Summary
Protocolli per la crioconservazione di maturazione e lo sperma di anguilla europea sono state migliorate negli ultimi anni. Questo articolo viene descritto il protocollo migliore disponibile con gonadotropina corionica umana (hCG) per indurre la maturazione e metanolo come crioprotettore.
Abstract
Negli ultimi anni, diversi gruppi di ricerca hanno lavorato sullo sviluppo e miglioramento di nuovi protocolli per la gestione di anguilla europea e maturazione. Come di ancora, iniezioni settimanali di gonadotropina corionica umana (hCG) hanno dimostrato di maturate maschi dopo appena 5-6 settimane di trattamento, produzione di elevati volumi di alta qualità dello sperma durante parecchie settimane. Inoltre, protocolli di crioconservazione di spermatozoi utilizzando diversi dispositivi Extender, crioprotettori e raffreddamento e scongelamento volte precedentemente sono stati descritti per anguilla europea. Qui, indichiamo che Tanaka´s la soluzione di estensione può essere direttamente utilizzata per la fecondazione o per la crioconservazione, rendendo inutile l'utilizzo di diversi tipi di soluzioni e diluizioni. Inoltre, l'uso del metanolo come crioprotettore rende questo protocollo facile da usare come metanolo ha una bassa tossicità e non attivare lo sperma. Lo sperma non deve necessariamente essere crioconservati immediatamente dopo l'aggiunta del crioprotettore, e può essere utilizzato a lungo dopo essere scongelati. Inoltre, la motilità dello sperma è ancora alta dopo lo scongelamento anche se è più basso di quello di sperma fresco. Lo scopo di questo lavoro è quello di mostrare il miglior protocollo disponibile per anguilla europea la gestione, la maturazione e la crioconservazione degli spermatozoi.
Introduction
Negli ultimi 25 anni, il numero di anguilla europea (Anguilla anguilla) che arrivano al litorale europeo sono diminuiti costantemente dal 90% 1,2,3. Ci sono diversi fattori che spiegano questo drastico calo compreso le infezioni, inquinamento, distruzione di sovrasfruttamento e habitat. Tutto questo ha avuto un effetto profondo su questa specie, che l'inclusione dell'anguilla europea su Unione internazionale per la lista di conservazione della natura (IUCN) come in pericolo critico 4. Di conseguenza, lo sviluppo di tecniche e protocolli per la riproduzione in cattività sono necessarie.
La maturazione delle uova dell'anguilla europea in cattività avviene mediante trattamento ormonale 5,6,7 , ma la produzione di gameti in entrambi i sessi è difficile sincronizzare 8. Anche se lo sviluppo di nuovi impianti di androgeni è indicata per accelerare oogenesi anguille 9,10, i tempi di maturazione finale nelle femmine è ancora altamente variabili e difficili da controllare 11. Pertanto, deposito a breve termine delle tecniche di sperma 12,13,14 e crioconservazione sono necessarie per la gestione della riproduzione, rendendo gamete sincronizzazione inutili 8.
Crioconservazione di spermatozoi di anguilla europea è stato sviluppato dal 2003 15,16. Diversi ricercatori progettato protocolli successo utilizzando solfossido dimetilico (DMSO) o metanolo come crioprotettori 16,17,18,19,20. Sebbene entrambi i protocolli sono stati utilizzati con successo, l'attuabilità delle cellule ottenuti di spermatozoi scongelati crioconservati con DMSO è inferiore con metanolo 20,21. Inoltre, sperma di Anguilla è attivato il contatto con DMSO e richiede per la manipolazione di sperma più noioso 19, pertanto il metanolo è un crioprotettore più adatto per gli spermatozoi di anguilla europea di DMSO.
Qui, il protocollo per la gestione ottima e trattamento ormonale dell'anguilla europea sarà descritto di seguito. Oltre a questo, il miglior protocollo di crioconservazione di spermatozoi anguilla europea usando il metanolo come crioprotettore e un protocollo per la valutazione della qualità dello sperma in questa specie sarà anche descritto.
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Protocol
Tutte le procedure per l'utilizzo di anguilla europea descritta in questo protocollo è sono approvate dal comitato di etica della sperimentazione animale presso la Universitat Politècnica de València, seguendo le leggi spagnole e regolamenti gli esperimenti di controllo e procedure sugli animali vivi.
1. pesce manutenzione
- Portare le anguille europee per una struttura di ricerca e metterli in un acquario di 200L con un sistema di ricircolo. Utilizzare termostati e refrigeratori per mantenere una temperatura costante di 20 ° C.
- Tenere i pesci in condizioni di oscurità per evitare lo stress22 e senza cibo durante l'esperimento.
- Tenere i pesci in acqua dolce durante i primi 3 giorni. Poi cambiare 1/3 dell'acqua e riempire con acqua di mare ogni giorno fino a raggiungere una salinità di 37.0 ± 0,3 g/L.
2. trattamento ormonale
Nota: Il trattamento ormonale consiste di iniezioni settimanali di gonadotropina corionica umana (hCG) in tutta l'intera durata (nove settimane) dell'esperimento.
- Preparare l'ormone hCG in anticipo ad una concentrazione di 1 IU / µ l diluendo l'ormone in soluzione fisiologica (0,9% NaCl).
Nota: L'ormone possa essere conservato diluiti a questa concentrazione per più di una settimana a-18 ° C. - Per anestetizzare il pesce, preparare un secchio flessibile 40 L con 5 L di acqua dell'impianto.
- In un pallone da 250 mL, diluire 300 mg di benzocaina in 100 mL di etanolo al 70%.
- Versare la benzocaina diluito nel secchio (concentrazione finale 0,36 mM) e mescolare bene. Questo è per una concentrazione finale di benzocaina di 60 mg/L.
- Trasferire il pesce, individualmente, in acqua con benzocaina e attendere alcuni secondi fino a quando la benzocaina ha effetto e il pesce è adeguatamente anestetizzato.
Nota: Per confermare che il pesce è anestetizzato, mettere il pesce in una posizione supina e controllare che rimanga ancora in quella posizione.
- Per amministrare l'ormone, pesare il pesce e preparare l'ormone hCG alla dose di 1,5 UI/g di pesce, in un tubo di plastica da 1,5 mL.
- Riempire una siringa da 1 mL con l'ormone hCG dal tubo di plastica.
- Mettere il pesce anestetizzato in posizione supina e con l'assistenza o la siringa, iniettare l'ormone attentamente in zona intraperitoneale.
- Restituire il pesce per acquari e monitorare fino a che completamente ha recuperato.
Nota: L'amministrazione ormonale deve essere condotta settimanale in tutto l'esperimento. Normalmente, anguille europee iniziano spermating dopo 6-7 settimane di trattamento ormonale.
3. prelievi di sperma
- Per ottenere i migliori campioni di qualità, estrarre spermatozoi 24 h dopo la somministrazione ormonale6,23.
- Anestetizzare il pesce con benzocaina come descritto al punto 2.2.
- Mettere il pesce anestetizzato in posizione supina, pulire la zona genitale con uno spruzzo di acqua distillata e asciugare accuratamente con carta, per evitare la contaminazione di feci presenti nella zona genitale o attivazione accidentale dello sperma dal contatto con acqua di mare dal aquaria.
- Posizionando le dita su entrambi i lati laterali del pesce, massaggiare accuratamente premendo lateralmente da pinne pettorali alla zona genitale per forzare lo sperma fuori.
- Ripetere il massaggio fino a quando non più sperma esce dall'apertura genitale.
- Raccogliere lo sperma in tubi di plastica da 15 mL utilizzando una pompa a vuoto.
- Diluire lo spermatozoi estratti 01:10 in modificato Tanaka´s extender soluzione24 (137 mM NaCl, 76,2 mM NaHCO3, in acqua distillata) a 4 ° c.
Nota: Lo sperma nella soluzione extender deve essere mantenuto a 4 ° c.
4. valutazione della qualità sperma
- Preparare acqua di mare artificiale13 (in mM: NaCl 354,7, MgCl2 52,4, CaCl2 9,9, Na2SO4 28.2, KCl 9.4, in acqua distillata) con 2% albumina di siero bovino (BSA) (corrispondente), regolare il pH a 8.2, osmolalità a 1100 mOsm/kg e mantenere e ' a 4 ° c per evitare la crescita batterica.
- Aprire il software per l'analisi computerizzata dello sperma (CASA) e selezionare il modulo di sperma di pesce.
- Fare clic su Proprietà per aprire la configurazione di sistema del software. Lì, è possibile impostare le opzioni di cattura 60 immagini al secondo. Ottica di selezionare fase negativa, camera di Makler e scala X 10.
- Quindi i valori di analisi, selezionare pesce come specie e zona di particelle più grandi di 2 µm2 e più piccoli di 20 µm2.
- Ai parametri di velocità, impostata su lento quando le cellule spostare tra 10 e 45 µm/s, impostato su medio , quando si spostano tra 45 e 100 µm/s e impostare rapidamente quando si muove più velocemente di 100 µm/s.
Nota: Gli spermatozoi con velocità più lenta di 10 µm/s sono stati considerati immotile. - Selezionare i valori progressivi come 80% di rettilineità (STR) e salvare le proprietà.
- Fare clic sul Campo Capture (si aprirà una finestra con le immagini live dalla fotocamera).
Nota: Il sistema di analisi computerizzata dello sperma è formato da un microscopio, una telecamera e un software di analisi di immagine.
- Sulla camera di conteggio, mettere 4 µ l di acqua di mare artificiale e 0,5 µ l di soluzione di sperma (sperma diluito in soluzione extender).
- Mettere a fuoco l'immagine con il microscopio a ingrandimento 10x in fase negativa. 15 s dopo l'attivazione, fare clic su Capture - dal video del software di analisi computerizzata dello sperma.
- Analizzare ogni campione in triplice copia e selezionare campioni con una motilità superiore al 70% per la crioconservazione.
Nota: È molto importante selezionare solo alta qualità sperma per il successo di questo protocollo di crioconservazione.
5. metodo di congelamento di spermatozoi
- Preparare in anticipo liquido azoto (circa 2,5 litri) in un 34 cm x 34 cm x 30 cm e scatola di polistirolo spessa 5 cm.
Nota: Mantenere un livello di azoto liquido di 4-5 cm di altezza in ogni momento.- Costruire una struttura galleggiante per pre-congelare lo sperma. Utilizzare 2 pezzi di polistirolo (20 x 5 cm), li legano con 2 tubi di plastica e posizionare la struttura sull'azoto liquido. Questa struttura deve galleggiare sopra l'azoto liquido ad un'altezza approssimativa di 3 cm sopra la superficie (Figura 1).
Figura 1 . Disegno della struttura galleggiante utilizzata per pre-congelamento sopra azoto liquido schematico. La struttura è composta da due pezzi di bassa densità polistirolo di 20 cm x 4 cm x 5 cm collegato con tubi di plastica di 14 cm. Le cannucce sono disposti sopra i tubi in plastica a 3 cm sopra l'azoto liquido. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Preparare la soluzione di crioconservazione dello sperma, la soluzione di estensione e metanolo al rapporto di 1:8:1 a 1,5 mL in plastica tubi e mescolare delicatamente.
- Con l'aiuto di una pipetta, aggiungere 480 µ l della soluzione crioconservazione in 500 cannucce µ l e se necessario, li segnano chiudendo un'estremità con argilla da modellare.
- Mettere la paglia sul dispositivo mobile ad un'altezza di 3 cm sopra l'azoto liquido per 3 min. Quindi, inserire la cannuccia nell'azoto liquido.
- Dopo 10-15 minuti, trasferire le cannucce in un serbatoio di stoccaggio di azoto liquido utilizzando pinze lunghe e tenerli immersi in azoto liquido a tutte le ore. Qui, gli spermatozoi possono essere conservati a tempo indeterminato.
6. metodo di scongelamento
- Preparare una scatola di polistirolo con azoto liquido, come descritto al punto 5.1 e preparare un bagno di acqua utilizzando un becher da 3 litri con rubinetto acqua a 40 ° c.
- Trasferire le cannucce con sperma congelato dal serbatoio di deposito nella scatola di polistirolo con azoto liquido utilizzando pinze lunghe.
- Mettere ogni paglia in un bagno di acqua a 40 ° c per 13 s.
- Versare lo sperma in un tubo di plastica da 1,5 mL tagliando le estremità chiuse della paglia con le forbici.
- Analizzare la motilità dello sperma usando il sistema di analisi computerizzata dello sperma come spiegato al punto 4.1.
- Tenere 100 µ l di sperma per analizzare la vitalità degli spermatozoi con un citometro a flusso.
7. flusso Cytometry
- Utilizzare un kit fluorescente contenente ioduro di propidio (PI), che è un composto fluorescente rosso che colora i nuclei delle cellule morte e un composto fluorescente nucleare membrana-permeante, che verdi macchie i nuclei delle cellule viventi.
- Preparare la soluzione di colorante fluorescente verde diluendo dalla soluzione di riserva (1 mM) 01:10 in mezzo Tanaka´s a una soluzione di lavoro di 100 µM.
- Non diluire la soluzione PI. La soluzione di riserva è a 2,4 mM.
- Per ogni campione, prendere 50 µ l di spermatozoi freschi o scongelati e 0,5 µ l di verde fluorescente macchiatura soluzione di lavoro (concentrazione finale di 1 µM) e 2 µ l di soluzione di PI (concentrazione finale 100 µM).
- Incubare i campioni contenenti i coloranti (PI e colorazione fluorescente verde) al buio per 5 min.
- Diluire i campioni in 500 µ l di soluzione di estensione Tanaka´s e analizzare con il citometro a flusso.
- Accendere il citometro a flusso e creare un nuovo protocollo contenente almeno 2 appezzamenti: SS log log vs FS e FL1 vs FL3.
Nota: Entrambi, verde fluorescente macchiatura e propidio ioduro di possa essere eccitato con luce di lunghezza d'onda visibile. Quando è associato al DNA, l'emissione di fluorescenza massima di questi coloranti sono 516 nm e 617 nm, rispettivamente.- Regolare le tensioni dei laser diversi: SS = 199; FS = 199; FL1 = 377; FL3 = 372
- Impostare l'accordo di impostazioni di acquisizione per numero massimo di eventi = 5000 o 15 s (la concentrazione finale del campione dovrebbe essere di circa 1 milione di cellule/mL). Leggere l'esempio utilizzando un flusso basso .
- Selezionare la modalità di lettura singolo tubo posizione modalità fissata.
- Mettere il campione del numero giusto del carosello
- Leggere il campione (premendo F9) e salvare i dati raccolti in un file di excel (premendo F7) per ulteriori analisi.
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Representative Results
Sperma da 18 anguille con una motilità dello sperma del 70% o superiore, è stato selezionato per questo studio. I risultati hanno mostrato una riduzione in tutti i parametri di qualità dopo lo scongelamento rispetto a quelli da sperma fresco (tabella 1 e Figura 2). I risultati di motilità (media ± s.e.m., n = 18) hanno mostrato una maggiore motilità totale e una motilità progressiva nello sperma fresco rispetto alla motilità totale e la motilità progressiva trovato nei campioni degli spermatozoi post-scongelamento.
Lo stesso modello è stato trovato nell'analisi della veloce delle cellule dello sperma, dove campioni congelati ha presentato un rapporto più basso delle cellule veloce che campioni freschi. Inoltre, le cellule di sperma velocità misurate inoltre sono stati ridotti nei campioni dopo scongelamento.
Inoltre, risultati hanno mostrato che la vitalità cellulare dopo lo scongelamento ha presentato una riduzione diretta delle cellule dello sperma di 23 ± 3,1% (media ± s.e.m., n = 18) da campioni freschi di congelati (tabella 1 e Figura 2).
Figura 2 . Motilità, velocità curvilinea e dati di attuabilità delle cellule di sperma fresco e spermatozoi scongelati (dopo crioconservazione). Lo sperma era crioconservato per 24 h prima di essere scongelati. I valori presentati sono mezzi ± s.e.m. di sperma da 18 campioni. Gli asterischi indicano differenze significative tra i campioni scongelati e freschi (test t; p < 0,05). La motilità del parametro indicato la percentuale degli spermatozoi mobili totale, curvilinee velocità la velocità media degli spermatozoi lungo una traiettoria curvilinea ed attuabilità delle cellule indicato la percentuale di spermatozoi vivi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Veloce + medie cellule1 (%) | 70,7 ± 2.8 | 2.1 * 27,5 ± |
| Velocità curvilinea (VCL; µm/s) | 118,8 ± 2.8 | 101,5 ± 1.8 * |
| Velocità di linea retta (VSL; µm/s) | 53,3 ± 1,9 | 45.6 ± 1.3 |
| Velocità di percorso medio (VAP; µm/s) | 73,3 ± 2.1 | 62,0 ± 1.3 |
| Battendo Croce frequenza (Hz) | 27,9 ± 0,3 | 27,1 ± 0.6 |
| Vitalità cellulare (% di cellule vive) | 97,7 ± 0,3 | 73,8 ± 2.8* |
| 1 Cellule che mostrano velocità curvilinea superiore a 40 µm/s. | ||
Tabella 1. Riepilogo dei risultati dei diversi parametri analizzati con sistema di analisi computerizzata dello sperma dai campioni freschi o decongelati. Campioni scongelati sono stati precedentemente crioconservati per 24 h. Tutti i valori presentati come media ± s.e.m. (n = 18). Gli asterischi indicano differenze significative tra i campioni scongelati e freschi (test t; p < 0,05). I parametri analizzati sono stati: spermatozoi mobili, definiti come la percentuale di cellule motili totali; motilità progressiva definita come percentuale di spermatozoi che nuotare in avanti in una linea retta essenzialmente; veloce e medie cellule definite come percentuale di spermatozoi con una velocità media di curvilinea sopra 40 µm/s; curvilineo velocità definita come velocità media di uno spermatozoo attraverso la sua traiettoria curvilinea; velocità di linea retta definita come velocità media di uno spermatozoo misurata dalla prima posizione rilevata nella sua ultima posizione in linea retta; velocità di medio percorso definito come velocità media di uno spermatozoo lungo la sua traiettoria media spaziale; battendo la croce frequenza definita come il tasso medio a cui la traiettoria di testa curvilinee sperma attraversa la traiettoria del percorso medio; vitalità cellulare, definita come percentuale di spermatozoi vivi.
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Discussion
Questo protocollo descrive il processo completo per la crioconservazione di spermatozoi, la manipolazione e la maturazione di anguilla europea. Le condizioni di allevamento descritte qui sono ottimale per la produzione di elevati volumi di alta qualità dello sperma in questo specie 6,7,25e veloce maturazione. Il successo di questo protocollo di crioconservazione e suo uso potenziale per fertilizzazione dopo lo scongelamento dipendono in larga misura la qualità di sperma fresco 26. Di conseguenza, la selezione della qualità dello sperma è di grande importanza. Si noti che la valutazione della qualità soggettiva dello sperma dipende l'abilità, la percezione e la formazione del ricercatore che valuta i campioni 5,27,28 e può portare a stime di qualità molto diversa a seconda il ricercatore 29. Pertanto, l'uso di analisi computerizzata dello sperma è altamente consigliato per selezionare i migliori campioni di qualità per la crioconservazione.
Risultati di qualità dello sperma post-scongelamento presentato qui ha mostrati una riduzione nei parametri di motilità, la velocità e la sopravvivenza delle cellule. Ciò è coerente con la bibliografia disponibile, anche se esistono grandi differenze tra specie 26,30. Per esempio, in uno studio con salmone atlantico (Salmo salar), lo sperma fresco con una motilità del 70-95% è stato congelato utilizzando diversi crioprotettori (DMSO e metanolo). La motilità degli spermatozoi dopo lo scongelamento era significativamente più bassa in campioni freschi, con valori di motilità nel miglior protocollo dell'8,2%, ancora tasso di fertilizzazione usando lo sperma scongelato era alto come 42,8%, che rappresentavano il 95% del controllo (sperma fresco) 31. In uno studio differente con lo sperma di ippoglosso atlantico (Hippoglossus hippoglossus), è stata trovata alcuna significativa riduzione della motilità spermatica dopo crioconservazione e tasso di fertilizzazione usando lo sperma scongelato era oltre 95% 32.
In anguilla europea, studi precedenti inoltre ha mostrato una riduzione della motilità spermatica dopo crioconservazione indipendentemente il crioprotettore usato 16,18. Inoltre, spermatozoi crioconservati da anguilla europea di qualità simile sono stato utilizzato con successo per fertilizzazione 8. In quello studio, Asturiano et al utilizzato DMSO come il crioprotettore. L'uso di DMSO ha alcuni svantaggi di manipolazione poiché questo crioprotettore attiva lo sperma e deve pertanto essere congelati immediatamente dopo l'aggiunta di DMSO. Inoltre, inseminazione con sperma scongelato deve essere condotto immediatamente dopo lo scongelamento. La diminuzione del pH dello sperma può risolvere parzialmente questo problema 19, ma il protocollo è più delicato rispetto al protocollo presentato qui con metanolo come crioprotettore.
Diversi studi hanno mostrato risultati positivi usando il metanolo come il crioprotettore. Per esempio, in uno studio condotto con anguilla giapponese (japonica di Anguilla) utilizza un protocollo molto simile a quello presentato qui, con 10% metanolo come crioprotettore, gli autori hanno fertilizzato con successo uova usando lo sperma fresco e crioconservato. In questo studio, sono ottenuti tassi di fertilizzazione del 17% con nessuna differenza significativa tra spermatozoi freschi e crioconservati 33.
Il protocollo presentato qui ha dimostrato di mantenere sufficiente qualità dello sperma dopo lo scongelamento e mostrano caratteristiche simili di sperma dopo lo scongelamento rispetto ai protocolli utilizzando diversi dispositivi Extender e crioprotettori, ma con i vantaggi di facile manipolazione pre- e Post-crioconservazione. È molto importante seguire con precisione il raffreddamento e lo scongelamento volte descritti qui così come usando lo sperma di alta qualità. Negli studi futuri, prove di fertilizzazione saranno testate usando questo protocollo.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questa pubblicazione è stata finanziata dalla ricerca Orizzonte 2020 dell'Unione europea e l'innovazione del programma nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Sklodowska-Curie No 642893 (IMPRESS), l'ufficio di costo (COST Action FA 1205, AQUAGAMETE) e il centro di ricerca di eccellenza- 1476-4/2016/FEKUT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 | AQUACEN | 3394ESP | Benzocaine |
| NaCl | Avantor | 3624-19 | |
| Syringe | BD Plastipak | 305501 | Syringe 1 mL |
| FC500 | Beckman Coulter | Flow cytometer | |
| Air pump 100 | EHEIM | 4011708370032 | Modified for suction |
| Eppendorf 1.5 | Eppendorf | 175508 | Plastic tubes 1.5 mL |
| Falcon tubes | Falcon | 175747 | Plastic tubes 15 mL |
| Flexible bucket | Fiel | 1040101 | 40 L, Black color. |
| Ethanol | Guinama SL | Mg96270 | |
| Cyopreservation straws | IMV Technologies | 14550 | 500 µL straws |
| Live/Dead Sperm Viability Kit | Invitrogen | L7011 | Cytometer Kit |
| Modelling clay | JOVI | Art 30 | 4 different colors |
| Precision scale PCB | KERN & Sohn GmbH | PCB35002 | Digital scale |
| Saline solution Vitulia 0.9% | Laboratorios Ern, S.A. | C.N. 999790.8 | Saline solution |
| Forceps | Levantina de Lab. SL | 3710025 | 30 cm metal forceps |
| Scissors | Levantina de Lab. SL | 3700014 | Scissors 14cm |
| Ovitrelle (r-hCG) | Merck SL | EMEA/H/C/000320 | Human chorionic gonadotropin |
| Nikon Eclipse 80i | Nikon | Microscope | |
| CaCl2 | Panreac Quimica SAU | 2112211210 | |
| Na2SO4 | Panreac Quimica SAU | 3257091611 | |
| NaHCO3 | Panreac Quimica SAU | 1416381210 | |
| 782M Camera | Proiser | 782M | Camera for CASA |
| ISAS v1 | Proiser | ISAS v1 | CASA software |
| SpermTrack-10 | Proiser | SpermTrack-10 | Countig chamber for CASA |
| Beaker Pyrex 3L | PYREX | 2110668 | Glass beaker 3L |
| Flask Pyrex 250 GL-45 | PYREX | 21801365 | Glass flask 250 mL |
| KCl | Scharlab SL | PO02000500 | |
| Methanol | Scharlab SL | ME03061000 | |
| MgCl2 | Scharlab SL | MA00370500 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 05482 | Bovine serum albumina |
| Styrofoam box | 34x34x30 cm and 5cm thick |
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