timidin blok (aşağıda açıklanan iletişim kuralı) kullanarak ve TPA ve Doksisiklin (Dox) ile kısa bir süre için inkübe senkronize. Bu deneylerde kullanılan hücre kültürünü cDNA klonlanmış ve K-Rta intron bölgenin içermez Doksisiklin indüklenebilir bir K-Rta kaset olduğundan Doxycyline kullanıldı. Yeniden etkinleştirmek mümkündür ancak KSHV kullanarak sadece K-Rta ifade indüklenen, çeşitli farklı biyokimyasal faktörler nedeniyle K-Rta ifade yalnız bir zayıf reaktivasyonu uyaranlara20olmaktadır araştırmacılar tarafından kanıtlanmıştır. Bunların hepsi birleştirerek ve uyuşturucu incubations kısa bir süre için sınırlayarak, bir güçlü ama aşırı yapay KSHV etkinleştirme görüntüleme için sağlanır.
LANA, RNAPII, etiketleme sonra K-Rta intron ve DNA olarak bu yazıda açıklanan, 3D Floresans görüntüleme widefield deconvolution mikroskop kullanılarak gerçekleştirildi. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı ile işlendikten sonra aktif viral episomes kayma dağılımını düzgün değerlendirilebilir. Bu tekniği kullanarak, etkin Kromatin hub’ları ve diğer nükleer yapıların oluşumu temel doğa ile ilgili sorular Merkezi okudu olabilir. Aynı viral episomes aynı düzenleyici elemanlarının işleyen tek bir hücreye sahip kronolojik zamanmekansal gen düzenleyici mekanizmaları anlayışı derinleştirmek için benzersiz araştırma aracı temsil edebilir.
Farklı zaman noktalarda sabit birden çok hücre örnekleri doğal olarak dinamik bir moleküler süreci karakterize görüntüleme bir floresan dağıtım ince ya da küçük ölçekli değişiklikleri tespit edilmemiş veya önemsiz kabul kısıtlamadır. Nadir örneğini her hücresinde gözlenen aynı ince değişiklik görüntüler sürece bu doğrudur. Böylece, aktif viral transkripsiyon ve diğer nükleer yapıların tam kronolojik zamanmekansal ilişki eleştirel sabit Imaging’i kullanma değerlendirilemez. Bu teknik sorunları ele almak üzere, viral episomes işaretlenmiş resim canlı hücreleri ve zaman içinde anahtar hücresel enzimler konumunu takip için en iyi yaklaşım olduğunu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sıra dışı durumlar karşılamak için değiştirilebilir Protokolü bazı yönleri vardır. Fiksasyon ve permeabilization arabellekleri seçiminde de değiştirilebilir. Fiksasyon arabellekleri için paraformaldehyde da etkilidir ve etanol permeabilization için kullanılabilir.
Şoklama formaldehit ile glisin PBS formaldehit sığır serum albumin (BSA) yokluğunda antikorlar devre dışı bırakmasını engeller, ancak coverslips iyice yeterli yıkanır,-ebilmek var olmak Kaptan glisin P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe (R01-DE025985) ve bir Amerikan Kanser Derneği araştırma bilim adamı Ödülü (RSG-13-383-MPC) tarafından desteklenmiştir. Bu eser, Davis de ABD Tarım Bakanlığı (2015-67015-23268 ve 2014-67015-21787) ve University of California, yeni araştırma girişimi bursu gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
- Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
- Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
- Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi’s sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
- Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
- Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
- Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
- Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
- McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
- Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
